一种聚酮化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药化合物技术领域，具体涉及一种聚酮化合物及其制备方法与应用。

背景技术

CD4

Th9细胞是新定义的CD4

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一株台中曲霉菌SMU01。

本发明还提出一种含有上述菌株的产品。

本发明还提出一种聚酮化合物。

本发明还提出一种具有上述聚酮化合物的制备方法。

本发明还提出上述菌株、含有上述菌株的产品或上述聚酮化合物的应用。

在本发明的一个方面，提出了一株菌株，所述菌株为台中曲霉菌(Aspergillustaichungensis)SMU01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:62752，保藏日期为2022年08月30日。

在本发明的一些实施方式中，所述台中曲霉菌SMU01分离自美洲大蠊虫体。

在本发明的一些实施方式中，所述菌株具有SEQ ID NO：1所示的ITS序列。

在本发明的第二方面，提出了一种产品，包括(1)～(6)中至少的一种：

(1)上述菌株；

(2)含有上述菌株的菌剂；

(3)含有上述菌株的活菌液；

(4)含有上述菌株的死菌液；

(5)含有上述菌株的代谢产物；

(6)含有上述菌株的提取物。

在本发明的一些实施方式中，所述产品为药品或食品。

在本发明的一些实施方式中，所述药品还包括药用载体和/或药用辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述赋形剂包括水。

在本发明的一些实施方式中，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述黏合剂包括纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述湿润剂包括甘油。

在本发明的一些实施方式中，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述吸收促进剂包括季铵化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述表面活性剂包括十六烷醇。

在本发明的一些实施方式中，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。

根据本发明的第三方面，提出了一种聚酮化合物，所述聚酮化合物的结构式如下式(I)所示：

根据本发明的第四方面，提出了一种上述聚酮化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：将上述台中曲霉菌SMU01进行发酵培养得到发酵产物；将所述发酵产物进行提取得到提取物；将所述提取物进行分离纯化即得。

在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养包括将台中曲霉菌SMU01的种子液加入至发酵培养基中的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述台中曲霉菌SMU01的种子液的制备包括：将台中曲霉菌SMU01斜面菌种接种于固体培养基中活化，得到活化后的台中曲霉菌SMU01菌株，将所述活化后的菌株接种至液体培养基中，培养2～5d，得到种子液。

在本发明的一些实施方式中，所述活化后的菌株接种至液体培养基中的培养条件为转速100～350r/min，培养温度25～30℃。

在本发明的一些实施方式中，所述固体培养基包括适合真菌培养的培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述固体培养基包括PDA培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述液体培养基包括适合真菌培养的培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述液体培养基包括PDA液体培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养基的配方包括大米40～80g、葡萄糖0.1～0.4g、酵母提取物0.2～0.5g和H

在本发明的一些实施方式中，所述发酵的时间为20～36d。

在本发明的一些实施方式中，所述发酵的时间为24～30d。

在本发明的一些实施方式中，所述发酵的温度为24～32℃。

在本发明的一些实施方式中，所述大米发酵培养基中，大米的含量为6～8g/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述PDA培养基为每升水中含马铃薯100～300g、葡萄糖10～30g。

在本发明的一些实施方式中，所述提取的步骤包括将发酵产物进行破碎后，采用第一有机相进行浸泡后，脱除有机相，得到水相；将所述水相用第二有机相萃取1～5次，将萃取液合并，得到提取物。

在本发明的一些实施方式中，所述第一有机相为甲醇、乙醇或异丙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述第二有机相为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。

在本发明的一些实施方式中，所述浸泡时间为10～16h。

在本发明的一些实施方式中，所述水相与第二有机相的添加体积比为(1～2)：(1～3)。

在本发明的一些实施方式中，所述脱除有机相的方式为减压浓缩。

在本发明的一些实施方式中，所述分离纯化包括将提取物依次进行正相硅胶柱层析、MCI色谱柱、凝胶树脂、薄层色谱层析以及高效液相色谱分离纯化的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述正相硅胶色谱柱层析的分离纯化的步骤包括将提取物加入正相硅胶色谱柱后，采用第一洗脱剂进行洗脱，得到第一组分。

在本发明的一些实施方式中，所述第一洗脱剂为体积比为(0～100)：(100～0)的二氯甲烷与甲醇溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述第一洗脱剂为体积比为70～100：0～30的二氯甲烷与甲醇溶液。

在本发明的一些实施方式中，将所述第一组分经MCI柱采用第二洗脱剂洗脱分离得到第二组分。

在本发明的一些实施方式中，所述第二洗脱剂为体积比为20～100：80～0的不同梯度的甲醇与水溶液。

在本发明的一些实施方式中，将所述第二组分经凝胶树脂采用第三洗脱剂洗脱分离得到第三组分。

在本发明的一些实施方式中，所述凝胶树脂为Toyopearl HW-40F柱。

在本发明的一些实施方式中，所述第三洗脱剂为甲醇溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述薄层色谱层析分离纯化的步骤，包括将所述第三组分通过薄层层析点板，采用体积比为(8～12):(1～3)的二氯甲烷与甲醇溶液作为展开剂，收集Rf为0.3的馏分作为第四组分。

在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱的分离纯化的步骤包括将第四组分加入高效液相色谱柱后，采用第四洗脱剂进行洗脱，得到所述聚酮化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述第四洗脱剂为体积比为60～70：30～40：0.005～0.05的甲醇、水和甲酸溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱为半制备型高效液相色谱。

在本发明的第五方面，提出了上述台中曲霉菌SMU01、产品或上述聚酮化合物的应用，所述应用为在制备抗肿瘤的产品中的应用。Th9细胞除了通过直接靶向杀伤表达特异性抗原的肿瘤细胞外，也可以通过多种途径刺激招募到肿瘤中的单核细胞释放一型干扰素进而激活宿主自身免疫系统杀伤抗原丢失的肿瘤细胞，最终达到彻底根除肿瘤的目的。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备促进Th9细胞增殖的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备促进CD8

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备IL-9表达促进剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备Th9细胞中的IL-9表达促进剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备IFN-γ和/或TNF-a分泌促进剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备Th9细胞中的IFN-γ和/或TNF-a分泌促进剂中的应用。

根据本发明的一些的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案从台中曲霉菌Aspergillus taichungensis SMU01中分离得到聚酮化合物Aspertaichunol A，发现聚酮化合物Aspertaichunol A具有促进Th9和CD8

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的ITS序列鉴定图；

图2为本发明实施例3中的二维核磁COSY、HMBC和ROESY光谱分析结果图；

图3为本发明实施例3中的量子化学ECD计算结果图；

图4为本发明实施例3中的

图5为本发明实施例4中的流式细胞术检测结果图；

图6为本发明实施例4中的IL-9的表达的检测结果图；

图7为本发明实施例4中的CFSE稀释试验分析结果图，其中，A、B为流式细胞仪检测CFSE增殖细胞的百分率分析结果图；C为Th9细胞中IFN-γ和TNF-a的分泌效果检测结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

下述实施例中涉及的培养基及其制备方法如下：

马铃薯葡萄糖水培养基：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g，用水补足至1000mL，在110℃高压蒸汽灭菌25分钟制得。

发酵培养基：称取大米60g、葡萄糖0.3g、酵母提取物0.3g，加入H

实施例1Aspergillus taichungensis SMU01的获得

1、Aspergillus taichungensis SMU01菌株的分离

Aspergillus taichungensis SMU01菌株分离的具体方法如下：将美洲大蠊(来自南方医科大学白云校区，经昆明动物研究所权威分类专家鉴定)采样10只，75％乙醇浸泡1min，在无菌操作条件下取虫体，转移至10％次氯酸钠浸泡5min，再用无菌水漂洗10次，达到虫体表面消毒的效果(为了检验表面消毒效果，将最后一次清洗过的无菌水涂板后30℃培养2d，若无菌落出现，证明该虫体表面灭菌彻底，该内生菌得到的结果可信)。晾干的虫体，解剖腹部，取出内脏，用无菌研钵研碎。取少量至15mL无菌离心管内，加入少量无菌水，利用稀释法涂布PDA培养基(含有50μg/mL ampicillin和50μg/mL kanamycin)，分离得到菌株，并通过ITS序列鉴定为Aspergillus taichungensis SMU01。

2、Aspergillus taichungensis SMU01菌株的鉴定

(1)16s rDNA基因序列鉴定

将菌株spergillus taichungensis SMU01进行ITS序列鉴定，ITS序列鉴定图如图1所示，菌株ITS序列为：GGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGTTTCTCTGAAGCCCAACCTCCCACCCGTGTATACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGACCTCGCGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAAGTGCAGTCTGAGTCGATTGTTACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCGGTACCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGCAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCAACCCAACCATTTTTTACAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC(SEQ ID NO.1)。

通过将筛选到的真菌ITS序列扩增数据提交GenBank，利用NCBI进行同源性比对，获得相似序列信息，最后确定Aspergillus taichungensis为台中曲霉菌，同源性分值为99.8。

经过上述鉴定结果，确定Aspergillus taichungensis SMU01菌株为台中曲霉菌，该菌株已于2022年8月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心)，保藏编号为GDMCC NO:62752。

实施例2化合物的分离

本实施例制备了一种聚酮化合物，从台中曲霉菌Aspergillus taichungensisSMU01的发酵液中分离得到，具体过程为：

(1)孢子悬浮液的制备：将真菌Aspergillus taichungensis SMU01斜面菌种接种至PDA固体培养基，待真菌长出孢子后，接入马铃薯葡萄糖水液体培养基(100mL)中，随后用摇床(200r/min，28℃)培养3天，得到孢子悬浮液。

(2)真菌Aspergillus taichungensis SMU01的种子液培养：将步骤(1)得到的孢子悬浮液液接种3ml至发酵培养基中(大米60g、葡萄糖0.3g、酵母提取物0.3g，加入H

(3)将上述发酵物(包括菌体和大米固体培养基)，用破壁机破碎后得到膏状混合物，再用100％甲醇浸泡12h，重复提取五次，合并提取液，减压浓缩除去甲醇，收集水相；将水相用乙酸乙酯(体积比1：1)萃取，浓缩得乙酸乙酯浸膏108.0g(含菌体和发酵物里成分)。

(4)将总提取物用硅胶柱层析进行分离，具体为：将正相硅胶(100-200目)干法拌样后，装入常规硅胶柱，常温减压柱层析，依次用二氯甲烷：甲醇体积比分别为100:0，95:5，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，0:100的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，每个梯度使用1.5L洗脱溶剂，得到不同的洗脱液，最后洗脱液通过TLC和HPLC检测合并得到8个组分(Fr.A-Fr.H)。收集二氯甲烷：甲醇体积比90:10冲洗下来的样品得到组分Fr.C；组分Fr.C通过MCI柱分离，以甲醇/水(体积比20:80-100:0，每个梯度用量为2L)梯度洗脱，得到六个组分(Fr.C1-Fr.C6)；其中用甲醇/水(v/v,40:60-50:50)梯度洗脱得到的组分Fr.C2经过Toyopearl HW-40F柱分离(以甲醇为洗脱溶剂)，通过薄层层析点板，用二氯甲烷：甲醇＝10:1为展开剂，将其中R

实施例3化合物的结构分析

对新化合物Aspertaichunol A进行结构测试解析，得到以下实验数据：

(1)一维核磁数据分析

Aspertaichunol A，无色胶状，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 319.1910给出[M–H]

表1

聚酮化合物的结构式Aspertaichunol A，结构式如式(1)所示：

(2)平面结构确定

Aspertaichunol A的平面结构主要通过分析二维核磁数据确定。二维核磁数据如图2所示，从图中可以看出，该化合物的

(3)ROESY光谱分析

通过分析ROESY光谱进一步确定1的立体晶中心的相对构型。结果如图2所示，从图中可以看出，H-3与H-5、H-2与H-4、H-4与H

实施例4聚酮化合物Aspertaichunol A在增加Th9细胞中IL-9的表达中的应用

本实施例提供了聚酮化合物Aspertaichunol A在增加Th9细胞中IL-9的表达中的应用，具体的实验步骤如下：

(1)CD4

(2)体外Th9细胞的分化：包被抗CD3单克隆抗体，4℃过夜后，使用添加20nM的Comp1(Aspertaichunol A)、IL-4(10ng/mL)、TGF-β(1ng/mL)、抗IFN-γ单克隆抗体(20μg/mL)和抗CD28单克隆抗体(1μg/mL)的Th9极化培养基培养

(3)T细胞的增殖：将步骤(2)得到的Th9细胞与含终浓度为1.25μM CFSE的PBS溶液在37℃孵育20min，然后充分洗涤，通过相对CFSE稀释法测量了T细胞的增殖。

实验结果如图5-6所示，从图中可以看出，在有Comp1或无Comp1的情况下，纯化的CD4

CFSE稀释试验的结果如图7所示，图A和图B表示Th9细胞(Tc1细胞)另加20nM1CFSE极化3天时，用流式细胞仪检测CFSE增殖细胞的百分率，从图A中可以看出，Th9细胞经1次处理后增殖能力增强，从图B中可以看出，Comp1也能促进CD8

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。