SNP标记在近交系小鼠品系鉴定中的应用及引物序列

技术领域

本发明属于小鼠品系鉴定的技术领域，具体涉及一种SNP标记在近交系小鼠品系鉴定中的应用及引物序列。

背景技术

实验动物是指经人工饲育且对其携带的微生物实行控制、遗传背景明确或者来源清楚、用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。常见的实验动物有实验大鼠和实验小鼠，包括有数千种封闭群、近交系、重组同类系、重组近交系和突变系等品系。

在常见的、历史比较久的多种近交系小鼠品系中，各小鼠品系之间的遗传差异较大。但是，在表观遗传学性状上差异却并不大，几乎无法单纯从外观上来鉴定近交系小鼠品系。随着生命医学的发展，科研人员和商业对实验动物质量的要求越来越高。因此，对近交系小鼠品系的鉴定成了亟待解决的问题。

专利文献CN114507744A(以下称文献1)公开一种SNP标记在近交系小鼠品系鉴定中的应用以及鉴定引物序列，其采用15个SNP位点能够同时鉴定出C57BL/6J、C57BL/6N、BALB/c、FVB、DBA/2、CBA/CaJ和C3H 7种近交系小鼠品系。然而，一方面，该文献1需要采用15个SNP位点以及扩增这些SNP位点的15对引物序列才能对其公开的7种近交系小鼠品系进行鉴定，因此该文献1采用的SNP位点和扩增这些SNP位点的引物序列较多，而同时鉴定的近交系小鼠品系较少，增加了鉴定的成本；另一方面，该文献1在使用其公开的15对引物对15个SNP位点进行扩增时，针对每个样本需要进行15次扩增反应，因此操作繁琐，会造成鉴定花费的时间较多，降低了近交系小鼠品系的鉴定效率。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种SNP标记在近交系小鼠品系鉴定中的应用，其利用8个SNP位点中的多个或全部对10种近交系小鼠品系中的部分或全部进行鉴定，所述8个SNP位点分别命名为：SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8，所述近交系小鼠品系选自DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、和T739/Nifdc；其中：

所述SNP1的Ensembl rs编号为rs3023039，其等位基因为T或C；

所述SNP2的Ensembl rs编号为rs3089109，其等位基因为C或G；

所述SNP3的Ensembl rs编号为rs3712692，其等位基因为G或T；

所述SNP4的Ensembl rs编号为rs3022977，其等位基因为C或T；

所述SNP5的Ensembl rs编号为rs3709624，其等位基因为T或C；

所述SNP6的Ensembl rs编号为rs3022825，其等位基因为T或C；

所述SNP7的Ensembl rs编号为rs3089984，其等位基因为A或C；

所述SNP8的Ensembl rs编号为rs3023436，其等位基因为T或A。

本发明另一方面提供一种SNP标记在制备用于鉴定近交系小鼠品系的试剂盒或液相芯片中的应用，其中所述试剂盒或液相芯片用于检测所述近交系小鼠品系的8个SNP位点的等位基因；其中所述8个SNP位点分别命名为：SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8，所述近交系小鼠品系选自DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc。

本发明另一方面还提供一种用于扩增上述的SNP标记的引物组合，其中所述引物组合用于鉴定近交系小鼠品系，包括用于扩增SNP1位点的第一引物、用于扩增SNP2位点的第二引物、用于扩增SNP3位点的第三引物、用于扩增SNP4位点的第四引物、用于扩增SNP5位点的第五引物、用于扩增SNP6位点的第六引物、用于扩增SNP7位点的第七引物、用于扩增SNP8位点的第八引物，且所述近交系小鼠品系选自DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc。

在一些实施方式中，所述第一引物包括SNP1-F和SNP1-R，其中所述SNP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二引物包括SNP2-F和SNP2-R，其中所述SNP2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述SNP2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述第三引物包括SNP3-F和SNP3-R，其中所述SNP3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述SNP3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述第四引物包括SNP4-F和SNP4-R，其中所述SNP4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述SNP4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述第五引物包括SNP5-F和SNP5-R，其中所述SNP5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述SNP5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述第六引物包括SNP6-F和SNP6-R，其中所述SNP6-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述SNP6-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述第七引物包括SNP7-F和SNP7-R，其中所述SNP7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述SNP7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；所述第八引物包括SNP8-F和SNP8-R，其中所述SNP8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述SNP8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明又一方面提供一种上述的引物组合在制备用于鉴定近交系小鼠品系的试剂盒或液相芯片中的应用，其中所述近交系小鼠品系选自DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc。

本发明再一方面提供一种用于鉴定近交系小鼠品系的试剂盒或液相芯片，其中所述试剂盒或液相芯片包括：A.引物组合，其包括用于扩增SNP1位点的第一引物、用于扩增SNP2位点的第二引物、用于扩增SNP3位点的第三引物、用于扩增SNP4位点的第四引物、用于扩增SNP5位点的第五引物、用于扩增SNP6位点的第六引物、用于扩增SNP7位点的第七引物、用于扩增SNP8位点的第八引物。

在一些实施方式中，所述试剂盒或液相芯片还包括：

B.分别针对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位点的野生型和突变型特异性ASPE引物，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：针对SNP1位点的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、针对SNP2位点的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、针对SNP3位点的SEQ ID NO:21和SEQID NO:22、针对SNP4位点的SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、针对SNP5位点的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、针对SNP6位点的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、针对SNP7位点的SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30、针对SNP8位点的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中的一种或多种；进一步可选地，所述tag序列为选自SEQ ID NO:33-40中的序列；和

C.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列相应地与B中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自SEQ ID NO:51-58中的序列，且针对相同的SNP位点的所述磁球具有不同的颜色编号。

在一些实施和方式中，所述试剂盒或液相芯片包括以下1)-8)中的一组或多组：

1)针对SNP1位点的由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52；

2)针对SNP2位点的由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:35组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:36组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；

3)针对SNP3位点的由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:34组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:37组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:58；

4)针对SNP4位点的由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:36组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:56；

5)针对SNP5位点的由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:39组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57；

6)针对SNP6位点的由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:40组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:35组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:53；

7)针对SNP7位点的由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:40组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:38组成的突变型ASPE引物，相应的anti-tag序列为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56；

8)针对SNP8位点的由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58。

本发明再一方面还提供一种近交系小鼠品系SNP的检测方法，其使用上述的试剂盒或液相芯片，所述近交系小鼠品系选自DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc。

在一些实施方式中，所述检测方法使用上述的试剂盒或液相芯片，包括以下步骤：

(1)PCR扩增待测近交系小鼠品系的DNA样品，获得PCR扩增产物；

(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理，获得纯化产物；

(3)用所述特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，获得带有多个生物素标记的反应后产物；

(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应，获得杂交产物；

(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，得到反应产物；

(6)通过荧光检测仪对所述反应产物进行检测，获得所述近交系小鼠品系的SNP位点。

在一些实施方式中，在步骤(1)中，以引物组合中的第三引物、第四引物、第五引物和第六引物为一组对所述近交系小鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增，和/或以引物组合中的第一引物、第二引物、第七引物和第八引物为一组对所述近交系小鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增。

本发明再一方面还提供一种鉴定近交系小鼠品系的方法，其在上述的检测方法的基础上还包括以下步骤：(7)利用获得的所述近交系小鼠品系的SNP位点的等位基因鉴定近交系小鼠品系；鉴定过程包括：根据SNP1位点的分型结果将DBA/2Nifdc与其他近9种交系小鼠品系鉴别开来，根据SNP2位点的分型结果进一步将FVB/NJNjuNifdc与剩下8种交系小鼠品系鉴别开来，随后根据SNP3位点的分型结果将BALB/cJNifdc与剩余7种交系小鼠品系鉴别开来，根据SNP4位点的分型结果进一步将C57BL/6JNifdc和C57BL/6JNifdc-bg与剩下的5种交系小鼠品系鉴别开来，再根据SNP5位点的分型结果将C57BL/6JNifdc和C57BL/6JNifdc-bg鉴别开来，进而利用5个SNP位点将以下5种近交系小鼠品系鉴别开来：DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc和C57BL/6JNifdc-bg。

在一些实施方式中，所述鉴定过程还包括：将剩余的5种交系小鼠品系根据SNP6位点的分型结果分为NPI、NCPC/2Nifdc和NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc两部分，其中NPI和NCPC/2Nifdc根据SNP7位点的分型结果进行鉴别，NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc和T739/Nifdc先根据SNP7位点的分型结果将NU/JNifdc鉴别开来，再根据SNP8位点的分型结果将C3H/HeJNifdc和T739/Nifdc鉴别开来，进而利用8个SNP位点将以下10种近交系小鼠品系鉴别开来：DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc。

基于以上技术方案提供的用于鉴定近交系小鼠品系的SNP标记包括8个SNP位点，利用这8个SNP位点中的多个可以对10种近交系小鼠品系(包括DBA/2Nifdc、FVB/NJNjuNifdc、BALB/cJNifdc、C57BL/6JNifdc、C57BL/6JNifdc-bg、NPI、NCPC/2Nifdc、NU/JNifdc、C3H/HeJNifdc、T739/Nifdc)中的多个或全部进行鉴定，因此相对于上述文献1公开的使用15个SNP标记对7种近交系小鼠品系进行鉴定的方法，本发明使用的SNP标记更为精简，且鉴定的近交系小鼠品系更丰富，可以有效节约成本。另一方面，在本发明提供的用于扩增8个SNP位点的8对引物中，可以将其分成两组，分别对近交系小鼠品系的DNA样品进行四重PCR扩增，因此针对每个样本只需要两次PCR扩增反应即可，相对于上述文献1公开的针对每个样本需要进行15次PCR扩增反应的方法，可以有效简化操作，节约时间，从而近交系小鼠品系的鉴定效率。

附图说明

图1为使用针对SNP1-16位点的PCR引物分别对10个近交系小鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的产物的凝胶电泳图像；其中A幅表示使用针对SNP1-8位点的PCR引物的凝胶电泳图像，B幅表示使用针对SNP9-16位点的PCR引物的凝胶电泳图像。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。文中“第一”、“第二”、……、和“第八”等适用于区分类似的对象，不作为特定顺序或先后次序的限定，也不作为对象个数的限定。

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1：用于鉴定近交系小鼠品系的SNP标记的确定及扩增SNP位点的引物设计

1.1、用于鉴定近交系小鼠品系的SNP标记的筛选

PETKOV P M等人(PETKOV P M,CASSELL M A,SARGENT E E，et al.Developmentof a SNP genotyping panel for genetic monitoring of the laboratory mouse[J].Genomics,2004,83(5):902-911)已经公开多个可用于实验小鼠遗传质量检测的SNP位点，本发明人从中筛选出多组SNP标记，如以下表1和表2所示，示出了其中的两组SNP标记(分别命名为第一组SNP标记和第二组SNP标记)，以从中确定可用于对10种近交系小鼠品系(包括DBA/2Nifdc(简称DBA/2)、FVB/NJNjuNifdc(简称FVB)、BALB/cJNifdc(简称BALB/cJ)、C57BL/6JNifdc(简称C57BL/6)、C57BL/6JNifdc-bg(简称C57BL/6-bg)、NPI、NCPC/2Nifdc(简称NCPC/2)、NU/JNifdc(简称NU/J)、C3H/HeJNifdc(简称C3H)、T739/Nifdc(简称T739))进行鉴定的SNP标记。

表1：第一组SNP标记的SNP位点及其位置和等位基因信息

表2：第二组SNP标记的SNP位点及其位置和等位基因信息

1.2、针对SNP位点的PCR引物的设计

根据上述步骤1.1中筛选的两组SNP标记(表1和表2所示)的SNP位点信息，分别在UCSC数据库中查找各SNP位点附近的碱基序列，用primer 6.0软件设计能扩增含SNP位点的PCR引物，并使其扩增产物的片段大小要相差50-100bp左右，以便用电泳的方法进行区分，具体引物序列见表3和表4所示，引物是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。

表3：针对SNP1-8位点的PCR引物

表4：针对SNP9-16位点的PCR引物

发明人分别利用上述表1和表2所示的SNP标记按照以下实施例2中的方法对10种近交系小鼠品系(包括DBA/2、FVB、BALB/cJ、C57BL/6、C57BL/6-bg、NPI、NCPC/2、NU/J、C3H、T739)进行鉴定，结果表明只有表1所示的第一组SNP标记能够将以上10种近交系小鼠品系全部鉴定出来(请参照以下实施例2的鉴定结果)，因此本发明确定使用表1所示的第一组SNP标记对以上10种近交系小鼠品系进行鉴定。

实施例2：10种近交系小鼠品系的鉴定

该实施例利用上述实施例1确定的表1所示的SNP标记以及表3所示的针对SNP1-8位点的PCR引物对10种近交系小鼠品系(包括DBA/2、FVB、BALB/cJ、C57BL/6、C57BL/6-bg、NPI、NCPC/2、NU/J、C3H、T739)进行鉴定，鉴定方法具体包括以下操作。

2.1、近交系小鼠品系的DNA样品的提取

该步骤中使用市售血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对小鼠的基因组DNA进行提取，参照试剂盒说明书具体包括以下步骤：

(1)剪取鼠尾1-2cm，放入1.5mL的EP管中。先加入50μL蛋白酶K，再向EP管中加入500μL提取缓冲液。用封口膜封闭好，混合均匀后置于浮漂上，53.5℃水浴锅中过夜，期间上下混匀几次。注意水浴锅中放足量纯化水，盖好盖子。

(2)第二天，从水浴锅中取出浮漂，将EP管从浮漂上取下，加入500μL Tris-酚溶液，混匀后离心12000rpm/min，2min，取上清放入新的EP管中，吸取上清时要注意将枪头紧贴EP管壁不要将下层油状物吸起。

(3)在步骤(2)的新的EP管中加入与吸取的上清溶液等体积的氯仿：异戊醇(24：1)混合液，注意通风。充分颠倒混匀后置于离心机中离心12000rpm/min，2min，取上清放入新的EP管中。

(4)在步骤(3)的新的EP管中加入25μL醋酸铵，750μL异丙醇，轻轻上下适当混匀，可以看到明显的絮状沉淀。离心12000rpm，5min。

(5)一次性倾倒EP管中液体，加入70％乙醇500μL，上下轻晃混匀后离心12000rpm，5min，弃上清。

(6)将弃完上清的EP管放在滤纸上置于室温30min左右，待完全除去乙醇后，加入200μL已配制好的TE溶液溶解。于-20℃保存备用。

(7)待提取的DNA溶液在4℃冰箱稳定1-2天后，使用1.6％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

按照上述步骤(1)-(7)分别提取获得10种近交系小鼠品系的基因组DNA样品。

2.2、近交系小鼠品系的基因组DNA的PCR扩增

该步骤中分别使用上述实施例1中表3和表4的PCR引物对上述步骤2.1提取获得的10种近交系小鼠品系的基因组DNA样品进行PCR扩增(人工合成的质粒作为阳性对照，无菌水作为阴性对照)，得到每个近交系小鼠品系的PCR扩增产物，其中PCR反应体系和程序分别如下表5和表6所示。在使用表3所示的PCR引物对近交系小鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增时，以分别针对SNP3-6位点的PCR引物为一组进行四重PCR扩增，以分别针对SNP1、2、7、8位点的PCR引物为一组进行四重PCR扩增；在使用表4所示的PCR引物对近交系小鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增时，以分别针对SNP9、11、14、15位点的PCR引物为一组进行四重PCR扩增，以分别针对SNP10、12、13、16位点的PCR引物为一组进行四重PCR扩增。

表5：多重PCR反应体系

表6：多重PCR反应程序

2.3、多重PCR产物的电泳检测

配制2.5％的琼脂糖凝胶：在40mL的1×TAE溶液中加入1.0g琼脂糖，加入Ex Red染液(注意：染液与琼脂糖凝胶的比例为1：10000)，混匀后放入微波炉，加热数次后至溶液透明无气泡，过程中要随时注意琼脂糖凝胶是否从三角瓶冒出，若冒出应立即停止加热，将加热时间变短，随后将溶解好的溶液倒入胶板，插上梳子，室温放置20-30min。

取5μLPCR扩增产物加入1μL 6×DNA loading buffer混匀加入电泳槽进行电泳检测，使用50bp的DNA marker作为条带的位置参照。在130V电泳30min，之后使用紫外凝胶成像系统扫描拍照。如图1所示，示出了凝胶电泳胶图，其中A幅表示使用表3所示的PCR引物分别对10个近交系小鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的结果，B幅表示使用表4所示的PCR引物分别对10个近交系小鼠品系的基因组DNA进行PCR扩增的结果。

2.4、多重PCR产物的纯化

多重PCR反应结束后会有扩增剩余的dNTP、引物、单链产物等，会影响后续的ASPE延伸反应，使用ExoⅠ可除去扩增剩余的引物和单链产物，SAP酶除去PCR产物中剩余的引物、单链DNA以及剩余的dNTPs，尤其是dCTP。该步骤使用ExoSAP-IT试剂盒(购自美国USB公司)在每10μL多重PCR产物中加入1μL的Exo-SAP混合液，随后在37℃反应30min，在80℃15min使酶灭活，获得纯化的多重PCR产物。

2.5、位点特异性引物延伸反应(ASPE)

该步骤利用设计的位点特异性引物对上述步骤2.4纯化的多重PCR产物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，从而使反应后的产物带上多个生物素标记。

2.5.1、位点特异性引物(ASPE引物)的设计

每条ASPE引物(退火温度应位于51-56℃之间)包括两个部分，5’端为针对相应磁球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该步骤设计的分别针对SNP1-8位点的ASPE引物如下表7所示，设计的分别针对SNP9-16位点的ASPE引物如下表8所示。

表7：分别针对SNP1-8位点的ASPE引物序列信息

表8：分别针对SNP9-16位点的ASPE引物序列信息

2.5.2、ASPE反应体系和反应程序

ASPE反应体系选择Luminex公司操作指南上推荐的20μL体系，具体如下表9所示。

表9：ASPE反应体系

将PCR扩增仪按照下表10的反应程序进行设置后，将配好的ASPE反应体系放进去进行ASPE反应，得到ASPE延伸的反应产物。

表10：ASPE反应程序

2.6、杂交反应

2.6.1、磁球的选择以及anti-tag序列包被

该步骤根据上述表7和表8设计的ASPE引物，选择相应的磁球(磁球浓度均为2.5×10

表11：磁球的颜色编码以及携带的anti-tag序列

磁球包被anti-tag序列的过程如下：

分别取5×10

2.6.2、ASPE延伸的PCR产物与包被有anti-tag序列的磁球的杂交反应

Luminex用户指南上推荐的杂交方法分为两种，清洗磁球的方法和不清洗磁球的方法，本实施例采取不清洗磁球的方法：

(1)在使用前将磁球使用涡旋振荡器振荡30-60s，防止无法吸到沉淀到瓶底的磁球，每种编码的磁球吸取10μL，配制成为磁球原液，随后将原液稀释成为工作液，工作液浓度大约为50个/μL，吸取22.5μL的磁球工作液至PCR八连排的反应管中；

(2)向反应管中加入2.5μL待测的ASPE延伸的反应产物，使得总反应体积为25μL；

(3)阴性对照加入2.5μLddH

(4)做好标记后将PCR八连排管放在涡旋振荡仪上混匀后放入微型离心机中离心10s左右，随后放入PCR扩增仪，反应条件为：96℃变性90sec，之后在37℃反应30min；

(5)取100μL含有8μg/mL链霉亲和素藻红蛋白和0.01％BSA的1×杂交缓冲液添加到PCR八连排反应管中，使用移液器缓慢吹打，切记不可使用涡旋振荡仪振荡混匀，将沉淀的磁球进行重悬；

(6)再次将PCR八连排反应管放入PCR扩增仪中进行链霉亲和素藻红蛋白杂交。将温度调节至37℃，在此温度下反应20min，反应结束后即可使用Luminex200仪器进行检测，系统输出数值为中位数荧光值(median fluorescence intensity，MFI)；

(7)使用Luminex仪器检测样品前要先打开机器预热30min，随后进行仪器的验证，验证结束后方可进行样品检测，注意要随时调整探针的高度；

(8)样品检测结束之后需要对检测探针进行清洗，在校正板的相应位置加入去离子水和84消毒液来进行探针清洗，清洗结束之后则可关闭软件，注意要定期清理废液桶中的废液。

2.7、数据分析

经上述步骤2.6.2的杂交反应后，使用Luminex200阅读系统分别激发红色激光和绿色激光对磁球体系进行检测，输出数值为中位数荧光值(median fluorescenceintensity，MFI)，以此来计算等位基因MFI比率，等位基因MFI比率＝MFI

使用表1所示的第一组SNP标记的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表12和表13所示，使用表2所示的第二组SNP标记的Luminex检测结果和计算的等位基因MFI比率分别如下表14和表15所示。

/>

由上述表13所示的等位基因MFI比率计算结果可知，可以根据rs3023039位点的分型结果将DBA/2品系与其他近交系小鼠品系鉴别开来，根据rs3089109位点的分型结果可进一步将FVB品系小鼠与剩下8个品系小鼠区分开来，随后根据rs3712692位点的分型结果可将BALB/cJ品系与剩余7个品系区分开来，根据rs3022977位点的分型结果可进一步将C57BL/6和C57BL/6-bg品系与剩下的5个品系区分开来，再根据rs3709624位点的分型结果将C57BL/6与C57BL/6-bg区分开来，剩余的5个品系根据rs3022825位点的分型结果可分为NPI、NCPC/2和NU/J、C3H、T739两部分，前两个品系(NPI、NCPC/2)可根据rs3089984位点的分型结果进行区分，后三个品系(NU/J、C3H、T739)可先根据rs3089984位点的分型结果将Nu/J区分出来，再根据rs3023436位点的分型结果使得C3H和T739区分开来。因此可见本发明提供的包括SNP1-8这8个SNP位点的第一组SNP标记可以将10种近交系小鼠品系(包括DBA/2、FVB、BALB/cJ、C57BL/6、C57BL/6-bg、NPI、NCPC/2、NU/J、C3H、T739)区分开来，进而实现这10种近交系小鼠品系的鉴定。

由上表15所示的等位基因MFI比率计算结果可知，可以根据rs3023039位点的分型结果将DBA/2品系与其他近交系小鼠品系鉴别开来，再根据rs3023450位点的分型结果可将C57BL/6品系小鼠与剩下8个品系小鼠区分开来，随后根据rs3022977位点的分型结果可将C57BL/6-bg品系与剩余7个品系区分开来，根据rs3023442位点的分型结果可进一步将BALB/cJ品系与剩下的6个品系区分开来，再根据rs3022883位点的分型结果可进一步将T739品系与剩下的5个品系区分开来，再根据rs3023436位点的分型结果可进一步将Nu/J品系与剩下的4个品系区分开来，随后再根据rs3022825位点的分型结果可见一步将FVB和C3H品系与剩下的NPI和NCPC/2品系区分开来，然而却不能将FVB和C3H品系进一步区分，即随后再根据rs3023226位点的分型结果也不能将NPI和NCPC/2品系进一步区分开来。因此可见包括SNP9-16这8个SNP位点的第二组SNP标记不能将10种近交系小鼠品系(包括DBA/2、FVB、BALB/cJ、C57BL/6、C57BL/6-bg、NPI、NCPC/2、NU/J、C3H、T739)区分开来，最多仅能鉴定其中的6种近交系小鼠品系(包括DBA/2、BALB/cJ、C57BL/6、C57BL/6-bg、NU/J、T739)。

实施例3：用于鉴定近交系小鼠品系的试剂盒或液相芯片

该实施例提供了一种用于鉴定10种近交系小鼠品系的试剂盒或液相芯片，其中所述10种近交系小鼠品系包括DBA/2、FVB、BALB/cJ、C57BL/6、C57BL/6-bg、NPI、NCPC/2、NU/J、C3H、T739，提供的试剂盒或液相芯片包括以下组分：

A.实施例1中表3所示的分别用于扩增SNP1-8位点的PCR引物中的一对或多对引物；

B.分别针对SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位点的野生型和突变型特异性ASPE引物中的一条或多条，其中每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成；可选地，所述特异性引物序列包括：实施例2中表7所示的针对SNP1位点的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、针对SNP2位点的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、针对SNP3位点的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、针对SNP4位点的SEQ ID NO:23和SEQID NO:24、针对SNP5位点的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、针对SNP6位点的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、针对SNP7位点的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、针对SNP8位点的SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32中的一种或多种；进一步可选地，所述tag序列为选自实施例2中表7中的SEQ ID NO:33-40中的序列；和

C.分别包被有特异性anti-tag序列的磁球，所述anti-tag序列能相应地与B中所述tag序列互补配对；可选地，所述anti-tag序列为选自表11中的SEQ ID NO:51-58中的序列，且针对相同的SNP位点的所述磁球具有不同的颜色编号。

具体地，该实施例提供的试剂盒或液相芯片包括以下1)-8)中的一组或多组：

1)针对SNP1位点的由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:34组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52；

2)针对SNP2位点的由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:35组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:36组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；

3)针对SNP3位点的由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:34组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:37组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:58；

4)针对SNP4位点的由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:36组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:38组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:56；

5)针对SNP5位点的由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:33组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:39组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57；

6)针对SNP6位点的由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:40组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:35组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:53；

7)针对SNP7位点的由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:40组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:38组成的突变型ASPE引物，相应的anti-tag序列为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56；

8)针对SNP8位点的由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39组成的野生型特异性ASPE引物以及由SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37组成的突变型特异性ASPE引物，相应的特异性anti-tag序列为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58。

另外，在本发明提供的试剂盒或液相芯片中还包括使用该试剂盒或液相芯片检测近交系小鼠品系的SNP位点的方法或鉴定近交系小鼠品系的方法，其中：

检测近交系小鼠品系的SNP位点的方法包括以下步骤：

(1)使用试剂盒或液相芯片中提供的PCR引物分别扩增(可以采用多重PCR扩增的方式，也可以采用单重PCR扩增的方式)获自待测近交系小鼠品系的DNA样品，获得PCR扩增产物；

(2)将获得的PCR扩增产物进行纯化处理，获得纯化产物；

(3)用试剂盒或液相芯片中提供的特异性ASPE引物对获得的纯化产物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，获得带有多个生物素标记的反应后产物；

(4)将对应所述特异性ASPE引物的包被有特异性anti-tag序列的磁球与所述带有多个生物素标记的反应后产物进行杂交反应，获得杂交产物；

(5)将所述杂交产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，得到反应产物；

(6)通过荧光检测仪对所述反应产物进行检测，获得所述近交系小鼠品系的SNP位点。

鉴定近交系小鼠品系的方法在上述提供的检测近交系小鼠品系的SNP位点的方法的基础上还包括以下步骤：

(7)利用获得的所述近交系小鼠品系的SNP位点的等位基因鉴定近交系小鼠品系。鉴定过程包括：根据rs3023039位点(SNP1)的分型结果将DBA/2与其他9种近交系小鼠品系鉴别开来，根据rs3089109位点(SNP2)的分型结果进一步将FVB与剩下8种近交系小鼠品系鉴别开来，随后根据rs3712692位点(SNP3)的分型结果将BALB/cJ与剩余7种近交系小鼠品系鉴别开来，根据rs3022977位点(SNP4)的分型结果进一步将C57BL/6和C57BL/6-bg与剩下的5种近交系小鼠品系鉴别开来，再根据rs3709624位点(SNP5)的分型结果将C57BL/6与C57BL/6-bg鉴别开来，实现利用5个SNP位点鉴别区分5种近交系小鼠品系；进一步地，该鉴定过程还包括将剩余的5种近交系小鼠品系根据rs3022825位点(SNP6)的分型结果分为NPI、NCPC/2和NU/J、C3H、T739两部分，前两个品系(NPI、NCPC/2)根据rs3089984位点(SNP7)的分型结果进行区分，后三个品系(NU/J、C3H、T739)先根据rs3089984位点(SNP7)的分型结果将Nu/J区分出来，再根据rs3023436位点(SNP8)的分型结果使得C3H和T739区分开来，进而实现利用8个SNP位点鉴别区分10种近交系小鼠品系。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。