宫颈癌原代细胞的培养基和培养方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增宫颈癌原代细胞的培养基及培养方法。

背景技术

据世界卫生组织下属国际癌症研究机构(IARC)发布的2018年最新全球癌症统计数据《全球癌症报告》显示2018年全球新增1810万例癌症病例，死亡人数达960万，全球癌症负担进一步加重。2018年中国癌症发病率TOP10为乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、胃癌、宫颈癌、肝癌、食管癌、子宫癌、脑癌。其中，宫颈癌女性发病率第6位。每年全球死于宫颈癌的妇女有20万，中国占10％左右。由于宫颈癌发病的分子机制尚不明确，针对宫颈癌尤其是中晚期患者的治疗手段仍然有限，导致临床上患者五年生存率较低，缺乏个性化的精准用药指导。

功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表宫颈癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷且能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟，一种是使用经辐射的滋养细胞和ROCK激酶抑制剂来促进原代细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am.J.Pathol.，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。

然而，类器官技术是将患者自体原代细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，但是该技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat.Cell Biol.，18(3)：246-54，2016)。

细胞重编程技术是一种将患者自体原代细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术，但是在文献中未见报道针对宫颈癌样本进行测试，故文献报道的培养基成分对宫颈癌原代肿瘤细胞是否能够快速的扩增还未可知。

鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种宫颈癌原代细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，在将该技术应用于构建原代宫颈癌肿瘤细胞模型时，所培养的宫颈癌肿瘤细胞能代表宫颈癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养宫颈癌原代细胞的培养基以及使用该培养基培养宫颈癌原代细胞的方法。采用本发明的宫颈癌原代细胞培养基和培养方法，能够达到体外培养周期短、成本可控、操作便捷的目的。在该技术应用于构建原代宫颈癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有宫颈癌患者自身生物学特性的原代宫颈癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。

本发明的一个方面在于提供一种用于培养宫颈癌原代细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂；胰岛素样生长因子1；成纤维细胞生长因子7；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；肝细胞生长因子；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂；和碘塞罗宁，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物。

其中，

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优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

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最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

在本发明的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量通常为2μM～20μM，优选为5μM～20μM，更优选为5μM。

本发明的原代细胞培养基优选还含有以下因子中的一种或多种：胰岛素样生长因子1(IGF-1)；成纤维细胞生长因子7(FGF7)；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)；肝细胞生长因子(HGF)；碘塞罗宁；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂。其中，在优选的实施方式中，所述成纤维细胞生长因子7在培养基中的含量优选为2～40ng/ml，更优选10～40ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物相对于培养基的体积比优选为1:100～1:25；所述胰岛素样生长因子1的含量优选为2～40ng/ml，更优选为10～40ng/ml；所述肝细胞生长因子的含量优选为2～40ng/ml，更优选为10～40ng/ml；所述碘塞罗宁的含量优选为2～50nM，更优选为2～10nM；所述ROCK激酶抑制剂优选为Y27632，且ROCK激酶抑制剂的含量优选为2～20μM，更优选为2～10μM。

该培养基配方成分与细胞条件重编程培养基和类器官培养基成分相比，添加了MST1/2激酶抑制剂，但不包含血清、牛垂体提取物等不确定成分，也不包含Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等类器官培养所必须的龛因子，并且不包含烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸，从而大大降低了培养基的成本，简化了配制培养基的操作流程，实现了成本可控和操作便捷的宫颈癌原代细胞的体外培养。

本发明中，宫颈癌原代细胞可以为宫颈癌肿瘤细胞、正常宫颈癌原代细胞、宫颈癌上皮干细胞。

本发明的一个方面在于提供一种宫颈癌原代细胞的培养方法，其包括以下步骤：

(1)按上述配方配制本发明的原代细胞培养基；

(2)使用辐照后的滋养细胞预铺培养容器。

具体地，所述的滋养细胞例如可以为辐照后的NIH-3T3细胞，辐照源为X射线或者γ射线，优选为γ射线，辐照剂量为30～50Gy，优选为35Gy，辐照时间为5～20分钟。具体地，将辐照后的NIH-3T3细胞按照2～5×10

(3)从宫颈癌组织分离得到宫颈癌原代细胞。

宫颈癌原代细胞例如可以来源于宫颈癌组织样本和癌旁组织样本。宫颈癌组织样本例如来源于进行过说明并获得同意的宫颈癌肿瘤患者手术切除的癌组织样本，癌旁组织样本采集自离宫颈癌组织距离至少5cm以上的组织。在患者手术切除后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm

在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉。将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入1-3mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm

将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1000～3000转/分钟离心3～5分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，其中组织消化液的配制方法为：将1～2mg/mL胶原酶Ⅱ、1～2mg/mL胶原酶Ⅳ、50～100U/mL脱氧核糖核酸Ⅰ、0.5～1mg/mL透明质酸酶、0.1～0.5mg/mL氯化钙、5～10mg/mL牛血清白蛋白溶于体积比1:1的HBSS和RPMI-1640中)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、200～300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成；若未见明显组织块即可终止消化，否则继续消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时。消化完成后，细胞滤网(细胞筛孔径为例如70μm)过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，用台式离心机以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加1～5mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解10～20分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，加入本发明的原代细胞培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。

(4)在预接种有滋养细胞的培养器皿内接种步骤(3)中分离得到的原代宫颈癌原代细胞，并采用步骤(1)中的原代细胞培养基进行培养。

更具体而言，待滋养细胞贴壁后，按2×10

该步骤相比类器官技术，无需在冰上将原代细胞和基质胶混匀后形成胶滴，并等待胶滴凝固后加入培养基。此外，还节约了价格昂贵的细胞外基质胶的使用量，简化了操作步骤。

任选地，接种后的宫颈癌原代细胞在培养8～16天后，当培养容器内形成的细胞克隆汇合达到底面积80％，弃去上清，加入1～2mL0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入1～2mL 0.05％胰酶进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养液2～4mL重悬消化处理后的细胞，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟，使用本发明的原代细胞培养基将消化后的单细胞重悬，将所得到的细胞悬液置入预铺有滋养细胞的培养器皿中继续扩大培养。培养器皿的预处理操作同步骤(2)。

扩增的宫颈癌原代细胞呈2D生长，避免了类器官技术扩增出现的类器官大小不均一和生长过大的类器官出现内部坏死等情况。

本发明还提供一种用于评估或筛选治疗宫颈癌疾病的药物的方法，其包括以下步骤：

(1)使用本发明的宫颈癌原代细胞的培养方法培养宫颈癌原代细胞；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的宫颈癌原代细胞添加稀释后的所述药物；

(4)进行细胞活性测试。

本发明的有益效果还包括：

(1)提高宫颈癌原代细胞培养的成功率，成功率达到85％以上；

(2)保证体外培养的宫颈癌原代细胞能够保持原代细胞来源病人的病理表型和异质性；

(3)培养基成分不含血清，所以不受不同批次血清质量和数量的影响；

(4)扩增宫颈癌原代细胞效率高，只要有10

(5)传代步骤无需冰上操作和解离基质胶，10-15分钟内即可完成细胞的消化传代；

(6)培养成本可控，宫颈癌原代细胞培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等因子，节约了细胞培养的成本；

(7)操作便捷，该技术相比类器官技术，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；

(9)所述技术培养获得的宫颈癌原代细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物，并为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。

采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人或其他哺乳动物的宫颈癌原代细胞，包括宫颈癌肿瘤细胞、正常宫颈癌原代细胞、宫颈癌上皮干细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织。同时，本发明技术的培养基还可以用于开发体外宫颈癌原代细胞扩增培养的试剂盒。

另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、宫颈癌原代细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及来源于宫颈癌疾病的新药研发等。

附图说明

图1A-1G是显示各添加因子的浓度对宫颈癌原代细胞增殖的影响的图。

图2A和2B是将从1例宫颈癌临床组织样本分离得到的细胞采用本发明的培养基CM分别培养至第4天和第12天的宫颈癌肿瘤细胞在倒置显微镜下拍摄的照片。

图3是从1例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞采用3种不同培养基培养7天后收集到的细胞总数比较的视图。

图4是从6例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞在三种不同培养基条件下培养7天后得到细胞增殖效果的比较图。

图5A和5B是从1例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞采用本发明的培养基CM培养获得宫颈癌肿瘤细胞后，分别使用非特异性细胞核染料DAPI和宫颈癌特异性抗体p16染色的图片。

图6是1例宫颈癌手术切除样本的原始组织细胞和采用该细胞以本发明的培养基CM培养而获得的宫颈癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。

图7显示从2例宫颈癌患者的手术切除癌组织样本分离得到的细胞按照本发明的方法培养获得的宫颈癌肿瘤细胞在8种不同药物影响下的细胞活性曲线。

具体实施方式

本说明书中，原代细胞包括从上皮组织获取的已分化的原代细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我更新能力和向原代细胞分化的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的细胞培养基较好是用于来源于宫颈癌原代细胞的培养基。

此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。

本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地自发组织和聚集而成的三维立体的、类似于器官的细胞组织体。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。

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[实施例1]

人宫颈癌原代细胞的分离

宫颈癌组织样本来源于三例进行过说明并获得同意的宫颈癌肿瘤患者手术切除癌组织样本，它们分别是样本编号CCA2、CCA3、CCA4、下面以其中一例样本(编号CCA2)进行说明。

在患者手术切除后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm

表1组织运输液配方

表2组织消化液配方

在生物安全柜内，将组织样本(编号CCA2)转移至100mm细胞培养皿(购自NEST公司)内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的残留的血液清洗掉，并剔除组织样本表面的脂肪等多余的组织。将润洗后的组织样本转移至另一个新的100mm培养皿内，加入2mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm

将组织样本碎块转移至15mL离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1500转/分钟离心4分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，具体配制见表2)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成。

消化完成后，70μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，1500转/分钟离心4分钟。

弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解15分钟，5分钟摇晃混匀一次。裂解结束后取出，以1500转/分钟离心4分钟。弃上清，得到消化分离后的宫颈癌原代细胞，加入基础培养基(BM)重悬，其中，基础培养基是由市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度。使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为208万。

另外两例宫颈癌肿瘤组织样本按照以上同样的方法进行分离，得到的细胞总数分别为197万(CCA3)和232万(CCA4)。

[实施例2]

宫颈癌原代细胞培养基的优化

(1)不同因子的作用

以0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)将培养的NIH-3T3细胞(购自ATCC，使用含10％的胎牛血清的DMEM培养液进行培养)消化，用含有5％(v/v)胎牛血清(购自依科赛公司)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液(购自康宁公司)终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用上述含10％的胎牛血清的DMEM培养液重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，用35Gy辐照剂量γ射线辐照10分钟，随后按2×10

配制基础培养基(缩写为BM)：向市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度，配制得到BM。

接着，在基础培养基(BM)中分别加入不同种类和不同浓度的添加剂因子(表3)，配制成含有不同添加成分的宫颈癌原代细胞培养基。

表3不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)

将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔培养板内。将按照实施例1相同方法从宫颈癌组织分离得到的宫颈癌肿瘤细胞(编号CCA12)以4×10

(2)所添加因子的不同浓度对本专利获得的宫颈癌原代细胞的增殖作用

配制本实施例的宫颈癌原代细胞培养基：向基础培养基(BM)中以最终浓度20ng/ml的条件添加成纤维细胞生长因子7(FGF7)，以最终浓度20ng/ml的条件添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)，以最终浓度20ng/ml的条件添加肝细胞生长因子(HGF)，以1:50比例稀释条件添加胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)储液(胰岛素在培养基的终浓度为10μg/ml，转铁蛋白在培养基的终浓度为5μg/ml，亚硒酸钠在培养基的终浓度为5ng/ml)，以最终浓度5μM的条件添加化合物1，以最终浓度10μM的条件添加Y27632，以最终浓度10nM条件添加碘塞罗宁，制备宫颈癌原代细胞培养基。

使用与实施例1同样的方法从宫颈癌患者的癌组织(样本编号CCA8)中分离获得癌组织来源的宫颈癌原代细胞。接着，将癌组织来源的宫颈癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×10

接着，配制以下8种配方培养基进行实验：

配方1：上述培养基组分中不含成纤维细胞生长因子7；

配方2：上述培养基组分中不含胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；

配方3：上述培养基组分中不含胰岛素样生长因子1；

配方4：上述培养基组分中不含肝细胞生长因子；

配方5：上述培养基组分中不含Y27632；

配方6：上述培养基组分中不含化合物1；

配方7：上述培养基组分中不含碘塞罗宁。

分别使用上述配方1～7来稀释上述消化后的细胞悬液，按照每孔1万细胞，250微升体积种入预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔板中。

在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的成纤维细胞生长因子7每孔250微升，成纤维细胞生长因子7的终浓度分别为40ng/ml、10ng/ml、2ng/ml；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物每孔250微升，胰岛素-转铁蛋白-硒复合物储液的终浓度分别为1:100、1:50、1:25(对应于胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠的终浓度分别为5μg/ml-2.5μg/ml-2.5ng/ml；10μg/ml-5μg/ml-5ng/ml；20μg/ml-10μg/ml-10ng/ml)；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素样生长因子1每孔250微升，胰岛素样生长因子1的终浓度分别为40ng/ml、10ng/ml、2ng/ml并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的肝细胞生长因子每孔250微升，肝细胞生长因子的终浓度分别为40ng/ml、10ng/ml、2ng/ml；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的Y27632每孔250微升，Y27632的终浓度分别为20μM、10μM、2μM；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的化合物1每孔250微升，化合物1的终浓度分别为20μM、5μM、2μM；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的碘塞罗宁每孔250微升，碘塞罗宁的终浓度分别为50nM、10nM、2nM；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。

待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算比值，将结果分别示于图1A～1G。图1A～图1G中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。

根据图1A～1G的结果，成纤维细胞生长因子7在培养基中的含量优选为2～40ng/ml，更优选10～40ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物的体积浓度优选为1:25～1:100，更优选1:25～1:50(对应于胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠的终浓度分别为5～20μg/ml-2.5～10μg/ml-2.5～10ng/ml；优选10～20μg/ml-5～10μg/ml-5～10ng/ml)；胰岛素样生长因子1的含量优选为2ng/ml～40ng/ml，更优选为10ng/ml～40ng/ml；肝细胞生长因子的含量优选为2ng/ml～40ng/ml，更优选为10ng/ml～40ng/ml；Y27632的含量优选为2μM～20μM，更优选为2μM～10μM；化合物1的含量优选为2μM～20μM，更优选为5μM～20μM；碘塞罗宁的含量优选为2nM～50nM，更优选为2nM～10nM。

根据以上个组分的优选浓度，配制本发明的优选培养基配方CM，其包含：基础培养基(BM)、10ng/ml成纤维细胞生长因子7(FGF7)、10ng/ml肝细胞生长因子(HGF)、10ng/ml胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1:50体积比的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、5μM化合物1、10μMY27632和10nM碘塞罗宁。

[实施例3]

人宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞的培养

使用与实施例1同样的方法从宫颈癌患者的癌组织(样本编号CCA5)中分离获得癌组织来源的宫颈癌原代细胞。接着，将癌组织来源的宫颈癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×10

图2A是本实施例按4×10

[实施例4]

不同培养基对宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞的促增殖效果

(1)不同培养基对原代细胞克隆形成的影响和增殖效果的比较

使用与实施例2同样的方法制备宫颈癌原代细胞培养基CM，和作为对照的基础培养基BM。另外制备细胞条件重编程技术文献中所用培养基FM作为另一对照例，配制步骤参见(Liu等，Nat.Protoc.，12(2):439-451，2017)，培养基配方见表4。

表4细胞条件重编程技术文献中所用培养基(FM)成分

使用与实施例1同样的方法获得宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞(编号CCA10)。接着，按照相同的密度(4×10

A.本发明技术：按4×10

B.细胞条件重编程技术：按4×10

C.按4×10

上述三种培养中，每5天对三种培养条件下培养的细胞进行换液。同时观察24孔板中各培养基培养下细胞形成克隆和细胞增殖状态，使用显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)进行拍照记录细胞生长状况。

对于采用本发明技术培养的原代宫颈癌肿瘤细胞(编号CCA10)，分别在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去24孔板内的培养基上清，加入0.5mL 0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入0.5mL 0.05％胰酶进行细胞消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIOFIL)进行计数，得到细胞总数为61.7万。另2种培养条件下培养的细胞采用如上述同样的操作方式进行消化和计数，使用培养基FM和BM培养得到的细胞总数分别是23.3万和12.9万。

图3是编号CCA10细胞在不同条件下扩增的到的细胞总数作图。

图4是6例宫颈癌病人样本(编号CCA8、CCA6、CCA2、CCA3、CCA10、CG2)按照实施例1的方法获得宫颈癌原代细胞，然后在以上三种不同培养基条件下培养7天后得到细胞增殖效果的比较图，其中√代表有一定的克隆形成能力和促增殖效果，√√代表有较为明显的克隆形成能力和促增殖效果，√√√代表有非常明显的克隆形成能力和促增殖效果，×代表不能形成克隆。从图中可以确认CM培养基在对宫颈癌组织来源获得的原代细胞培养中对克隆形成能力和促细胞增殖效果较其他2种培养条件有明显优势。

[实施例5]

癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞的鉴定

(1)原代宫颈癌组织和传代培养后的宫颈癌细胞免疫荧光鉴定

使用与实施例1同样的方法从宫颈癌患者的癌组织(样本编号CG2)中分离获得癌组织来源的宫颈癌原代细胞。接着，将癌组织来源的宫颈癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×10

待24孔板中细胞扩增80％底面积时，弃培养液，使用4％甲醛冰上固定细胞30分钟。PBS(购自上海生工)洗5分钟x 3次。弃PBS，加入通透液，避光下，摇床(100rpm左右)破膜30分钟，PBS洗5分钟x 3次。随后使用PBS+0.3％Triton X-100(购自上海生工)配制5％体积浓度的BSA(购自上海生工)溶液用于封闭，37℃封闭30分钟。

提前配制PBS+0.3％Triton X-100用于稀释抗体，按照1:50比例稀释宫颈癌特异性抗体p16(购自CST公司)，弃封闭液，加入配制好的一抗稀释液，至4℃冰箱孵育过夜。4℃取出，平衡至室温，37℃继续孵育1小时，PBS洗5分钟x 3次。

提前配制PBS+0.3％Triton X-100用于二抗稀释，按照1:1000比例稀释激发光为488nm且种属为兔的荧光二抗(购自赛默飞公司)，常温避光孵育1小时，PBS洗5分钟x 3次。

用PBS按照1:1000体积比稀释非特异性荧光染料DAPI(购自Sigma公司)，常温避光染色5分钟，PBS洗5分钟x 3次。显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下成像，拍照记录。

图5A和5B分别为10倍物镜下不同视野荧光拍照的图片，其中图5A是使用非特异性荧光染料DAPI染细胞核的图片，图5B是使用宫颈癌特异性抗体p16染色的图片。如图所示，在图5A中标记细胞核的位置在图5B中均被深染(图中灰色部分)，表明培养后的细胞为宫颈癌细胞，与临床病理诊断一致。

(2)原代宫颈癌组织和传代培养后的宫颈癌细胞免疫组化鉴定

从一例宫颈癌患者的临床手术切除样本取出约绿豆粒大小的癌组织(样本编号CG2)，浸泡在1mL 4％多聚甲醛中固定。剩余癌组织使用与实施例1相同的方法获得宫颈癌原代细胞(样本编号CG2)。使用实施例3的方法采用本发明的培养基CM将样本CG2持续培养至第四代。

采用免疫组化法检测样本CG2原始组织和持续培养至第4代得到的原代细胞中与宫颈癌相关的重要生物标记物的表达。4％多聚甲醛固定后的组织，经石蜡包埋，用切片机切成4μm厚的组织切片。随后进行常规的免疫组织化学检测(具体步骤参见Li等，NatureConmunication，(2018)9:2983)。所使用的一抗为细胞角蛋白7(CK7)(购自CST公司)、p16抗体(购自CST公司)、Ki67抗体(购自CST公司)和p53抗体(购自CST公司)。

图6是原始组织细胞和采用该细胞以本发明的培养基CM培养而获得的宫颈癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。由图6可以确认，采用本发明技术培养的宫颈癌肿瘤细胞(样本编号CG2)培养至第4代时，细胞上与宫颈癌相关的生物标记物的表达情况与细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。说明采用本发明技术所培养的细胞保持了宫颈癌病人癌组织的原始病理特性。

[实施例6]

癌组织来源的宫颈癌肿瘤细胞的药物敏感性功能测试

下面以宫颈癌患者手术切除样本为例，说明由病人来源的宫颈癌肿瘤样本培养得到的宫颈癌肿瘤细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。

一、原代宫颈癌肿瘤细胞的铺板：按照实施例1中方法得到的分离后的宫颈癌肿瘤细胞(编号CCa5和编号CCa9)悬液，按照4×10

二、药物梯度实验：

(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：分别吸取40μL的10μM待测药物母液作为最高浓度，再分别从中吸取10μL加入到含20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，再从上述EP管中吸取10μL到第二个已装有20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，即按照1:3稀释药品。重复以上方法，依次稀释，最后得到加药所需的7种浓度。将不同浓度的药物加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的DMSO作为对照。本实施例中，待测药物为安罗替尼(购自MCE公司)、帕唑帕尼(购自MCE公司)、阿帕替尼(购自MCE公司)、硼替佐米(购自MCE公司)、顺铂(购自MCE公司)、紫杉醇(购自MCE公司)、5-氟尿嘧啶(购自MCE公司)、拓扑替康(购自MCE公司)。

(2)使用高通量自动化工作站(Perkin Elmer公司JANUS)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有宫颈癌肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nL。

(3)细胞活性检测：给药72小时后，用Cell Titer-Glo检测试剂(购自Promega公司)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入10μL配制好的Cell Titer-Glo检测液，混匀后使用酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测化学发光数值。按照公式细胞存活率(％)＝加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞存活率，使用Graphpad Prism软件作图并计算半数抑制率IC

(4)药物敏感性测试结果如图7所示。图7表示从两个不同的宫颈癌患者的手术切除癌组织样本(编号CCa5和编号CCa9)所培养获得的宫颈癌肿瘤细胞对靶向药物安罗替尼、帕唑帕尼、阿帕替尼、硼替佐米、和化疗药物顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、拓扑替康的敏感性结果。结果显示，同一病人的细胞对不同浓度药物作用时的敏感性不同，不同病人的细胞对在同一种药物的敏感性也不同，根据结果可以判断宫颈癌病人在临床使用该种药物时的有效性。

工业应用性

本发明提供一种用于在体外培养或扩增宫颈癌原代细胞的培养基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。

尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。