一株木霉属微生物转化菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物研究技术领域，具体涉及一株具有磺胺类抗生素转化作用的海洋木霉属微生物转化菌株及其应用。

背景技术

磺胺类抗生素(SAs)作为一种用于人类、动物或植物中具有抗菌或抗寄生活性的特殊抗菌剂，在治疗或预防人类疾病或用于家畜养殖、水产养殖、动植物病害防治等方面具有重要作用，因其高效、抑菌、价格低、方便购买以及临床应用等原因被各国各行业大量而频繁地使用，但也因此负面影响也不断暴露。抗生素的滥用和过度使用刺激了细菌进化和耐药性的传播，对生态环境造成不可忽视的影响。世界上许多河流沉积物、地下水和土壤中，可检出的SAs多达十几种。例如，磺胺甲恶唑(SMX)作为SAs的典型代表，在相当低的浓度范围内，仍可能对水生生物构成生态毒性风险，进而对人类健康带来潜在危害。

木霉属(Trichoderma)真菌分布广泛且种类多样，具有多种重要的生态功能，能向细胞外代谢分泌复合的酶系统，这些复合的酶系统包含几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶等，可用于生物转化，具有环保、高效和专一的特点。

本发明从海洋来源木霉属真菌中获得了一株对磺胺类抗生素具有转化功能的菌株，为磺胺的转化过程提供新的微生物来源，推动海洋微生物菌株对环境中磺胺类抗生素残留转化的应用。

发明内容

本发明提供了一株具有磺胺类抗生素转化作用的海洋木霉属微生物转化菌株及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一株木霉属微生物转化菌株，微生物转化菌株A-YMD-9-1为木霉属中的棘孢木霉Trichoderma asperellum，已于2022年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022674。

所述的转化菌株的应用，所述转化菌株在转化磺胺类抗生素中的应用。

所述转化菌株在转化磺胺甲恶唑中的应用。

一种转化磺胺类抗生素制剂，含所述的菌株。

所述制剂含有该菌株的发酵培养物、培养物悬液或发酵液。

所述发酵培养物将权利要求1所述菌株进行活化，活化后接入至液体真菌培养基中培养，培养产物添加至含磺胺类抗生素的液体真菌培养基中发酵培养，即得发酵培养物。

进一步的说，

1)将棘孢木霉(Trichoderma asperelloides)A-YMD-9-1菌株接种于PDA固体培养基中，在28℃活化5-7d，制得活化菌株；

2)将步骤1)制得的活化菌株接种至液体真菌培养基中，即种子培养液，在25℃的条件下培养4-5d；

3)将步骤2)所得种子培养液接种在添加磺胺甲恶唑(SMX)的液体真菌培养基，保证接种量在9-10％，25℃的条件下培养21d。

4)用适量的乙酸乙酯灭菌48h，抽滤。发酵液采用分液漏斗萃取有机相，40℃减压蒸馏得到发酵培养物粗提物。

所述磺胺类抗生素为磺胺甲恶唑(SMX)。

所述制剂在转化磺胺类抗生素中降低抗生素抗菌活性、生物毒性的应用中。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

目前已报道的菌株中大部分对高浓度磺胺类抗生素耐受能力较差，转化效率较低，并缺乏对转化后代谢产物结构及其抗菌活性和生物毒性的研究。本发明中的菌株A-YMD-9-1可以转化磺胺类抗生素，且转化产物大大降低磺胺类抗生素的抗菌能力和生物毒性作用，为环境中磺胺类抗生素的去除提供了优良转化菌株。

具体涉及菌株A-YMD-9-1，经检测本发明菌株能够将底物磺胺类抗生素进行生物转化。

附图说明

图1为本发明实施例提供的棘孢木霉A-YMD-9-1的菌落图；

图2为本发明实施例提供的棘孢木霉A-YMD-9-1的分生孢子图；

图3为本发明实施例提供的棘孢木霉A-YMD-9-1转化磺胺甲恶唑的转化粗提物及其对照的高效液相色谱图；其中，对照1：未添加磺胺甲恶唑，仅为菌株自身空白对照；对照2：未添加菌株，仅为磺胺甲恶唑空白对照；转化粗提物：为含200mg/L磺胺甲恶唑发酵培养所得粗提物；

图4为本发明实施例提供的杜氏盐藻及三角褐指藻生物量与吸光系数的线性关系图。

具体实施方式：

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明所附图式所绘制的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解和阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，在任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

本发明的高效液相色谱(HPLC)测定方法包括：高效液相色谱定量分析代谢产物。Poroshell 120色谱柱(4μm,4.6×150mm)，流动相为：水/乙腈(85/15，v/v)梯度洗脱，流速为1.000mL/min，时间为40min，进样量10μL。

本发明所述磺胺类抗生素在下列实例中为磺胺甲恶唑。

所述细菌为海洋费氏弧菌(Vibrio fischeri)。

所述海洋微藻为杜氏盐藻(Dunaliella salina)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)。

PDA培养基：马铃薯浸粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L，氯霉素0.1g/L，pH值6～7；

液体真菌培养基：蛋白胨1.25g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，硫酸镁0.125g/L，pH值6～7；

2216E培养基：蛋白胨5.0g/L，酵母粉1.0g/L，柠檬酸铁0.1g/L，氯化钠19.45g/L，氯化镁5.98g/L，硫酸钠3.24g/L，氯化钙1.8g/L，氯化钾0.55g/L，碳酸钠0.16g/L，溴化钾0.08g/L，氯化锶0.034g/L，硼酸0.022g/L，硅酸钠0.004g/L，氟化钠0.0024g/L，硝酸铵0.0016g/L，磷酸氢二钠0.008g/L，pH值7～8；

f/2培养基：海水，硝酸钠74.8mg/L，磷酸二氢钠4.4mg/L，柠檬酸铁3.9mg/L，乙二胺四乙酸二钠4.35mg/L，九水合偏硅酸钠8.4mg/L(仅用于三角褐指藻)，维生素B

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

如未特别说明，本发明采用的设备均为本领域常规设备。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：转化菌株的菌种鉴定

一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)A-YMD-9-1，已于2022年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022674。所述棘孢木霉A-YMD-9-1从烟台海域采集的江蓠藻内部组织中分离得到，其菌落在PDA培养基上形态如图1所示，其分生孢子的显微图如图2所示。

发明所述棘孢木霉A-YMD-9-1的ITS(核糖体DNA内转录间隔区间)序列，如下所示：

GGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

根据菌株A-YMD-9-1的显微特征、分子实验所产生的ITS序列结果，菌株A-YMD-9-1的鉴定结果为棘孢木霉。

实施例2：A-YMD-9-1对磺胺类抗生素的转化作用

将活化菌株接种至液体真菌培养基中，在25℃的条件下培养4-5d，即为液体种子培养液；

而后按照10％的接种量(即20mL)接种到含有不同量磺胺甲恶唑10mg/L和200mg/L的液体真菌培养基中，每瓶200mL，每组设3个平行，于25℃避光培养21d，以不加菌和不加磺胺甲恶唑的液体真菌培养基分别作为空白对照，每组设3个平行。将所得培养液用适量乙酸乙酯灭菌48h后，通过抽滤方式过滤菌丝后，采用分液漏斗萃取有机相，40℃减压蒸馏得到发酵液粗提物。粗提物经色谱甲醇配制浓度为200mg/mL的溶液，并用0.22μm微膜过滤后通过高效液相色定量分析转化产物。

高效液相色谱分析方法：使用Poroshell 120色谱柱(4μm,4.6×150mm)分析10μL样品，样品浓度为200mg/mL，流动相为：水/乙腈(85/15，v/v)，流速保持每分钟1.0mL，梯度洗脱40min，于波长270nm处检测。

计算公式如下：

结果表明，添加A-YMD-9-1菌株的培养基中，磺胺甲恶唑的转化率分别为65.14％和21.25％，在较高浓度磺胺甲恶唑中A-YMD-9-1菌株同样具有一定的耐受能力和转化效率。

此外，经高效液相色谱检测，通过与磺胺甲恶唑空白对照以及未添加磺胺甲恶唑底物的真菌空白对照相比，发现除了添加的磺胺甲恶唑底物出现的吸收峰值外，在17-20min内出现非菌株自身代谢的物质吸收峰，即新的物质吸收峰，如图3所示。

实施例3：A-YMD-9-1菌株对磺胺类抗生素生物转化产物的抑菌实验具体为：

费氏弧菌冻干粉接活培养3代后，挑取一环费氏弧菌斜面培养物于50mL 2216E培养基(pH 6-8.5)中22℃、120r/min条件下摇瓶培养14-16h后经培养基稀释4-8倍，使用分光光度计进行测量，保证其OD

以上述实施获得转化粗提物用二甲基亚砜(DMSO)配制成10mg/mL的化合物溶液作为母液，取50μL母液加入950μL 2％氯化钠溶液中混合均匀，即为样品溶液。下述实验所用培养基均为2216E培养基。

取96孔板中分别加入：

实验一：80μL样品溶液、80μL 2.5倍培养基、40μL上述培养的费氏弧菌菌液，即为实验组；

实验二：80μL样品溶液、80μL 2.5倍培养基、40μL培养基，即为样品背景；

实验三：80μL 2％氯化钠、80μL 2.5倍培养基、40μL上述培养的费氏弧菌菌液，即为对照背景。每个实验组各3组平行，置于台式振荡器中光照震荡培养24h，培养条件为17℃。24h后取出96孔板置于酶标仪中测定OD

计算方法：

结果：根据以上计算结果，得出磺胺甲恶唑对费氏弧菌抑制率为49.36％，而转化菌株A-YMD-9-1以磺胺甲恶唑为底物转化后的产物对费氏弧菌抑制率为-38.53％，降低了87.89％。结果表明磺胺甲恶唑经菌株A-YMD-9-1转化后的抑菌活性降低。

实施例4：A-YMD-9-1菌株对磺胺类抗生素转化产物的微藻毒性实验

具体为：以上述实施获得转化粗提物用二甲基亚砜配制成5mg/mL的化合物溶液作为样品，活化供试微藻，取对数生长期的微藻，采用已灭菌的f/2培养基，稀释到约3-5×10

此前对杜氏盐藻和三角褐指藻进行全波段扫描，找到其最大吸收峰波长，然后将藻液梯度稀释，在其最大吸收峰处测量OD值，同时显微计数，进而得到两种藻生物量与吸光系数的线性关系(参见图4)。

结果：磺胺甲恶唑对三角褐指藻以及杜氏盐藻的致死率分别为22.15％和51.24％，而转化菌株A-YMD-9-1以磺胺甲恶唑为底物转化后的产物对三角褐指藻及杜氏盐藻的致死率与磺胺甲恶唑相比均有不同程度的降低，其中对三角褐指藻抑制率降低了32.05％，而对杜氏盐藻的抑制率降低格外明显，达到96.07％。

由上述可见，本发明中的棘孢木霉A-YMD-9-1对磺胺类抗生素具有一定转化能力，且能够降低磺胺类抗生素的抗菌作用和生物毒性。

上列实施例，对本发明的目的、技术方案等进行了进一步地详细说明，所应说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所发明的内容。