一种PEMV-1和PEMV-2的RT-PCR同步检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明申请涉及植物保护领域，具体涉及同步检测PEMV-1和PEMV-2的方法及其试剂盒的组装。

背景技术

豌豆耳突花叶病毒1号(pea enation mosaic virus 1，PEMV-1)常与豌豆耳突花叶病毒2号(pea enation mosaic virus 2，PEMV-2)复合侵染引起豌豆耳突花叶病，病毒侵染豌豆后症状表现为植株生长扭曲，发育迟缓，花叶，叶片黄化并有坏死斑，叶脉褪绿，叶片皱缩、卷曲，在叶背及豆荚上有时会有耳状突起，病株的豆荚常畸形，结实率显著降低。PEMV-1和PEMV-2这两种病毒往往同时存在于同一寄主植物中，因此最早的报道中认为PEMV-1与PEMV-2是同一种病毒的两个RNA组分，后来通过对PEMV-1和PEMV-2的基因组RNA进行详细分析，发现PEMV-1与PEMV-2是两种不同的病毒，PEMV-1归属于耳突花叶病毒属(Enamovirus)，PEMV-2则属于幽影病毒属(Umbravirus)。近年来，PEMV-1、PEMV-2陆续在云南省的多种作物上被检测出来，这2种病毒经常发生复合侵染。虽然PEMV-1和PEMV-2引起的病毒病目前尚未在我国大面积流行，但一旦爆发将会影响豌豆、蚕豆乃至其他作物正常的生长发育，造成严重的损失。因此，加强对PEMV-1与PEMV-2引起的豌豆耳突花叶病的监测、预防和控制显得尤为重要。但对PEMV-1与PEMV-2的检测至少需要进行两次RT-PCR才可完成，检测过程耗时长，检测成本高。为此，建立一种PEMV-1与PEMV-2同步检测体系，用一步法RT-PCR同时检测出一个样品中所含有的两种病毒，不仅能大大缩短检测时间，节约检测成本，而且能为PEMV-1与PEMV-2引起的豌豆耳突花叶病的监测、预防和控制提供强有力的技术支撑。

发明内容

为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供一种PEMV-1和PEMV-2的RT-PCR同步检测试剂盒及检测方法，提高PEMV-1与PEMV-2的检测效率，为PEMV-1与PEMV-2引起的豌豆耳突花叶病的监测、预防和控制提供技术支撑。

本发明申请第一方面提供了引物组合，包括第一引物组合和/或第二引物组合；

所述第一引物组合，具有：

(I).上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和

(II).下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(III).如(I)、(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个至10个；或

(IV).与(I)、(II)、(III)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或

所述第二引物组合，具有：

(I).上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和

(II).下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或

(III).如(I)、(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个至10个；或

(IV).与(I)、(II)、(III)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

本发明申请第二方面提供了检测试剂盒，包括上述的引物组合，以及可接受的辅料和/或助剂。

本发明申请第三方面提供了PEMV-1和PEMV-2同步检测的方法，包括使用上述的引物组合对待测样品进行扩增、检测；

或使用上述的试剂盒对待测样品进行扩增、检测。

进一步的，所述检测的体系包括：5.0μL 2×1step Buffer，2.5μL RNase Freewater，0.4μLPrime

进一步的，所述检测的扩增程序为：

50℃反转录30min；94℃2min，然后94℃30s、60℃30s、72℃1min，共进行35个循环，72℃10min，4℃冷却保存。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明申请。

本发明的有益技术效果：

本发明进行一次反应即可实现对PEMV-1、PEMV-2两种病毒的同步检测，较传统RT-PCR检测一次只能检测一种病毒更具高效性，且降低了检测成本，节约了检测时间。该检测体系中的试剂用量和RT-PCR反应程序固定，针对PEMV-1、PEMV-2的检测只需按照本发明的使用方法进行操作即可，极大地便利了PEMV-1、PEMV-2的检测。

附图说明

图1A为本发明申请中初步建立的PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测体系对豌豆样品中PEMV-1、PEMV-2的扩增结果；图1B为本发明申请中优化后的PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测体系对豌豆样品中PEMV-1、PEMV-2的扩增结果

其中：M：2000DNA Marker；1-3：PEMV-1、PEMV-2复合侵染的田间豌豆样品；CK：健康的豌豆样品；

图2为本发明申请中PEMV-1、PEMV-2同步检测技术体系特异性分析

其中：M：2000DNA Marker；1：被PEMV-1、PEMV-2复合侵染的豌豆样品；2：被PLRV侵染的烟草样品；3：被TuMV侵染的烟草样品；4：被TMV侵染的烟草样品；5：被ToMMV侵染的烟草样品；6：被CMV、ASGV、ACVA复合侵染的乌头样品；CK：阴性对照(ddH

图3为本发明申请中PEMV-1、PEMV-2同步检测技术体系的灵敏度分析

其中：M：2000DNA Marker；0-9：依次为稀释10

图4为本发明申请中PEMV-1、PEMV-2同步检测试剂盒示意图

图5为利用同步检测试剂盒对田间样品中PEMV-1、PEMV-2的检测结果

其中：M：2000DNA Marker；1-10：采集的植物样品；CK:阴性对照(ddH

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然附图中显示了本发明申请的可选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整，并且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。

本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

以下结合附图对本发明申请PEMV-1和PEMV-2的RT-PCR同步检测试剂盒及方法进行详细说明，具体如下：

本发明首先根据GenBank中PEMV-1(OK030721)、PEMV-2(OK030734)的基因组全序列，设计了三对两种病毒的特异性检测引物，经过反复实验筛选出PEMV-1、PEMV-2特异性检测引物各一对用于RT-PCR同步检测技术体系的构建和优化。通过对反应条件与反应体系的反复摸索优化，最终确定PEMV-1与PEMV-2一步法RT-PCR同步检测技术体系为：5.0μL 2×1step Buffer，2.5μL RNase Free water，0.4μL Prime

为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1：PEMV-1与PEMV-2一步法RT-PCR同步检测技术体系的初步建立与优化

1、实验材料

被PEMV-1、PEMV-2单独侵染、复合侵染以及健康的豌豆样品，保存于实验室-80℃超低温冰箱。

2、PEMV-1、PEMV-2特异性检测引物设计

根据GenBank中PEMV-1(OK030721)、PEMV-2(OK030734)的基因组全序列，设计了三对两种病毒的特异性检测引物，经过反复实验筛选出PEMV-1、PEMV-2特异性检测引物各一对用于同步RT-PCR检测技术体系的构建和优化。引物由深圳华大基因科技公司合成，引物序列见表1。

表1 PEMV-1和PEMV-2同步RT-PCR检测引物序列

Table 1Primers used for PEMV-1 and PEMV-2simultaneous detection

3、CTAB法提取植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板

取2mL灭菌离心管分别加入1大5小灭菌钢珠，称取0.1g左右病叶至离心管中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％巯基乙醇)，-80℃冰箱中预冷3～5min后于高通量组织研磨仪60Hz、90s研磨3次；65℃温浴45～60min；12000r/min离心10min，取650μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋震荡混匀30s；12000r/min离心10min，小心转移500μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入350μL异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 75％乙醇，12000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10～15min；加入30～50μLddH

4、PEMV-1与PEMV-2一步法RT-PCR同步检测技术体系的初步建立

将田间采集到并经常规RT-PCR技术检测，确定同时感染了PEMV-1、PEMV-2的样品作为建立PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测反应体系的核酸模板。根据Prime

5、PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测反应体系的优化

初步建立的一步法PEMV-1、PEMV-2同步检测体系虽然能够实现PEMV-1、PEMV-2的同时检测，但是检测效果不稳定，因此，对该体系的引物体积重新设置了3组不同体积组合进行调整优化(如表2所示)。基于最优引物浓度体系，对PCR反应的退火温度也进行了优化。根据2对引物的Tm值，设置退火温度梯度为57℃、58℃、59℃、60℃共4个梯度，筛选出最佳退火温度。

表2 PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测体系不同引物体积组合

Table 2 Volume combinations of differentprimers for one-step PEMV-1and PEMV-2 simultaneous detection system

6、琼脂糖凝胶电泳检测

取7～10μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中电泳40min后在紫外凝胶成像系统下观察结果。

7、检测结果分析针对PEMV-1、PEMV-2在豌豆上复合侵染的现象，设计这2种病毒的特异性引物对PEMV-1dF/PEMV-1dR、PEMV-2dF/PEMV-2dR，2种引物对的目标条带大小相差370bp。根据

实施例2 PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测技术体系的特异性分析

1、实验材料

经常规RT-PCR验证感染了PEMV-1、PEMV-2的豌豆样品，感染了PLRV、TuMV、TMV、ToMMV的烟草样品，以及被CMV、ASGV、ACVA复合侵染的乌头样品。

2、CTAB法提取植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板

取2mL灭菌离心管分别加入1大5小灭菌钢珠，称取0.1g左右病叶至离心管中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％巯基乙醇)，-80℃冰箱中预冷3～5min后于高通量组织研磨仪60Hz、90s研磨3次；65℃温浴45～60min；12000r/min离心10min，取650μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋震荡混匀30s；12000r/min离心10min，小心转移500μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入350μL异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 75％乙醇，12000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10～15min；加入30～50μLddH

3、一步法多重RT-PCR扩增

所述一步法多重RT-PCR的反应体系为5.0μL 2×1step Buffer，2.5μLRNase Freewater，0.4μLPrime

4、特异性分析

选取经常规RT-PCR验证感染了PEMV-1、PEMV-2的豌豆样品，感染了PLRV、TuMV、TMV、ToMMV的烟草样品，以及被CMV、ASGV、ACVA复合侵染的乌头样品，利用建立的PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测体系对其进行扩增。扩增反应结束后取9μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中100V电压下电泳45min，观察结果。将扩增得到的目标条带利用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPerp柱式DNA胶回收试剂盒(SanPerp ColumnDNA Gel Extraction Kit)进行割胶回收，然后将割胶回收产物与pMD 19-TVector连接进行克隆。取1μL菌液用相应的引物进行PCR验证后，每个扩增片段选2个阳性克隆菌液送深圳华大基因科技有限公司进行测序，所获序列在NCBI的BLAST上进行比对分析。

5、结果与分析

用建立的PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测体系对同时被PEMV-1、PEMV-2复合侵染的豌豆样品，以及分别被PLRV、TuMV、TMV、ToMMV侵染的烟草样品和被CMV、ASGV、ACVA复合侵染的乌头样品进行检测，检测结果显示：该体系只能特异性地检测出豌豆样品中的PEMV-1和PEMV-2，但不能扩增出烟草样品中的PLRV、TuMV、TMV、ToMMV，以及乌头样品中的CMV、ASGV、ACVA(如图2)。将扩增得到的约850kb(PEMV-1)、约480bp(PEMV-2)扩增产物分别进行割胶纯化、克隆测序，经NCBI序列比对，约850kb的扩增片段与GenBank中登录的PEMV-1(OK030721)核苷酸序列一致性最高，达98.83％；约480bp的扩增产物与GenBank中登录的PEMV-2(MT481990)核苷酸序列一致性最高，达99.59％，表明所建立的一步法双重RT-PCR技术从感病豌豆样品中得到的约850bp、约480bp条带是PEMV-1、PEMV-2相应的扩增产物。综上可知，该一步法PEMV-1、PEMV-2同步检测试剂盒的特异性强，只能检测出PEMV-1和PEMV-2，而不能检测出其他病毒，可用于田间样品PEMV-1、PEMV-2的检测。

实施例3PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测技术体系的灵敏度分析

1、实验材料

取等体积被PEMV-1、PEMV-2复合侵染的豌豆样品核酸依次进行10倍倍比稀释，获取10

2、一步法多重RT-PCR扩增

所述一步法多重RT-PCR的反应体系为5.0μL 2×1step Buffer，2.5μLRNase Freewater，0.4μLPrime

3、灵敏度分析

利用建立的PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测体系，将感染了PEMV-1、PEMV-2的样品核酸模板由原来的2393.6ng/μL稀释为10

4、结果与分析

将感染了PEMV-1、PEMV-2的样品核酸模板(2393.6ng/μL)进行10

实施例4PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测试剂盒的组装与使用方法

1、PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测试剂盒的组装

PEMV-1、PEMV-2同步检测试剂盒(示意图见图4)主要由本研究设计的检测引物、反转录酶、缓冲液、无RNA酶的双蒸水等7种成分组成(见表3)。将2×1step Buffer以500μL/管分装、RNase Free water以1200μL/管分装、Prime

表3 PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测试剂盒主要成分

Table 3-3 Maincomponents of PEMV-1 and PEMV-2 RT-PCR simultaneousdetectionkit

2、PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测试剂盒使用方法

PEMV-1、PEMV-2一部法RT-PCR同步检测试剂盒使用方法参照说明书进行，反应体系为10μL，具体操作步骤如下：

在已灭菌的PCR管中加入以下试剂：

RT-PCR的反应条件：

反应结束后取7～10μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中电泳40min后在紫外凝胶成像系统下观察结果。

试验例1应用PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测试剂盒对田间样品的检测效果

1、实验材料

经常规RT-PCR验证感染了PEMV-1、PEMV-2的豌豆、蚕豆、烟草、野豌豆、鬼针草和油菜样品。

2、CTAB法提取植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板

取2mL灭菌离心管分别加入1大5小灭菌钢珠，称取0.1g左右病叶至离心管中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％巯基乙醇)，-80℃冰箱中预冷3～5min后于高通量组织研磨仪60Hz、90s研磨3次；65℃温浴45～60min；12000r/min离心10min，取650μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋震荡混匀30s；12000r/min离心10min，小心转移500μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入350μL异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 75％乙醇，12000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10～15min；加入30～50μLddH

3、一步法多重RT-PCR扩增

所述一步法多重RT-PCR的反应体系为5.0μL 2×1step Buffer，2.5μL RNaseFree water，0.4μLPrime

4、结果与分析

用PEMV-1、PEMV-2一步法RT-PCR同步检测试剂盒分别对被PEMV-1、PEMV-2侵染的10份豌豆、10份蚕豆、10份烟草、10份野豌豆、10份鬼针草、7份油菜田间样品进行检测，检测结果显示：该RT-PCR同步检测盒能将被PEMV-1单独侵染、PEMV-2单独侵染或PEMV-1、PEMV-2复合侵染的样品同时检测出来(如图5)，检出病毒种类与常规单一PCR检出病毒种类相一致，说明该同步检测盒的检测效率、检测效果、检测特异性以及灵敏度都较好，可用于感染了PEMV-1、PEMV-2的田间样品检测。

以上已经描述了本发明申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。