一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生防菌技术领域，具体涉及一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及制备方法和应用。

背景技术

蔬菜营养成分丰富，除日常饮食必须外，其活性成分在保健、农业、医药以及日化品等领域中被广泛应用。蔬菜在生产以及贮藏运输中病害频发，其中最常见、危害最重的是软腐病，严重制约蔬菜产业发展。引起蔬菜软腐病的病原菌种类丰富、来源和致病机制具有多样性，目前发现，主要包括果胶杆菌属(Pectobacteriumspp.)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)、沙雷氏菌属(Serratiaspp.)，其中国内外研究报道最多为果胶杆菌属，其他几种软腐菌报道较少。该病主要通过分泌胞壁降解酶，从而使植株软腐病变，感染迅速，在全球范围内普遍流行。除了危害白菜、马铃薯、圆葱、芹菜、娃娃菜等重要蔬菜外，还会对一些观赏性花卉植物、树木、农作物等造成伤害，给农户带来巨大经济损失，严重制约蔬菜产业的可持续发展。

生物防治因其对环境友好、人畜安全等优点成为近年来研究植物病害防治的主要方法。目前利用拮抗微生物(细菌、放线菌、真菌)、群体感应淬灭、微生物蛋白农药、小RNA基因沉默等手段防治蔬菜软腐病报道越来越多。但是目前大多研究集中于对单一蔬菜软腐病菌拮抗菌株筛选，软腐病菌种类多样，具有广宿主性，因此筛选防治多种蔬菜软腐病菌的广谱拮抗菌株极其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及制备方法和应用，所述菌株对多种致病细菌和致病真菌具有拮抗作用，抗菌谱广。

本发明提供了一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DJ1菌株，所述DJ1菌株的保藏编号为CGMCNo.25972。

优选的，所述生防作用包括拮抗病原细菌和病原真菌。

优选的，所述病原细菌包括人类致病细菌和软腐病致病细菌；

所述病原真菌包括植物致病真菌。

优选的，所述人类致病细菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；

所述软腐病致病细菌包括白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum)、圆葱软腐病菌(Burkholderiagladioli)和娃娃菜软腐病菌(Pseudomonassp.)；

所述植物致病真菌包括刺五加根腐病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻绵腐病菌(Pythiumoryzae)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、豆角炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、玉米茎基腐病菌(Fusariumgraminearum)和水稻恶苗病菌(Fusariummoniliforme)。

本发明还提供了上述DJ1菌株在制备生防制剂中的应用。

本发明还提供了一种防控植物细菌和/或真菌病害的方法，包括以下步骤：在植物生育期内接种上述DJ1菌株的菌制品。

优选的，所述接种的方法包括喷洒、灌根或拌土。

优选的，所述菌制品为包含菌体、菌悬液和发酵上清液中任一种的制品。

本发明还提供了一种具有生防作用的菌剂，包括上述DJ1菌株的菌体、菌丝、菌悬液或发酵上清液。

本发明还提供了上述菌剂的制备方法，包括将上述DJ1菌株经活化后，接种于LB液体培养基中进行培养，利用所述培养液制备所述菌剂。

有益效果：本发明提供了一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌DJ1菌株，所述DJ1菌株以白菜软腐病菌、圆葱软腐病菌和娃娃菜软腐病菌为靶标，采用抑菌圈法从蔬菜根际土中筛选得到，且所述菌株DJ1为革兰氏阳性、杆状、有芽孢，同时还表现出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、水稻绵霉菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、豆角炭疽病菌、玉米茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、番茄灰霉病以及刺五加立枯病菌的抑制作用。本发明所述DJ1菌株具有广泛的抗菌活性，尤其在蔬菜细菌和真菌病害混发地带，防效良好，具有更大的应用潜力，是一株具有应用前景的优良生防菌株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为DJ1对软腐病菌白菜软腐病菌(左)、圆葱软腐病菌(中)和娃娃菜软腐病菌(右)的抑菌圈结果图；

图2为在LB培养基上的菌株DJ1形态结果图，b中标尺200μm；

图3为菌株DJ1的系统发育进化树结果图；

图4为拮抗菌DJ1对离体白菜、圆葱和娃娃菜软腐病菌的抑菌活性结果图，其中图4a：菌株DJ1对离体白菜软腐菌的抑菌活性(1：对照组；2：圆葱软腐病菌处理组；3：DJ1处理组)；图4b：菌株DJ1对离体圆葱软腐菌的抑菌活性(1：对照组；2：白菜软腐病菌处理组；3：DJ1处理组)；图4c：菌株DJ1对离体娃娃菜软腐菌的抑菌活性(1：对照组；2：娃娃菜软腐病菌处理组；3：DJ1处理组)；图4d：菌株DJ1对离体白菜、圆葱和娃娃菜软腐病菌的防效；

图5为拮抗细菌对白菜软腐病菌群体感应信号因子的降解活性结果图，其中a：只含有5μmol·L

图6为菌株DJ1对不同病原真菌的抑制效果图，图中Z1：刺五加立枯病；Z2：水稻绵腐病；Z3：黄瓜枯萎病；Z4；水稻稻瘟病；Z5；豆角炭疽病；Z6：玉米茎基腐病；Z7；水稻恶苗病；Z8：番茄灰霉病；

图7为菌株DJ1对白菜软腐病菌圆葱软腐病菌的田间小区防效结果图，其中A：圆葱软腐病菌处理组；B：DJ处理组。

生物保藏信息

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，菌株编号为DJ1，于2022年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.25972。

具体实施方式

本发明提供了一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)DJ1菌株，所述DJ1菌株的保藏编号为CGMCNo.25972。

本发明所述DJ1菌株优选从蔬菜根际土中利用抑菌圈法筛选得到，所述菌株DJ1革兰氏阳性、杆状、有芽孢。在LB培养基上培养48h后，菌落呈乳白色，圆形或椭圆形，不透明，表面光滑、有褶皱，边缘不整齐。可在20～～42℃、pH5～9、1％～5％NaCl条件下正常生长，能够利用山梨醇、甘露糖、果糖、蔗糖、NH

本发明所述生防作用优选包括拮抗病原细菌和病原真菌，所述病原细菌优选包括人类致病细菌和软腐病致病细菌；所述病原真菌优选包括植物致病真菌。本发明所述人类致病细菌优选包括大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；所述软腐病致病细菌优选包括白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum)、圆葱软腐病菌(Burkholderiagladioli)和娃娃菜软腐病菌(Pseudomonassp.)；所述植物致病真菌优选包括刺五加根腐病菌(Rhizoctoniasolani)、水稻绵腐病菌(Pythiumoryzae)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、豆角炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、玉米茎基腐病菌(Fusarium graminearum)和水稻恶苗病菌(Fusariummoniliforme)。

本发明还提供了上述DJ1菌株在制备生防制剂中的应用。

本发明所述DJ1菌株的抗菌谱广，可应用于制备生防制剂。

本发明还提供了一种防控植物细菌和/或真菌病害的方法，包括以下步骤：在植物生育期内接种上述DJ1菌株的菌制品。

本发明所述菌制品以预防植物细菌和/或真菌病害为主，因此主要在疾病发病前进行接种，所述接种的方法优选包括喷洒、灌根或拌土。本发明对于所述菌制品的剂型以及内容物并没有特殊限定，包含菌体、菌悬液和发酵上清液中任一种即可。

本发明还提供了一种具有生防作用的菌剂，包括上述DJ1菌株的菌体、菌丝、菌悬液或发酵上清液。

本发明还提供了上述菌剂的制备方法，包括将上述DJ1菌株经活化后，接种于LB液体培养基中进行培养，利用所述培养液制备所述菌剂。

本发明优选将-80℃保存的DJI菌株接种于LB平板上进行活化，挑单菌落于LB液体培养基30℃，160r/min培养24～48h，用以制备所述菌剂。本发明所述LB培养基优选包括：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、琼脂15-20g(液体培养基不加琼脂)、蒸馏水1000mL，pH7.2左右。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株具有生防作用的贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中如非特别说明，所用的试剂、材料和菌株均为本领域的常见材料：

供试病原细菌：白菜软腐病菌Pectobacteriumcarotovorum、圆葱软腐病菌Burkholderiagladioli、娃娃菜软腐病菌Pseudomonassp.(购于中科院微生物菌种保藏中心)、大肠杆菌EscherichiacoliATCC25922、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC25923、铜绿假单胞菌杆菌PseuduinonasaeniginasaATCC27853(本实验室保存)。

供试病原真菌：刺五加根腐病菌Rhizoctoniasolani、水稻绵腐病菌Pythiumoryzae、黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum、水稻稻瘟病菌Pyriculariaoryzae、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea、豆角炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、玉米茎基腐病菌Fusariumgraminearum、水稻恶苗病菌Fusariummoniliforme(本实验保存，所有供试真菌均已在专利中公开，201510762018.X)。

根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensNT1(华南农业大学赠送)。

供试蔬菜与试剂：白菜、圆葱、油菜来自市场。

群体感应信号因子(N-己酰基-L-高丝氨酸内酯、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯)购自(阿拉丁)。

培养基：LB培养基(胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、琼脂15-20g(液体培养基不加琼脂)、蒸馏水1000mL，pH7.2左右)；PDA培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH自然)；MSM培养基(硫酸铵2.0g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.2g、结晶氯化钙0.01g、七水合硫酸亚铁0.001g、蒸馏水1000mL，pH6.5)；MM培养基(硫酸铵2.0g，硫酸镁0.2g，无水氯化钙0.01g，硫酸亚铁0.005g，氯化锰0.002g，硫酸氢二钾10.5g，磷酸二氢钾4.5g，pH6.5)。

本发明实施例中，采用MEGA7.0、Excel2021、Origin2022和SPSS27统计软件构建系统发育树和进行分析处理试验数据。

实施例1

1、软腐病菌的培养

用LB平板划线活化-80℃保存的3种软腐病菌白菜软腐病菌、圆葱软腐病菌、娃娃菜软腐病菌，挑单菌落于LB液体培养基30℃，160r/min培养24h，测定菌数，用无菌水稀释至菌液浓度为1×10

2、拮抗细菌的筛选

采集白菜、黄瓜、番茄、辣椒、芹菜、茄子等蔬菜根际土。称取土样2g，放入盛有20mL无菌水的锥形瓶中，30℃，160r/min震荡培养1h，取1mL悬浮液进行倍比稀释，取10

采用稀释涂布法(崔双，陈昌龙，冯佳豪，曹颖，寇晓敏，付璐，张荣萍，谢华.魔芋软腐病致病菌Pectobacteriumaroidearum的特征及贝莱斯芽孢杆菌的生防效果[J].中国蔬菜，2021(03):83-93.)从蔬菜根际的20个土样中共分离到1012个细菌，以3种病原菌为靶标筛选出1株对3种病原菌均有抑菌活性的生防菌株DJ1，对白菜软腐病菌、圆葱软腐病菌、娃娃菜软腐病菌3株病原菌的抑菌圈直径分别为10.60mm、6.92mm和3.92mm(图1)。

3、拮抗细菌的鉴定

形态和生理生化特征鉴定：将筛选到的拮抗菌株用LB平板30℃培养24-48h，从颜色，形状，有无光泽，边缘是否整齐，有无凸起方面观察菌落形态。依据《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌鉴定手册》以及相关文献从耐盐性、生长温度、PH、柠檬酸盐利用、碳氮源利用、接触酶、氧化酶、甲基红、V-P、淀粉水解、吲哚、明胶液化等方面进行生理生化特性鉴定。

分子生物学鉴定：以细菌基因组DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR产物纯化后测序，所得序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，用MEGA5.1软件进行系统发育分析。

结果如图2所示，菌株DJ1革兰氏阳性、杆状、有芽孢(图2中a)。在LB培养基上培养48h后，菌落呈乳白色，圆形或椭圆形，不透明，表面光滑、有褶皱，边缘不整齐(图2中b)。可在20～42℃、pH5～9、1％～5％NaCl条件下正常生长，能够利用山梨醇、甘露糖、果糖、蔗糖、NH

表1菌株DJ1的生理生化特性

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注：表中“+”表示阳性，“-”表示阴性

4、拮抗细菌抑菌作用

对离体蔬菜软腐病菌的抑制作用：选取健康、外观完好无机械损伤的白菜、圆葱、娃娃菜，首先用75％酒精消毒，再用无菌水冲洗干净。参考Cui等(Cui W,He P,Munir S,etal.Biocontrol of Soft Rot of Chinese Cabbage Using an Endophytic BacterialStrain[J].Frontiers in Microbiology,2019,10:1471)方法并稍作修改，将叶片切成1.5cm×1.5cm左右小块，在无菌平皿内铺上两层滤纸，加入3mL无菌水，用灭菌枪头在切块的中部制造伤口，在伤口处先接种拮抗菌液5μL(约10

菌株DJ1对离体白菜、圆葱与娃娃菜菜软腐病菌具有较好的抑制活性，病原菌接种组48h后出现较大病斑，拮抗菌处理组仅在接种处出现较小病斑(图4a-c)，对离体白菜、圆葱与娃娃菜软腐病菌的抑菌率分别为84.30％、60.21％和69.96％(图4d)。

对白菜软腐病菌群体感应信号因子的降解活性：首先将菌株DJ1接种在含有5μmol·L

菌株DJ1对白菜软腐病菌群体感应信号因子的降解活性以N-己酰基-L-高丝氨酸内酯和N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯(5μmol·L

对白菜软腐病的田间小区防效：选取长势基本一致白菜植株，4个处理，每个处理50叶片。处理1：只接种病原菌，取1mL病原菌液用注射器点接在白菜叶靠近根部。处理2：先接种生防菌后接种病原菌，每个叶片先接种生防菌液3mL，再按处理1方法接种病原菌。处理3：只接种生防菌，每个叶片接种生防菌液3mL。处理4：无菌水对照，每个叶片接种无菌水3mL。处理3d后调查病情，并计算防效。

分级标准：

0级：无；1级：开始形成；3级：0.5cm<病斑直径≤1.0cm；5级：1cm<病斑直径≦2cm；7级：病斑直径>2cm。

病情指数(％)＝(病害级数×病害叶片数)/(最高病害级数×总叶片数)×100防病效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100

生防菌和无菌水对照组不发病，只接病菌组接种1d发病，3d病斑扩大(图7)，发病较重，病情指数为66.89％，生防菌处理组部分叶片发病，发病较轻，病情指数为13.48％，对软腐病的防效为77.91％(表2)。

表2菌株DJ1对白菜软腐病菌的田间小区防效

对病原真菌和人源性病原细菌的抑菌活性：采用对峙培养法(卢美欢，李利军，马英辉，陈雅寒，安德荣.埃吉类芽孢杆菌SWL-W8的鉴定及其对白菜软腐病的生物防治效果[J].农药学学报，2020，22(05):791-800.)测定拮抗细菌对8种病原真菌的抑菌性。采用抑菌圈法测定拮抗细菌对3种人源性病原细菌的抑菌活性。

菌株DJ1对其它病原菌的抑菌效果见如图6所示。菌株DJ1除了对3种蔬菜软腐病菌具有较好的抑制效果外，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌和水稻绵霉菌、黄瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、豆角炭疽病菌、玉米茎茎基腐病菌、水稻恶苗病菌、番茄灰霉病菌8种植物病原真菌也具有抑制作用，对绿脓杆菌无抑制作用。对黄瓜枯萎病菌抑制效果最好，抑制率为71.38％，对刺五加根腐病菌抑制效果较低，抑制率为37.84％。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。