一株拜耳接合酵母及其在葡萄酒中的应用

技术领域

本发明涉及葡萄酒发酵技术领域，具体涉及一株拜耳接合酵母及其在葡萄酒中的应用。

背景技术

葡萄酒是一种发酵型果酒，以酿酒葡萄为原料，经发酵后获得。葡萄酒发酵过程是一个较为成熟的工艺，通常采用混菌发酵的方式，混菌通常包括酵母菌和非酵母菌，通过混菌发酵，能够丰富葡萄酒中的香气组成，使葡萄酒的香气更加富有层次，因此，近些年的研究较多。

葡萄中富含葡萄糖和果糖，混菌发酵中的微生物在转化时，优先利用葡萄糖、然后利用果糖，导致酒精发酵周期长，另外，混菌中的微生物竞争激烈，在碳源丰富时期，优势菌大量繁殖且持续在整个发酵过程中，而劣势菌自始至终可能都难以发挥其预期的作用，从而导致同时期的葡萄酒品质会产生差异。发酵后的葡萄酒中含有多种高分子凝胶，如多糖、果胶、蛋白质等，还含有多种多酚类物质，如花色苷、单宁等，这些高分子凝胶和多酚类物质发生的物理、生物、化学反应，是影响葡萄酒澄清度的主要因素，因此，在葡萄酒发酵后，需要对其进行澄清处理以保证成品酒的澄清度和稳定性。葡萄酒的澄清方法主要有自然澄清法、机械澄清法、添加澄清剂法，其中，机械澄清法中，利用微孔膜过滤、错流膜过滤等设备昂贵；添加澄清剂法中，利用澄清剂(如明胶、皂土、蛋清、PVPP等)对葡萄酒进行澄清，容易下胶过量，对葡萄酒造成不可逆的损伤；自然澄清法是葡萄酒中各种物质自发形成絮凝产生沉淀，该方法不需要添加澄清剂，也不需要投入机械设备，因此，能够降低成本，但是，自然澄清法具有消耗时间长、效果差的缺点，导致该方法实际上并不能满足工厂化生产的需求。

因此，提供一种能够在发酵过程中减少混菌竞争、在澄清过程中能够缩短自然澄清时间且保证澄清效果的微生物在葡萄酒酿造中具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供了一株拜耳接合酵母及其在葡萄酒中的应用，该菌株已于2022年03月07日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学；邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M2022204，拉丁文名称Zygosaccharomyces bailii，在葡萄糖和果糖共同存在的情况下，该菌株JDCD01能够优先利用果糖，避免该菌株JDCD01与其他菌株混菌发酵时产生的菌株竞争问题，使菌株能够各自充分发挥其性能；在发酵过程中菌体自然成团，有效提高发酵后葡萄酒的自然澄清速度；能够提高葡萄酒中的苯乙醇和苯甲醇含量，丰富葡萄酒的香气。

本发明的技术方案如下：

一株拜耳接合酵母，菌株编号JDCD01，该菌株已于2022年03月07日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学；邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M2022204，拉丁文名称Zygosaccharomyces bailii。

优选的，所述拜耳接合酵母JDCD01从葡萄表皮筛选获得，其26S rDNA D1/D2区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述拜耳接合酵母JDCD01的葡萄糖耐受性在100-300g/L之间，果糖耐受性≥100g/L，渗透压耐受性以KCl浓度计在0.8-2.4mol/L之间，pH耐受性≥2.5，乙醇耐受性在6-14％(v/v)之间，SO

上述拜耳接合酵母JDCD01在葡萄酒中应用，发酵过程中能够优先利用果糖而降低微生物竞争，且能够增加苯乙醇和苯甲醇的含量，使葡萄酒具有玫瑰花样甜香气息；自然澄清过程中在保证澄清效果的前提下能够缩短澄清时间。

优选的，在上述应用中，好氧发酵过程中，拜耳接合酵母JDCD01产出的β-葡萄糖苷酶，5天累计酶活>116U/L，具有酶活性高的优点。随着发酵过程的进行，葡萄酒中会产生大量结合态的香气物质，该类结合态香气物质中的香气无法释放，而β-葡萄糖苷酶的高活性，能够有效的将结合态转化成游离态，使葡萄酒中香气丰满。

优选的，在上述应用中，将拜耳接合酵母JDCD01与EC1118进行混菌发酵，能够减少两者对糖类的竞争；且能够有效提高葡萄酒中的苯甲醇含量；相较于单独使用拜耳接合酵母JDCD01，苯甲醇含量提高了547.8％。

优选的，在上述应用中，拜耳接合酵母JDCD01与EC1118按照1∶1的质量比添加。

优选的，在上述应用中，拜耳接合酵母JDCD01添加48h后，添加EC1118。

优选的，在上述应用中，拜耳接合酵母JDCD01，制备方法为：取1环斜面拜耳接合酵母JDCD01接种于YPD液体培养基中，摇床200r/min，28℃培养，24-30小时，离心，收集湿菌体；EC1118，制备方法为：取1环斜面EC1118接种于YPD液体培养基中，摇床200r/min，28℃培养，18-20小时，离心，收集湿菌体。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明中提供了一株拜耳接合酵母，该菌株已于2022年03月07日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学；邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M2022204，拉丁文名称Zygosaccharomyces bailii，在葡萄糖和果糖共同存在的情况下，该菌株JDCD01能够优先利用果糖，避免该菌株JDCD01与其他菌株混用时产生的菌株竞争问题，缩短酒精发酵时间。

2、本发明提供的拜耳接合酵母JDCD01，在发酵过程中菌体自然成团，能够快速的与葡萄酒中的多酚类物质、高分子凝胶发生团聚现象，有效提高发酵后葡萄酒的自然澄清速度，缩短自然澄清时长，保证葡萄酒酒体的稳定性。

3、本发明提供的拜耳接合酵母JDCD01在应用于葡萄酒发酵中时，能够提高葡萄酒中的苯乙醇和苯甲醇含量，丰富葡萄酒的香气；当拜耳接合酵母JDCD01与EC1118混菌发酵时，相较于单独使用拜耳接合酵母JDCD01，有效提高了苯甲醇含量，丰富葡萄酒的香气。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为拜耳接合酵母JDCD01在电子显微镜下的细胞形态。

图2为拜耳接合酵母JDCD01在不同固定培养基上的菌落形态；左图为拜耳接合酵母JDCD01在YPD固体培养基上的菌落形态，右图为拜耳接合酵母JDCD01在WL固体培养基上的菌落形态。

图3为拜耳结合酵母JDCD01在YPD液体培养基中的生长曲线和酶活曲线。

图4为拜耳接合酵母JDCD01和EC1118在培养基中只含葡萄糖或果糖时对葡萄糖、果糖的利用情况。

图5为拜耳接合酵母JDCD01和EC1118在培养基中同时含葡萄糖和果糖时对葡萄糖、果糖的利用情况。

图6为拜耳接合酵母JDCD01和EC1118在模拟葡萄汁M4241D中对葡萄糖、果糖的利用情况。

图7为拜耳接合酵母JDCD01的GC-MS离子图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1分离鉴定

选取15粒成熟葡萄粒，放入100ml无菌水，28℃、180r/min条件下震荡培养30min，即得到稀释梯度为10

经鉴定，确定该菌株属于拜耳结合接合酵母属，拜耳接合酵母Zygosaccharomycesbailii，命名为JDCD01，该菌株的26S rDNA D1/D2区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该菌株已于2022年03月07日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学；邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M2022204，拉丁文名称Zygosaccharomyces bailii，该拜耳接合酵母JDCD01在电子显微镜下的细胞形态见图1。

SEQ ID NO：1

将上述拜耳接合酵母JDCD01分别采用划线的方法接种在YPD固体培养基平板和WL营养琼脂平板，结果见图2；图2中的左图为在YPD固体培养基平板上的菌落形态，图2中的右图为在WL营养琼脂平板上的菌落形态。

实施例2拜耳接合酵母JDCD01的耐受性实验

(1)葡萄糖耐受性

将实施例1斜面保藏的拜耳接合酵母JDCD01等量接种于装有不同葡萄糖质量浓度的10ml YPD液体培养基的带杜氏管的试管中，葡萄糖质量浓度为100g/L、200g/L、300g/L、400g/L，接种量为1ul接种环刮取1环，然后在28℃条件下恒温培养7天，观察记录其生长状况，结果见表1；

表1拜耳接合酵母：JDCD01葡萄糖耐受性结果

(2)葡萄糖耐受性

将实施例1斜面保藏的拜耳接合酵母JDCD01等量接种于装有不同果糖质量浓度的10ml YPD液体培养基的带杜氏管的试管中，果糖质量浓度为100g/L、200g/L、300g/L、400g/L，接种量为1ul微升接种环刮取1环，然后在28℃条件下恒温培养7天，观察记录其生长状况，结果见表2；

表2拜耳接合酵母JDCD01果糖耐受性结果

(3)渗透压耐受性

将实施例1斜面保藏的拜耳接合酵母JDCD01等量接种于装有不同渗透压的10mlYPD液体培养基的带杜氏管的试管中，KCl的浓度为0.8mol/L、1.0mol/L、2.4mol/L、2.6mol/L、2.8mol/L，接种量为1ul接种环刮取1环，然后在28℃条件下恒温培养7天，观察记录其生长状况，结果见表3；

表3拜耳接合酵母JDCD01渗透压耐受性结果

(4)pH耐受性

将实施例1斜面保藏的拜耳接合酵母JDCD01等量接种于装有不同pH的10ml YPD液体培养基的带杜氏管的试管中，pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，接种量为1ul接种环刮取1环，然后在28℃条件下恒温培养7天，观察记录其生长状况，结果见表4；

表4拜耳接合酵母JDCD01 pH耐受性结果

(5)乙醇耐受性

将实施例1斜面保藏的拜耳接合酵母JDCD01等量接种于装有不同酒精浓度的10mlYPD液体培养基的带杜氏管的试管中，酒精浓度为6％(v/v)、8％(v/v)、10％(v/v)、12％(v/v)、14％(v/v)、16％(v/v)、18％(v/v)，接种量为1ul接种环刮取1环，然后在28℃条件下恒温培养7天，观察记录其生长状况，结果见表5；

表5拜耳接合酵母JDCD01乙醇耐受性结果

(6)SO

将实施例1斜面保藏的拜耳接合酵母JDCD01等量接种于装有不同SO

表6拜耳接合酵母JDCD01 SO

备注：一周后观察产气情况，“+++”代表杜氏管满、“++”三分之二以内、“+”三分之一以内、“一”没产气。

由表1-表6可知，本发明筛选得到的拜耳结合酵母JDCD01葡萄糖耐受性在100-300g/L之间，果糖耐受性100g/L，渗透压耐受性以KCl浓度计在0.8-2.4mol/L之间，pH耐受性≥2.5，乙醇耐受性在6-14％(v/v)之间，SO

实施例3拜耳接合酵母JDCD01的生长曲线及β-葡萄糖苷酶活性

葡萄酒发酵过程是产生酒精和产生香气物质的主要过程，香气物质主要包括结合态香气物质和游离态香气物质，而葡萄酒中以结合态香气物质为主；但是，在品评过程中，仅游离态香气物质能够被识别，也就是说，即使葡萄酒中有大量的结合态香气物质，但是在感官品评中，这类香气并不能发挥作用；β-葡萄糖苷酶是一种能够将结合态香气物质水解为游离态香气物质的酶，其存在能够影响葡萄酒中游离态香气物质的量，因此，对本发明提供的拜耳接合酵母JDCD01的生长曲线与β-葡萄糖苷酶活性进行实验，过程如下；

实验设计：

菌种的活化：取1环斜面上的JDCD01加入YPD液体中，在28℃、200r/min条件下震荡培养24小时，然后8000r/min，20℃离心5min，收集新鲜菌体；

接种培养：称取0.25g新鲜的JDCD01，加至100ml YPD液体培养基中，第1组在28℃、200r/min条件下震荡培养，第2组置于28℃恒温培养箱中静置培养，每组3个重复。

绘制第1组的生长曲线绘制：

接种后，在0小时、第4小时、第8小时、第12小时、第16小时、第20小时、第24小时、第32小时、第48小时、第72小时、第96小时、第120小时，各取样3次；测定：测菌悬液在600nm波长处的吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线，如图3所示；

β-葡萄糖苷酶活性测定：

分别在接种后的第24小时、第32小时、第48小时、第72小时、第96小时、第120小时对第1组和第2组进行取样，测定β-葡萄糖苷酶活性，以培养时间为横坐标，酶活为纵坐标，绘制酶活曲线，如图3所示；

图3为双纵坐标图，结合图3可知，拜耳接合酵母JDCD01在32小时左右生长曲线能接近平衡期，开始积累次级代谢产物，五天累计酶活高达116.8U/L，其β-葡萄糖苷酶酶活受氧气影响较大，静止与摇床培养5天累计酶活相差68.1U/L。

实施例4拜耳接合酵母JDCD01对葡萄糖、果糖的利用

培养基组成：

培养基①：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；该培养基只含葡萄糖：

培养基②：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，果糖20g/L；该培养基只含果糖；

培养基③：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，果糖20g/L；该培养基同时含葡萄糖和果糖；

培养基④(模拟葡萄汁M4241D)：葡萄糖，100g/L；果糖，100g/L；酒石酸，3g/L；柠檬酸，0.3g/L；L-苹果酸，0.3g/L；MgSO

EC1118是法国LALVIN公司；

实验组A：

采用培养基①、培养基②，分别取1环斜面JDCD01和EC1118，然后分别接种于培养基①、培养基②中，28℃培养；

观察JDCD01和EC1118对葡萄糖和果糖的利用情况；

实验组B：

与实验组A的区别在于，采用培养基③；

实验组C：

分别取1环EC1118和JDCD01接种于培养基④无菌模拟葡萄汁M4241D，18℃培养；

取样规则：每隔2天取样，采用HPLC法测定葡萄糖和果糖组成，实验组A的结果见图4，实验组B的结果见图5，实验组C的结果见图6。

结果发现，不管是只有果糖或果糖存在，还是果糖和葡萄糖同时存在的情况下，拜耳结合酵母JDCD01对果糖的代谢速率都快于葡萄糖，而EC1118对果糖和葡萄糖的代谢速率恰恰与之相反；也就是说，拜耳结合酵母JDCD01和EC1118对果糖和葡萄糖利用的优先顺序上相反，因此，在葡萄酒发酵中，可以将JDCD01和EC1118混菌发酵，以减少菌株对碳源的竞争。

实施例5拜耳接合酵母JDCD01对葡萄酒的澄清效果

霞多丽葡萄除梗破碎，挤汁，加200μl/L的DMDC处理，分装800ml葡萄汁到1000ml蓝盖瓶中，每组3个重复，分别按下列方案接种：①0.5g JDCD01；②0.25g JDCD01+48小时后添加0.25g EC1118；③0.5g EC1118；用盛5-6m1甘油的单向阀密封塞封口，18℃控温发酵，结果如表7所示；

上述接种方案中，JDCD01和EC1118的添加均按照湿菌体的量加入，湿菌体的获取方法如下：

拜耳接合酵母JDCD01湿菌体，制备方法为：取1环斜面拜耳接合酵母JDCD01接种于YPD液体培养基中，摇床200r/min，28℃培养，24小时，离心，收集湿菌体；

EC1118湿菌体，制备方法为：取1环斜面EC1118接种于YPD液体培养基中，摇床200r/min，28℃培养，18小时，离心，收集湿菌体。

表7拜耳接合酵母JDCD01的浊度变化

由表7可知，拜耳接合酵母JDCD01单独发酵和混菌发酵结束后自然澄清2个月浊度分别降至12.57NTU和19.76NTU，明显优于对照组的29.30NTU，说明拜耳接合酵母JDCD01单独发酵和混菌发酵有助于葡萄酒的自然澄清，不仅节省陈酿的时间，还能节省生产成本，具有可观的经济效益。

实施例6拜耳接合酵母JDCD01对葡萄酒香气的影响

小芒森除梗破碎，挤汁，在20℃、8000r/min的条件下离心5min，取上清用0.8μm和0.45μm无菌滤膜过滤除菌，分装800ml葡萄汁到1000ml蓝盖瓶中，每组3个重复，分别按下列方案接种，以下接种中，使用的JDCD01和EC1118均为湿菌体，湿菌体的制备方法同实施例5；接种方案为①0.5g JDCD01；②0.5g EC1118；③0.25g JDCD01+48小时后添加0.25gEC1118；用无菌透气封口膜封口，18℃控温发酵，结果如图7和表8所示。

表8 GC-MS检测结果

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由表8可知，从总体上来看，JDCD01纯发酵和混菌发酵醇类香气物质总量高于对照组EC 1 1 1 8纯发酵，酸类总量略低于对照组。3组实验含量较高的成分都是异戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇，只是组成比例上存在差异，其中JDCD01纯发酵和混菌发酵组合中的苯乙醇含量明显高于对照组，苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰花香，能提升葡萄酒香气品质。

尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。