一种新的黄连异喹啉生物碱在线二维正交分离方法

技术领域

本发明涉及一种新的黄连异喹啉生物碱在线二维正交分离方法，属于中药的分离技术领域。

背景技术

中药是由多成分组成的复杂混合物体系，其化学成分研究是中药治病科学原理研究的基础和关键。高效液相色谱是研究中药化学成分的有力工具，然而由于中药化学成分结构类型多样，极性分布范围广，加上单一色谱模式的峰容量有限，导致传统的一维色谱无法满足中药化学成分分离的需求。二维液相色谱通过将两种不同分离机理的色谱柱串联使用，可以显著提高色谱峰容量和复杂样品的分离能力，在中药化学成分的分离分析中应用广泛。

生物碱是一类重要的活性天然产物，包含多种结构类型，二维液相色谱技术在各种类型生物碱的分离分析中也逐渐得到应用[Zhao W,et al.Journal of SeparationScience,2020,43:1755-1772]。异喹啉类生物碱是生物碱中活性较好的一类，根据文献报道，异喹啉类生物碱具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、保护心血管等作用。然而目前异喹啉类生物碱的二维液相色谱研究还比较薄弱，文献报道仅有两篇：Pan G等建立了离线二维强阳离子交换-反相液相色谱方法，从赛北紫堇中分离制备了8个异喹啉类生物碱[Pan G,etal.Journal of Separation Science,2019,42:3182-3190]，然而离线二维的效率低、重复性差、且中间样品处理过程十分复杂；李威等采用“中心切割”在线二维高效液相色谱法(2D-HPLC，Kromasil-C18×Ultimate XB Phenyl)结合捕集柱同时测定黄连药材中6种异喹啉生物碱的含量[李威等，药物分析杂志，2014:04-014]，然而，由于碱性化合物在传统的硅胶基质色谱材料上往往会发生峰形拖尾，因此常常会添加一些缓冲盐来改善峰形，上述在线二维文献添加了100mM磷酸二氢铵来改善异喹啉生物碱的分离效果，大量缓冲盐的添加使得该方法无法应用于与质谱检测器的串联使用，且该方法无法覆盖全成分的分析；另一方面，正交性是影响二维液相色谱分离效率的关键因素，建立高正交性的分离技术是实现中药复杂体系高选择性分离的关键。

黄连是毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptisdeltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎，具有清热燥湿，泻火解毒等功效。异喹啉类生物碱是黄连的主要活性成分，以黄连为研究对象，开发高选择性、高正交性、质谱兼容的异喹啉类生物碱在线二维液相分离技术，可以为复杂中药样品中异喹啉类生物碱的深入质谱表征奠定基础。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种新的黄连异喹啉生物碱在线二维正交分离方法。

具体技术方案为：

结合反相色谱固定相C18HCE和全氟辛基固定相FC8HL构建在线二维分离方法，实现黄连提取液中异喹啉生物碱的高选择性、高正交性分离，具体步骤如下：

1)黄连提取物的制备：称取黄连药材粉末，加入5-15倍50％-100％的甲醇、5-15倍50％-100％的乙醇、50％-100％的甲醇(含0.1％甲酸)或50％-100％的乙醇(含0.1％甲酸)溶液回流或50℃超声提取，每次30-60min，提取1-3次，合并提取液，浓缩处理后得黄连总提物，采用50％甲醇/水(含0.1％甲酸)溶解成20mg/mL，过滤。

2)以C18HCE和FC8HL建立在线二维分离方法，C18HCE色谱柱为第一维色谱柱，FC8HL色谱柱为第二维色谱柱，其中C18HCE色谱柱固定相粒径为3.5μm、5μm，柱规格为4.6mm×150mm、4.6mm×100mm、2.1mm×150mm、2.1mm×100mm；FC8HL色谱柱固定相粒径为1.7μm、2.5μm、3.5μm，柱规格为4.6mm×50mm、2.1mm×50mm。第一维流动相为(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-(0.05％～0.2％)甲酸/乙腈(B)、(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-乙腈(B)、(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-(0.05％～0.2％)甲酸/甲醇(B)、或(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-甲醇(B)，第一维的流速为0.05～0.2mL/min；第二维流动相为(2～20mM)甲酸铵/水(A)-(2～20mM)甲酸铵/乙腈(B)、(2～20mM)甲酸铵/水(A)-(2～20mM)甲酸铵/甲醇(B)、(2～20mM)乙酸铵/水(A)-(2～20mM)乙酸铵/乙腈(B)、或(2～20mM)乙酸铵/水(A)-(2～20mM)乙酸铵/甲醇(B)，第二维流速为1～2mL/min，柱温30-40℃。

3)采用双三元液相色谱串联光电二极管阵列检测器(Diode Array Detector，DAD)，以20mg/mL黄连总提物上样，两维色谱柱之间通过两个十通切换阀和两个定量环进行阀切换，包括切换状态1、切换状态2和切换状态3，实现一维成分连续进入第二维的分析。状态1为第一维色谱柱(1D)进行分离且分离的组分I进入定量环1，第二维色谱柱(2D)平衡中；状态2为第一维色谱柱(1D)分离的组分II进入定量环2，定量环1储存的组分I进入第二维色谱柱(2D)进行快速分离，分离完快速平衡色谱柱；随后继续切换为状态1，第一维色谱柱(1D)分离的组分III进入定量环1，定量环2储存的组分II进入第二维色谱(2D)柱进行快速分离，分离完快速平衡色谱柱；阀切换的状态1和状态2往复循环；对于不重要的组分，可以切换为状态3，分离的组分直接进入废液；阀切换时间为2min-4min，定量环1和2体积均为1mL。

本发明的优点如下：

1.本发明将反相色谱固定相C18HCE和全氟辛基色谱固定相FC8HL结合，构建了一个新的高正交性的异喹啉生物碱在线二维分离方法。

2.本发明建立的分离方法流动相体系十分简单，质谱兼容性好，且能够在较短的分离时间范围内实现复杂样品的在线二维分离，重复性好。

3.本发明构建的方法，为其他富含异喹啉生物碱药材的分离分析提供了方法学体系。

附图说明

图1.不同异喹啉生物碱在C18HCE和FC8HL色谱柱的保留行为；

图2.C18HCE和FC8HL的正交性评价；

图3.黄连提取物在线二维的第一维色谱图(C18HCE)；

图4.黄连提取物在线二维色谱图【C18HCE(5μm，流速0.2mL/min)×FC8HL(2.5μm,流速2mL/min)】；

图5.黄连提取物在线二维色谱图【C18HCE(5μm，流速0.1mL/min)×FC8HL(2.5μm,流速2mL/min)】；

图6.黄连提取物在线二维色谱图【C18HCE(5μm，流速0.2mL/min)×FC8HL(3.5μm,流速2mL/min)】；

图7.状态1的结构示意图；

图8.状态2的结构示意图；

图9.状态3的结构示意图。

具体实施方式

一种新的黄连异喹啉生物碱在线二维正交分离方法，制备黄连提取物，以C18HCE色谱柱和FC8HL色谱柱建立在线二维分离方法对黄连提取物进行分离，其中，C18HCE色谱柱为第一维色谱柱，FC8HL色谱柱为第二维色谱柱。

其中，C18HCE色谱柱粒径为3.5μm、5μm，柱规格为4.6mm×150mm、4.6mm×100mm、2.1mm×150mm、2.1mm×100mm；FC8HL色谱柱粒径为1.7μm、2.5μm、3.5μm，柱规格为4.6mm×50mm、2.1mm×50mm；采用双三元液相色谱串联光电二极管阵列检测器进行检测。

其中，第一维流动相为(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-(0.05％～0.2％)甲酸/乙腈(B)，(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-乙腈(B)，(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-(0.05％～0.2％)甲酸/甲醇(B)，或(0.05％～0.2％)甲酸/水(A)-甲醇(B)；第二维流动相为(2～20mM)甲酸铵/水(A)-(2～20mM)甲酸铵/乙腈(B)，(2～20mM)甲酸铵/水(A)-(2～20mM)甲酸铵/甲醇(B)，(2～20mM)乙酸铵/水(A)-(2～20mM)乙酸铵/乙腈(B)，或(2～20mM)乙酸铵/水(A)-(2～20mM)乙酸铵/甲醇(B)，％为体积百分比。

具体地，第一维色谱柱的流速为0.05～0.2mL/min,第二维色谱柱的流速为1～2mL/min，柱温30-40℃。

具体地，第一维色谱柱和第二维色谱柱之间通过两个十通切换阀和两个定量环进行阀切换状态，状态包括状态1(参考图7)、状态2(参考图8)和状态3(参考图9)，实现一维成分连续进入第二维的分析；状态1为第一维色谱柱(1D)对黄连提取液进行分离且分离的组分I进入定量环1，第二维色谱柱(2D)平衡中；状态2为第一维色谱柱(1D)分离的组分II进入定量环2，定量环1储存的组分I经泵2进入第二维色谱柱(2D)进行快速分离，分离完快速平衡色谱柱；随后继续切换为状态1，第一维色谱柱(1D)分离的组分III进入定量环1，定量环2储存的组分II进入第二维色谱(2D)柱进行快速分离，分离完快速平衡色谱柱；阀切换的状态1和状态2往复循环；对于不重要的组分，切换为状态3，分离的组分直接进入废液，组分的选取可以根据试验需要进行，从而进行状态1、状态2以及状态3的切换，并不局限于此。

更具体地，阀切换时间为2min-4min，定量环体积为1mL。

还有一些实施例中，所述制备黄连提取物为称取黄连药材粉末，加入5-15倍50％-100％的甲醇、5-15倍50％-100％的乙醇、5-15倍含0.1％甲酸的50％-100％的甲醇、5-15倍含0.1％甲酸的50％-100％的乙醇溶液回流或50℃超声提取，每次30-60min，提取1-3次，合并提取液，浓缩处理后得黄连总提物，采用50％甲醇/水(含0.1％甲酸)溶解成20mg/mL，过滤，％为体积百分比。

下面结合实例，对本发明的技术方案作进一步解释和说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

仪器：Thermo Scientific UltiMate 3000双三元高效液相色谱系统

试剂：甲醇(色谱纯，Fisher chemical)，甲酸铵(色谱纯，Aladdin)，乙腈(色谱级，Fisher chemical)，实验用水为Mill-Q超纯水系统生成超纯水；其余试剂均为分析纯。

以下实施例中涉及的％均为体积百分比。

实施例1

实施方法

1.黄连提取物制备：称取黄连药材粉末，加入10倍75％甲醇/水(含0.1％甲酸)

溶液，回流提取60min，提取3次，合并提取液，浓缩处理后得黄连总提物，

采用50％甲醇/水(含0.1％甲酸)溶解成20mg/mL，过滤。

2.C18HCE和FC8HL正交性评价：配置黄连标品溶液，见下表，评价色谱柱正交性，色谱柱：C18HCE(4.6×150mm，5μm)，FC8HL(2.1×50mm，2.5μm)；

C18HCE色谱柱正交性评价方法：

FC8HL色谱柱正交性评价方法：

3.在线二维分离方法：

仪器：Thermo Scientific UltiMate 3000双三元高效液相色谱系统；

第一维色谱柱：C18HCE(4.6×150mm，5μm)；

第一维流动相：A

第一维梯度：

第二维色谱柱：FC8HL(2.1×50mm，2.5μm)；

第二维流动相：A

第二维梯度：

柱温：40℃；

进样量：50μL；

波长采集范围：200nm-700nm；

检测波长：254nm；

4.分离结果：

a)不同异喹啉生物碱在C18HCE和FC8HL的保留见附图1，保留行为和选择性有明显的差异；

b)C18HCE和FC8HL的正交性见附图2，两种色谱柱相关系数仅为0.16，正交性良好，适合构建在线二维分离系统；

c)第一维分离谱图见图3，在线二维分离谱图见图4，图3和图4可以看出，第一维和第二维色谱柱分离较好。

实施例2

实施方法

1.黄连提取物制备：称取黄连药材粉末，加入10倍75％甲醇/水(含0.1％甲酸)溶液，回流提取60min，提取3次，合并提取液，浓缩处理后得黄连总提物，采用50％甲醇/水(含0.1％甲酸)溶解成20mg/mL，过滤。

2.在线二维分离方法：

仪器：Thermo Scientific UltiMate 3000双三元高效液相色谱系统

第一维色谱柱：C18HCE(4.6×150mm，5μm)

第一维流动相：A

第一维梯度：

第二维色谱柱：FC8HL(2.1×50mm，3.5μm)；

第二维流动相：A

第二维梯度：

柱温：40℃；

进样量：50μL；

波长采集范围：200nm-700nm；

检测波长：254nm；

3.分离结果：在线二维分离谱图见图5，从图5可以看出，该实施例的分离效果好。

实施例3

实施方法

1.黄连提取物制备：同实施例1

2.在线二维分离方法：第二维色谱柱为FC8HL(2.1×50mm，3.5μm)，其余同实施例1

3.分离结果：在线二维分离谱图见图6，从图6中可以看出，该实施例的分离效果较好。

实施例4

实施方法

1.黄连提取物制备：同实施例1；

2.在线二维分离方法：第二维流动相为A

3.其余同实施例1。

实施例5

实施方法

1.黄连提取物制备：同实施例1；

2.在线二维分离方法：第二维流动相为A

3.其余同实施例1。

实施例6

实施方法

1.黄连提取物制备：同实施例1；

2.在线二维分离方法：第二维流动相为A

3.其余同实施例1。