抗体鉴定方法、多肽组合物、试剂盒及其制备方法和应用

本分案申请是基于申请号为2022109111199、申请日为2022年07月29日、发明名称为“抗体鉴定方法、多肽组合物、试剂盒及其制备方法和应用”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及一种抗体鉴定方法、多肽组合物、试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

异常过度磷酸化Tau蛋白(p-Tau)形成的神经细胞内神经原纤维缠结是阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病理特征之一。免疫学检测p-Tau是目前辅助诊断AD应用较为广泛的一种方法，其中使用的p-Tau抗体对磷酸化位点的特异性至关重要。

目前针对识别磷酸化位点的抗体的筛选鉴定方法中，需要根据推测的潜在的磷酸化位点，合成该位点定点磷酸化的多肽，以及其相应的该位点未磷酸化的多肽，两类多肽分别与待鉴定抗体反应，再降低有交叉反应的多肽浓度，得到反应性最强的多肽，判断为该抗体识别的磷酸化主要位点。因此，如何简化磷酸化位点的抗体的筛选鉴定方法是目前亟需解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种多肽组合物，该组合物可以用于鉴定抗体能否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点，缓解了现有技术中存在的筛选识别Tau蛋白的第217的抗体过程复杂的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种使用上述多肽组合物鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点的方法。

本发明的第三目的在于提供一种包含上述多肽组合物的试剂盒、试剂盒的应用以及试剂盒的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于抗体鉴定的多肽组合物，所述鉴定包括鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点，所述多肽组合物包括四条鉴定多肽，所述四条鉴定多肽分别为：

第一鉴定多肽为基本多肽中只有Tau蛋白的第217位磷酸化的多肽；

第二鉴定多肽为基本多肽中无任何位点磷酸化的多肽；

第三鉴定多肽为基本多肽中Tau蛋白的第217位和潜在的磷酸化位点均磷酸化的多肽；

第四鉴定多肽为基本多肽中Tau蛋白的第217位未磷酸化，同时潜在的磷酸化位点磷酸化的多肽；

所述基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第5～7个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第5～7个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；

所述潜在的磷酸化位点为：Tau蛋白的第217位氮端侧和碳端侧，分别与Tau蛋白的第217位相邻的第一个苏氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗体鉴定方法，其中鉴定包括鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点；所述抗体鉴定方法包括：将待鉴定的抗体分别与四条鉴定多肽反应，检测结果同时满足(Ⅰ)～(Ⅲ)，则判定待鉴定的抗体是特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点的抗体：

(Ⅰ)待鉴定的抗体与第一鉴定多肽和第三鉴定多肽反应为阳性；

(Ⅱ)待鉴定的抗体与第二鉴定多肽反应为阴性；

(Ⅲ)待鉴定的抗体与第四鉴定多肽反应为阴性或弱阳性；

所述四条鉴定多肽为上述多肽组合物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的用于抗体鉴定的多肽组合物能够有效的判断待鉴定的抗体能否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点，特异性良好的识别上述目标磷酸化位点的抗体应具备以下特征：

(1)识别Tau蛋白的第217位氨基酸磷酸化的多肽；(2)不识别Tau蛋白的第217位氨基酸未磷酸化的多肽，(3)Tau蛋白的第217位氨基酸相邻的T(苏氨酸残基)或S(丝氨酸残基)或Y(酪氨酸残基)的磷酸化不影响识别Tau蛋白的第217位氨基酸磷酸化的序列；(4)不和相邻的磷酸化T、S、Y有交叉反应，或和相邻的磷酸化T、S、Y有较弱交叉反应。满足这个特性的抗体识别的序列应在Tau蛋白的第217位氨基酸相邻潜在磷酸化氨基酸(T或S或Y)之间。

本发明依据上述规则设计的四条鉴定多肽能够有效的判断待鉴定的抗体能否特异性识别目标磷酸化位点，本发明通过实验验证了上述四条多肽能够筛选出特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点的抗体，并且由于第四鉴定多肽的存在，本发明提供的多肽组合物还能筛选出可能与Tau蛋白其他磷酸化位点产生非特异性反应的抗体，从而将其排除，在鉴定抗体是否特异性识别目标磷酸化位点的方法中第四条鉴定序列是必不可少的。

本发明提供的抗体鉴定方法操作简单，只需合成四条鉴定多肽，然后通过待检测抗体分别与四条鉴定多肽反应后的检测结果来判断待检测抗体对Tau蛋白的第217位磷酸化位点的特异性识别能力，该抗体鉴定方法简单有效。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于抗体鉴定的多肽组合物，所述鉴定包括鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点，所述多肽组合物包括四条鉴定多肽，所述四条鉴定多肽分别为：

第一鉴定多肽为基本多肽中只有Tau蛋白的第217位磷酸化的多肽；

第二鉴定多肽为基本多肽中无任何位点磷酸化的多肽；

第三鉴定多肽为基本多肽中Tau蛋白的第217位和潜在的磷酸化位点均磷酸化的多肽；

第四鉴定多肽为基本多肽中Tau蛋白的第217位未磷酸化，同时潜在的磷酸化位点磷酸化的多肽；

所述基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第5～7个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第5～7个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第210～212位为起始，第222～224位为终点的多肽。本发明中的基本多肽可以理解成，以Tau蛋白的第217位为中心，其氮端和碳端各有一个5～7个氨基酸残基组成的“臂”。

所述潜在的磷酸化位点为：Tau蛋白的第217位氮端侧和碳端侧，分别与Tau蛋白的第217相邻的第一个苏氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基。

在一些可选的实施方式中，所述基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第7个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第7个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第210位为起始，第227位为终点的多肽。

在一些可选的实施方式中，基本多肽为SRTPSLPTPPTREPK(Seq_14)，所述四条鉴定多肽的组成为：

所述第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_13所示：SRTPSLP{pTHR}PPTREPK；

所述第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_14所示：SRTPSLPTPPTREPK；

所述第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_15所示：SRTP{pSER}LP{pTHR}PP{pTHR}REPK；

所述第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_16所示：SRTP{pSER}LPTPP{pTHR}REPK。

在一些可选的实施方式中，所述基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第6个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第6个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第211位为起始，第223位为终点的多肽。

在一些可选的实施方式中，基本多肽为RTPSLPTPPTREP(Seq_18)，所述四条鉴定多肽的组成为：

所述第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_17所示：RTPSLP{pTHR}PPTREP；

所述第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_18所示：RTPSLPTPPTREP；

所述第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_19所示：RTP{pSER}LP{pTHR}PP{pTHR}REP；

所述第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_20所示：RTP{pSER}LPTPP{pTHR}REP。

在一些可选的实施方式中，所述基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第5个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第5个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第212位为起始，第222位为终点的多肽。

在一些可选的实施方式中，基本多肽为TPSLPTPPTRE(Seq_22)，所述四条鉴定多肽的组成为：

所述第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_21所示：TPSLP{pTHR}PPTRE；

所述第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_22所示：TPSLPTPPTRE；

所述第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_23所示：TP{pSER}LP{pTHR}PP{pTHR}RE；

所述第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_24所示：TP{pSER}LPTPP{pTHR}RE。

上述多肽中，{pTHR}指的是磷酸化的苏氨酸(T)残基；{pSER}指的是磷酸化的丝氨酸(S)残基。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗体鉴定方法，所述抗体鉴定方法用于鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点，所述抗体鉴定方法包括：将待鉴定的抗体分别与四条鉴定多肽反应，所述四条鉴定多肽为上述多肽组合物；若检测结果同时满足(Ⅰ)～(Ⅲ)，则判定待鉴定的抗体是特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点的抗体：

(Ⅰ)待鉴定的抗体与第一鉴定多肽和第三鉴定多肽反应为阳性；

(Ⅱ)待鉴定的抗体与第二鉴定多肽反应为阴性；

(Ⅲ)待鉴定的抗体与第四鉴定多肽反应为阴性或弱阳性。

本发明将待鉴定的抗体分别与四条鉴定多肽反应后的检测结果划分为“阳性”、“阴性”和“弱阳性”，“阳性”、“阴性”和“弱阳性”可以根据本领域一般的检测方法以及检测结果的一般判定标准设置；可根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明或标准文件中记载的方法来划分抗体和抗原反应后的检测结果，本发明对此不做限制；例如可以为但不限于为在化学反光酶联免疫法中以OD值界定阳性、阴性和弱阳性，或以全自动化学发光免疫分析仪的相对光子数(RLU)信号值来界定。

在一些可选的实施方式中，检测结果的值大于等于第一阈值为阳性，大于等于第二阈值且小于第一阈值为弱阳性，小于第二阈值为阴性。

在一些可选的实施方式中，采用酶联免疫的方法评价待测抗体和鉴定序列的结果；设置OD值大于等于第一阈值为阳性，OD值大于等于第二阈值且小于第一阈值为弱阳性，OD值小于第二阈值为阴性。

在一些可选的实施方式中，所述第一阈值为1，所述第二阈值为0.5。

在一些可选的实施方式中，当所述酶联免疫的方法中二抗标记辣根过氧化物酶，在波长450nm条件下检测OD值时，第一阈值为1，第二阈值为0.5。

并且，本发明通过实验筛选发现，在采用酶联免疫方法检测鉴定多肽和待测抗体的反应性时，四条鉴定序列的浓度分别独立的为0.03125～0.0625μg/mL时，具有较好的鉴定效果。当肽反应浓度过高，待测抗体容易与鉴定多肽的潜在的磷酸化位点发生非特异性反应；当肽反应浓度过低，由于参与反应的多肽含量太低，抗体和各多肽的反应也逐渐转为弱阳性或阴性。四条鉴定序列的浓度分别独立的例如可以为但不限于为0.03125、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06或0.0625μg/mL，且当四条鉴定序列的浓度分别独立的为0.03125μg/mL时，检测效果最佳。

在一些优选的实施方式中，所述抗体鉴定方法包括：

(a)使用包被缓冲液分别稀释四条鉴定多肽；所述包被缓冲液为pH为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(b)将稀释后的四条鉴定多肽分别加入酶标板孵育，洗板后封闭；

(c)使用PBS缓冲液把待测抗体稀释至0.5μg/mL，加入包被好的酶标板中，35～39℃孵育57～63min后洗板；

(d)加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1～2h，洗板；

(e)加入显色液室温反应5～10min，加终止液终止，检测OD450nm；当OD≥1时判读为阳性；当0.5≤OD＜1时，判读为弱阳性；当OD＜0.5时，判读为阴性。

在一些可选的实施方式中，所述四条鉴定多肽的组成为：第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_13所示；第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_14所示；第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_15；第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_16所示。

在一些可选的实施方式中，所述四条鉴定多肽的组成为：第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_17所示；第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_18所示；第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_19所示；第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_20所示。

在一些可选的实施方式中，所述四条鉴定多肽的组成为：第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_21所示；第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_22所示；第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_23所示；第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_24所示。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点的试剂盒，该试剂盒包含上述多肽组合物。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含的四条鉴定多肽的基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第7个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第7个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第210位为起始，第227位为终点的多肽。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含的第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_13所示；第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_14所示；第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_15所示；第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_16所示。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含的四条鉴定多肽的基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第6个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第6个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第211位为起始，第223位为终点的多肽。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含的第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_17所示；第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_18所示；第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_19所示；第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_20所示。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含的四条鉴定多肽的基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第5个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第5个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；即Tau蛋白的第212位为起始，第222位为终点的多肽。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含的第一鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_21所示；第二鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_22所示；第三鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_23所示；第四鉴定多肽的氨基酸序列如Seq_24所示。

本发明提供的用于抗体鉴定的试剂盒还可选地包含本领域可接受的其他的检测试剂或耗材，检测试剂的实例例如可以为但不限于为缓冲液，具体的实例例如可以但不限于Tris缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、Tricine缓冲液、TEA缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、酸钠-碳酸氢钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钾-盐酸缓冲液、PBS或PBST中的一种或多种；标记物，具体的实例例如可以但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、生物素、链霉亲和素或荧光标记中的一种或多种，带有上述标记物的抗体，检测抗原，固相载体，具体的实例例如可以但不限于磁性微粒、微孔反应板或硝酸纤维素膜；校准品、阴性对照或阳性对照。

在一些可选的实施方式中，多肽组合物中各鉴定多肽的浓度分别独立的为0.03125～0.0625μg/mL，四条鉴定序列的浓度分别独立的例如可以为但不限于为0.03125、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06或0.0625μg/mL，且当四条鉴定序列的浓度分别独立的为0.03125μg/mL时，检测效果最佳。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒为用于酶联免疫方法检测待测抗体与鉴定多肽反应结果的试剂盒。

在一些优选的实施方式中，所述用于酶联免疫方法检测待测抗体与鉴定多肽反应结果的试剂盒还包含pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠包被缓冲液、PBST缓冲液、酶标板、封闭液、辣根过氧化物酶标记的二抗，二抗优选羊抗鼠IgG、底物缓冲液和TMB显色液中的一种或多种。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述试剂盒在抗体鉴定中的应用，所述鉴定包括鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括按照如下规则设计并合成四条鉴定多肽：

第一鉴定多肽为基本多肽中只有Tau蛋白的第217位磷酸化的多肽；

第二鉴定多肽为基本多肽中无任何位点磷酸化的多肽；

第三鉴定多肽为基本多肽中Tau蛋白的第217位和潜在的磷酸化位点均磷酸化的多肽；

第四鉴定多肽为基本多肽中Tau蛋白的第217位未磷酸化，同时潜在的磷酸化位点磷酸化的多肽；

所述基本多肽由Tau蛋白的第217位氮端侧相邻的第5～7个氨基酸残基为起始，碳端侧相邻的第5～7个氨基酸残基为终点，以及之间的氨基酸残基组成的多肽；

所述潜在的磷酸化位点为：Tau蛋白的第217位氮端侧和碳端侧，分别与Tau蛋白的第217位相邻的第一个苏氨酸残基、丝氨酸残基或酪氨酸残基。

在一些可选的实施方式中，分别合成如下多肽组合物，以制备用于鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第217位磷酸化位点的试剂盒：

氨基酸序列分别如Seq_13～16所示的多肽；或，氨基酸序列分别如Seq_17～20所示的多肽；或，氨基酸序列分别如Seq_21～24所示的多肽。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

采用与本发明多肽组合物设计思路一致的用于鉴定抗体是否特异性识别Tau蛋白的第181磷酸化位点的多肽组合物，筛选多肽组合物的最适工作浓度，如实施例1～实施例4所示。

实施例1

本实施例提供了一种用于鉴定p-Tau181抗体的多肽组合物，包括四条鉴定多肽，鉴定多肽臂长7个氨基酸：

第一鉴定多肽：p-Tau181多肽-1，氨基酸序列为Seq_1：KTPPAPK{pTHR}PPSSGEP；

第二鉴定多肽：p-Tau181多肽-2，氨基酸序列为Seq_2：KTPPAPKTPPSSGEP；

第三鉴定多肽：p-Tau181多肽-3，氨基酸序列为Seq_3：K{pTHR}PPAPK{pTHR}PP{pSER}SGEP；

第四鉴定多肽：p-Tau181多肽-4，氨基酸序列为Seq_4：K{pTHR}PPAPKTPP{pSER}SGEP。

实施例2

本实施例提供了一种用于鉴定p-Tau181抗体的多肽组合物，包括四条鉴定多肽，鉴定多肽臂长6个氨基酸：

第一鉴定多肽：p-Tau181多肽-5，氨基酸序列为Seq_5：TPPAPK{pTHR}PPSSGE；

第二鉴定多肽：p-Tau181多肽-6，氨基酸序列为Seq_6：TPPAPKTPPSSGE；

第三鉴定多肽：p-Tau181多肽-7，氨基酸序列为Seq_7：{pTHR}PPAPK{pTHR}PP{pSER}SGE；

第四鉴定多肽：p-Tau181多肽-8，氨基酸序列为Seq_8：{pTHR}PPAPKTPP{pSER}SGE。

实施例3

本实施例提供了一种用于鉴定p-Tau181抗体的多肽组合物，包括四条鉴定多肽，鉴定多肽臂长5个氨基酸：

第一鉴定多肽：p-Tau181多肽-9，氨基酸序列为Seq_9：PPAPK{pTHR}PPSSG；

第二鉴定多肽：p-Tau181多肽-10，氨基酸序列为Seq_10：PPAPKTPPSSG；

第三鉴定多肽：p-Tau181多肽-11，氨基酸序列为Seq_11：PPAPK{pTHR}PP{pSER}SG；

第四鉴定多肽：p-Tau181多肽-12，氨基酸序列为Seq_12：PPAPKTPP{pSER}SG。

实施例4

验证抗体AT270的位点特异性：

p-Tau181抗体(Phospho-Tau(Thr181)Monoclonal Antibody(AT270)，厂家：Fujirebio，货号：90007)，已被文献鉴定为具有特异性识别Tau蛋白181位磷酸化苏氨酸的特性。Tau蛋白181位氨基酸磷酸化以及175位氨基酸磷酸化的多肽为较高浓度时，该抗体和两者均有阳性反应；随着多肽浓度的降低，该抗体对175位氨基酸磷酸化的多肽的反应信号下降得比181位氨基酸磷酸化的多肽的快，并且最终在一个低浓度时，与181位氨基酸磷酸化的多肽的反应信号为175位氨基酸磷酸化的多肽的18倍。

使用包被缓冲液(pH9.6，Na

将稀释好的鉴定序列多肽分别加入96孔酶标板中，每孔100μL，37℃孵育2h。使用PBST缓冲液洗板3遍，每遍60s，把板拍干。加入封闭液200μL/孔，37℃孵育2h，洗板后拍干。

使用PBS缓冲液把p-Tau181抗体(AT270)稀释至0.5μg/mL，加入包被好的发光板中，每孔100μL，37±2℃孵育60±3min，洗板后拍干。

加入HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1～2h，洗板后拍干。

底物缓冲液与底物液TMB进行1:1稀释，充分混匀后，加入每孔100μL，置于室温反应5～10min。每孔加终止液50μL，混匀，使用酶标仪读取各孔OD450nm值。OD≥1时，判读为阳性；0.5≤OD＜1时，判读为弱阳性；OD＜0.5时，判读为阴性。结果如表1～3所示。

表1实施例1多肽组合物分别与AT270抗体和p-Tau181抗体的反应性。

表2实施例2多肽组合物分别与AT270抗体和p-Tau181抗体的反应性。

表3实施例3多肽组合物分别与AT270抗体和p-Tau181抗体的反应性。

从抗体AT270和4条鉴定多肽(实施例1，臂长7)的检测结果来看，多肽包被浓度为0.125～2μg/mL时，由于多肽反应浓度过高，且抗体AT270对某些序列的磷酸化基团有一定的非特异性(如文献中报道其和175位氨基酸磷酸化的多肽有交叉反应)，所以和p-Tau181多肽-1、p-Tau181多肽-3、p-Tau181多肽-4均反应均为阳性，和p-Tau181多肽-2反应为阴性。

当多肽的包被浓度下降时，该抗体对p-Tau181多肽-4的反应信号下降得更快，在0.03125ug/mL浓度时，p-Tau181多肽-4是p-Tau181多肽-1，p-Tau181多肽-3信号的1/3。包被浓度小于0.03125ug/mL之后，由于参与反应的多肽含量太低，抗体和各多肽的反应也逐渐转为弱阳性(有较弱的交叉反应)或阴性(无交叉反应)。

上述结果表明出这个抗体虽然对磷酸基团有一定的非特异性，但其主要针对的是Tau蛋白181位磷酸化苏氨酸，和文献报道一致，此方法是有效的。

该抗体和臂长5(实施例3)和臂长6(实施例2)的4条鉴定多肽的反应情况和臂长7的类似。

实施例5

本实施例提供了一种用于鉴定p-Tau217抗体的多肽组合物，包括四条鉴定多肽，鉴定多肽臂长7个氨基酸：

第一鉴定多肽：p-Tau217多肽-1，氨基酸序列为Seq_13：SRTPSLP{pTHR}PPTREPK；

第二鉴定多肽：p-Tau217多肽-2，氨基酸序列为Seq_14：SRTPSLPTPPTREPK；

第三鉴定多肽：p-Tau217多肽-3，氨基酸序列为Seq_15：SRTP{pSER}LP{pTHR}PP{pTHR}REPK；

第四鉴定多肽：p-Tau217多肽-4，氨基酸序列为Seq_16：SRTP{pSER}LPTPP{pTHR}REPK。

实施例6

本实施例提供了一种用于鉴定p-Tau217抗体的多肽组合物，包括四条鉴定多肽，鉴定多肽臂长6个氨基酸：

第一鉴定多肽：p-Tau217多肽-5，氨基酸序列为Seq_17：RTPSLP{pTHR}PPTREP；

第二鉴定多肽：p-Tau217多肽-6，氨基酸序列为Seq_18：RTPSLPTPPTREP；

第三鉴定多肽：p-Tau217多肽-7，氨基酸序列为Seq_19：RTP{pSER}LP{pTHR}PP{pTHR}REP；

第四鉴定多肽：p-Tau217多肽-8，氨基酸序列为Seq_20：RTP{pSER}LPTPP{pTHR}REP。

实施例7

本实施例提供了一种用于鉴定p-Tau217抗体的多肽组合物，包括四条鉴定多肽，鉴定多肽臂长5个氨基酸：

第一鉴定多肽：p-Tau217多肽-9，氨基酸序列为Seq_21：TPSLP{pTHR}PPTRE；

第二鉴定多肽：p-Tau217多肽-10，氨基酸序列为Seq_22：TPSLPTPPTRE；

第三鉴定多肽：p-Tau217多肽-11，氨基酸序列为Seq_23：TP{pSER}LP{pTHR}PP{pTHR}RE；

第四鉴定多肽：p-Tau217多肽-12，氨基酸序列为Seq_24：TP{pSER}LPTPP{pTHR}RE。

实施例8

p-Tau217市售抗体的位点特异性验证：

使用CB缓冲液分别将p-Tau217 4条多肽分别梯度稀释至0.03125μg/mL。将稀释好的多肽分别加入96孔酶标板中，每孔100μL，37℃孵育2h。使用PBST缓冲液洗板3遍，每遍60s，把板拍干。加入封闭液200μL/孔，37℃孵育2h，洗板后拍干。

使用PBS缓冲液把p-Tau217抗体-1和p-Tau217抗体-2分别稀释至0.5g/mL，相应的加入包被好的发光板中，每孔100μL，37±2℃孵育60±3min，洗板后拍干。

加入HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1～2h，洗板后拍干。

底物缓冲液与底物液TMB进行1:1稀释，充分混匀后，加入每孔100μL，置于室温反应5-10min。每孔加终止液50μL，混匀，使用酶标仪读取各孔OD450nm值。OD≥1时，判读为阳性；0.5≤OD＜1时，判读为弱阳性；OD＜0.5时，判读为阴性。结果如表4～6所示。

表4 2个市售的p-Tau217抗体实施例4的反应性

表5 2个市售的p-Tau217抗体和实施例5的反应性

表6 2个市售的p-Tau217抗体和实施例6的反应性

p-Tau217的两个抗体(p-Tau217抗体-1、p-Tau217抗体-2)和p-Tau217多肽-1、p-Tau217多肽-5、p-Tau217多肽-9、p-Tau217多肽-3、p-Tau217多肽-7、p-Tau217多肽-11有的反应均呈阳性，和p-Tau217多肽-2、p-Tau217多肽-6、p-Tau217多肽-10、p-Tau217多肽-4、p-Tau217多肽-8、p-Tau217多肽-12的反应均呈阴性，符合筛选要求，是针对Tau蛋白217位的苏氨酸磷酸化的特异性抗体。

效果例1p-Tau抗体与抗原反应的特异性

从市面上购买到p-Tau181抗原3个、p-Tau217抗原1个、p-Tau231抗原1个和Tau抗原4个，这四种抗原序列及结构十分相似，仅是在181、217和231位氨基酸是否磷酸化上有所区别。使用符合筛选要求的p-Tau217抗体-1和p-Tau217抗体-2分别搭配总Tau抗体，采用双抗体夹心的化学发光免疫分析法和上述抗原进行反应。

p-Tau抗体与抗原其类似物的交叉反应性评价

(1)p-Tau抗体偶联甲苯磺酰基(Tysol)磁珠及工作液制备

将p-Tau217抗体-1和p-Tau217抗体-2分别和Tysol磁珠(JSR，MS160Tosylactivated10％)按照厂家说明书的方法进行偶联，得到10mg/mL的p-Tau抗体磁珠偶联物的母液。

配置pH为7.4，浓度为0.05M的Tris缓冲液，所述缓冲液中含有5mg/mL、9mg/mLNaCl

(2)碱性磷酸酶(AP酶)标记总Tau抗体及工作液制备

委托珠海丽禾医疗诊断产品有限公司对总Tau抗体进行AP酶的标记，得到0.5mg/mL的总Tau抗体AP酶标记物的母液。

配置pH为6.5，浓度为0.1M的MES缓冲液，所述缓冲液中含有1mM MgCl

(3)抗原配制

配制pH为7.0，浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液中含有9mg/mL NaCl

(4)上机测试

使用深圳迎凯科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪shine i2900。

仪器吸取样本50μL，加入50μL p-Tau抗体磁珠偶联物工作液和50μL总Tau抗体AP酶标记物工作液；37℃温育5min；温育后磁分离去吸除上清液，清洗三次；加入底物液，读取信号值。梯度稀释的抗原能得到有梯度的相对光子数(RLU)信号，且最高RLU≥100000时，表明抗体能识别抗原。

结果如表7所示：

表7p-Tau抗体与抗原及类似物的反应性

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p-Tau217抗体-1、p-Tau217抗体-2和1个p-Tau217抗原反应时，均出现随浓度梯度变化的信号，且最高RLU都大于100000，表明p-Tau217抗体-1、p-Tau217抗体-2均能识别p-Tau217抗原。p-Tau217抗体-1、p-Tau217抗体-2和4个Tau抗原、3个p-Tau181抗原、1个p-Tau231抗原反应时，所有浓度的抗原测得的RLU均无梯度且小于2000，表明p-Tau217抗体-1、p-Tau217抗体-2不识别Tau抗原、p-Tau181抗原和p-Tau231抗原。综上所述，p-Tau217抗体-1、p-Tau217抗体-2特异性识别p-Tau217抗原，与类似抗原无交叉反应。

上述结果说明，通过和4条多肽鉴定的反应性评价，在实施例8中筛选出来的磷酸化位点特异性抗体，只识别目标位点磷酸化的抗原，和序列及结构等特征十分相似抗原均无交叉反应。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。