用于提高大豆产量的方法和组合物

相关申请的交叉引用

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序列表声明

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背景技术

在自然界中广泛发现一碳型有机化合物(one-carbon organic compounds)，如甲烷和甲醇，并且被归类为甲烷氧化菌和甲基营养菌的细菌用作碳源。甲烷氧化菌(Methanotrophic bacteria)包括甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基球形菌属(Methylosphaera)、甲基暖菌属(Methylocaldum)和甲基细胞菌属(Methylocella)中的属种(Lidstrom，2006)。甲烷氧化菌具有甲烷单氧酶，其将来自O

甲基杆菌属中的大部分甲基营养菌是粉红色的。它们常规上被称为PPFM细菌，是粉红色兼性甲基营养菌。Green(2005，2006)在甲基杆菌属中鉴定了12个确认的菌种，具体为嗜胺甲基杆菌(M.aminovorans)、氯甲烧甲基杆菌(M.chloromethanicum)、二氯甲烧甲基杆菌(M.dichloromethanicum)、扭脱甲基杆菌(M.extorquens)、藤泽氏甲基杆菌(M.fujisawaense)、嗜中温甲基杆菌(M.mesophilicum)、嗜有机甲基杆菌(M.organophilum)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)、罗得西亚甲基杆菌(M.rhodesianum)、玫瑰红甲基杆菌(M.rhodinum)、硫氛酸盐甲基杆菌(M.thiocyanatum)以及扎氏甲基杆菌(M.zatmanii)。然而，巢状甲基杆菌(M.nidulans)为非PPFM的固氮甲基杆菌(Sy等人，2001)。甲基杆菌存在于土壤、灰尘、淡水、沉积物和叶表面中，以及存在于工业环境和临床环境中(Green，2006)。

发明内容

本文提供了用于提高大豆植物产量的方法，所述方法包括：(a)将组合物施用于大豆植物或其部分，其中所述组合物包含(i)甲基杆菌NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)或其变体中的一种或多种，或(ii)甲基杆菌分离物NLS0109(NRRL B-67340)或其变体和甲基杆菌分离物NLS0017(B-50931)或NLS0610(ISO26)或其变体的组合；其中所述组合物进一步包含至少一种附加组分，所述附加组分选自由附加活性成分、农业上可接受的佐剂和农业上可接受的赋形剂组成的群组；和(b)使大豆植物生长至成熟，从而提高大豆植物的产量。在所述方法的某些实施例中，将所述组合物施用于大豆种子。在上述方法的某些实施例中，所述组合物包含在其上生长并粘附有甲基杆菌的固体物质，或其中生长有甲基杆菌的乳液。在任何上述方法的某些实施例中，所述组合物包含对于固体组合物滴度为约1×10

本文还提供了大豆植物或大豆植物部分，其被包含甲基杆菌的组合物涂布或部分涂布，其中甲基杆菌是以下中的一种或多种：(i)NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)或其变体，或(ii)甲基杆菌分离物NLS0109(NRRL B-67340)或其变体和甲基杆菌分离物NLS0017(B-50931)或其变体的组合。在某些实施例中，所述组合物进一步包含至少一种附加组分，所述附加组分选自由附加活性成分、农业上可接受的佐剂和农业上可接受的赋形剂组成的群组。在某些上述实施例中，所述组合物包含对于固体组合物滴度为约1×10

本文还提供了分离的甲基杆菌菌株NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)或其变体。还提供了包含甲基杆菌NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体中的一种或多种的组合物。在某些实施例中，甲基杆菌菌株或组合物涂布或部分涂布大豆植物或其部分。在某些实施例中，所述组合物涂布或部分涂布大豆种子。在某些实施例中，涂布或部分涂布大豆植物、大豆种子或其它大豆植物部分的组合物包含NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)或其变体中的一种或多种。

具体实施方式

定义

本文使用的术语“和/或”被认为是两个指定的特征或组分中的每一个的具体公开，具有或不具有另一个。因此，本文在如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

在以单数形式提供术语的情况下，也提供了包括该术语的复数形式的实施例。

如本文所使用的，术语“包括(include、includes和including)”应被解释为至少具有它们所指的特征或涵盖它们所指的项目，同时不排除任何附加的未指定的特征或未指定的项目。

如本文所使用的，短语“粘附于其上”和“粘附的”是指通过在固体物质上生长或已经在固体物质上生长而与固体物质缔合的甲基杆菌。

如本文所使用的，短语“活性成分”是指用于处理植物和/或植物部分的组合物中的生物制剂或除害剂(pesticide)。

如本文所使用的，术语“生物制剂”是指用于处理由微生物组成或衍生自微生物的植物或植物部分的组合物的组分。生物制剂包括生物控制剂、其它有益微生物、微生物提取物、天然产物、植物生长激活剂或植物防御剂。生物控制剂的非限制性实例包括细菌、真菌、有益线虫和病毒。在某些组合物中，生物制剂可以包括甲基杆菌的单培养物或共培养物，或已单独培养的甲基杆菌菌株或分离物的组合。

如本文所使用的，短语“农业上可接受的佐剂”是指在用于处理植物和/或植物部分的组合物中增强生物制剂或除害剂的性能的物质。在某些组合物中，生物制剂可以包括甲基杆菌的单培养物或共培养物。

如本文所使用的，短语“农业上可接受的赋形剂”是指基本上惰性的物质，其可以在用于处理植物和/或植物部分的组合物中用作生物制剂或除害剂的稀释剂和/或载体。在某些组合物中，生物制剂可以包括甲基杆菌的单培养物或共培养物。

如本文所使用的，术语“菌株”应包括此类菌株的所有分离物。

如本文所使用的，短语“对照植物”是指在种子或对照植物发育的任何随后阶段没有接受用产量增强甲基杆菌或包含其的组合物处理的植物。在某些实施例中，对照植物可以是用附加活性成分或产量中性甲基杆菌处理的植物。

如本文所使用的，短语“甲基杆菌的共培养物”是指包含至少两种甲基杆菌菌株或至少两种甲基杆菌属种的甲基杆菌培养物。

如本文所使用的，短语“污染微生物”是指在引入到培养物、发酵液、发酵液产物或组合物中之前未被鉴定的培养物、发酵液、发酵液产物或组合物中的微生物。

如本文所使用的，当用于甲基杆菌分离物的上下文中时，“变体”是指具有与本文提供的沉积的甲基杆菌分离物的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA的任何分离物。分离物的变体可以从各种来源获得，包括土壤、植物或植物材料和水，特别是与植物和/或农业相关的水。变体包括从保藏的分离物中获得的衍生物。可以使用序列分析工具，例如BLAST(如由Altschul等人(1990)教导的)或clustalw(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对甲基杆菌分离物或菌株进行测序(例如，如由Sanger等人(1977)、Bentley等人(2008)或Caporaso等人(2012))所教导的)，并且进行序列的基因组规模比较(Konstantinidis等人(2005))。

如本文所使用的，当用于甲基杆菌分离物的上下文中时，“衍生物”是指从本文提供的沉积的甲基杆菌分离物获得的任何甲基杆菌。甲基杆菌分离物的衍生物包括但不限于通过选择获得的衍生物、通过诱变和选择获得的衍生物以及从甲基杆菌分离物获得的遗传转化的甲基杆菌。“衍生物”可以例如基于对获得它的菌株或分离物的遗传同一性来鉴定，并且通常将表现出与其衍生自的菌株或分离物的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％的序列同一性的染色体基因组DNA。

如本文所使用的，当用于评价特定的甲基杆菌菌株是否是本文提供的甲基杆菌菌株的变体或衍生物时，“序列同一性”是指两个基因组的编码区之间核苷酸水平基因组相似性的量度。细菌基因组的编码区之间的序列同一性可以通过例如使用FastANI(Jain等人，“90K原核基因组的高通量ANI分析揭示明确的属种界限(High throughput ANI analysisof 90K prokaryotic genomes reveals clear species boundaries)”，《自然通讯(NatCommunications)》9，5114(2018))和Han等人(“ANI工具网：用于多种细菌菌株内快速基因组比较的网络工具(ANI tools web：a web tool f或fast genome comparison withinmultiple bacterial strains)；《数据库(Database)》，2016，1-5)确定平均核苷酸同一性(ANI)评分来计算。

如本文所使用的，术语“乳液”是指两种不可混溶液体的胶态混合物，其中一种液体是连续相并且另一种液体是分散相。在某些实施例中，连续相是水性液体并且分散相是在水性液体中不可混溶或部分可混溶的液体。

如本文所使用的，短语“基本上不含污染微生物”是指培养物、发酵液、发酵产物或组合物，其中在培养物、发酵液、发酵产物或组合物中以量或类型存在的至少约95％的微生物是所需的甲基杆菌或其它所需的具有预定特性的微生物。

如本文所使用的，短语“无生命固体物质(inanimate solid substance”)是指不溶于水或水溶液或部分溶于水或水溶液并且是无生命的或者不是其来源的还活着的生物体(still-living organism)的一部分的物质。

如本文所使用的，短语“甲基杆菌的单培养物”是指由甲基杆菌的单一菌株组成的甲基杆菌培养物。

如本文所使用的，“除害剂”是指杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂或其任意组合。

如本文所使用的，短语“抑菌剂(bacteriostatic agent)”是指抑制细菌的生长但不杀死细菌的药剂。

如本文所使用的，短语“除害剂基本上不抑制所述甲基杆菌的生长”是指当在包含发酵产物(所述发酵产物包含其中粘附有甲基杆菌的单培养物或共培养物的固体物质)的组合物中提供时，与缺乏除害剂的组合物相比，当将所述组合物施用于植物或植物部分时，导致不超过50％的甲基杆菌生长抑制的任何除害剂。在某些实施例中，与缺乏所述除害剂的组合物相比，当将所述组合物施用于植物或植物部分时，所述除害剂导致不超过40％、20％、10％、5％或1％的甲基杆菌生长抑制。

如本文所使用的，术语“甲基杆菌”是指甲基杆菌科家族中的属和种，包括甲基杆菌属中的细菌种和建议的甲基杆菌属(Green和Ardley(2018))。甲基杆菌包括粉红色的兼性甲基营养菌(PPFM)，并且还涵盖非粉红色的结瘤甲基杆菌，以及甲基杆菌分离物的无色突变体。例如，但不限于，“甲基杆菌”是指下列物种的细菌以及任何尚未报道或描述的新的甲基杆菌属种，其可以基于系统发育分析被表征为甲基杆菌或Methylorubrum：粘甲基杆菌(Methylobacterium adhaesivum)；米甲基杆菌(Methylobacterium oryzae)；气性甲基杆菌(Methylobacterium aerolatum)；草酸甲基杆菌(Methylobacterium oxalidis)；水生甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum)；波斯甲基杆菌(Methylobacterium persicinum)；臂形甲基杆菌(Methylobacterium brachiatum)；叶状甲基杆菌(Methylobacteriumphyllosphaerae)；短链甲基杆菌(Methylobacterium brachythecii)；叶穗甲基杆菌(Methylobacterium phyllostachyos)；泡状甲基杆菌(Methylobacterium bullatum)；刚竹甲基杆菌(Methylobacterium platani)；牛痘甲基杆菌(Methylobacterium cerastii)；Methylobacterium pseudosasicola；Methylobacterium currus；放射耐受甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)；丹氏甲基杆菌(Methylobacterium dankookense)；Methylobacterium soli；冷甲基杆菌(Methylobacterium frigidaeris)；专业化甲基杆菌(Methylobacterium specialis)；藤泽氏甲基杆菌(Methylobacterium fujisawaense)；迟缓甲基杆菌(Methylobacterium tardum)；格氏甲基杆菌(Methylobacterium gnaphalii)；塔式甲基杆菌(Methylobacterium tarhaniae)；Methylobacterium goesingense；苏云金甲基杆菌(Methylobacterium thuringiense)；棉铃甲基杆菌(Methylobacteriumgossipiicola)；三叶甲基杆菌(Methylobacterium trifolii)；格雷格甲基杆菌(Methylobacterium gregans)；变异甲基杆菌(Methylobacterium variabile)；单体甲基杆菌(Methylobacterium haplocladii)；嗜胺甲基杆菌(Methylobacterium aminovorans)(嗜胺甲基营养菌(Methylorubrum aminovorans))；西班牙甲基杆菌(Methylobacteriumhispanicum)；扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)(扭脱甲基营养菌(Methylorubrum extorquens))；印度裂体吸虫甲基杆菌(Methylobacterium indicum)；足跖甲基杆菌(Methylobacterium podarium)(足跖甲基杆菌(Methylorubrum podarium))；懒惰甲基杆菌(Methylobacterium iners)；群体甲基杆菌(Methylobacterium populi)(群体甲基杆菌(Methylorubrum populi))；异比利斯甲基杆菌(Methylobacteriumisbiliense)；假甲基杆菌(Methylobacterium pseudosasae)(假甲基杆菌(Methylorubrumpseudosasae))；焦加利甲基杆菌(Methylobacterium jeotgali)；罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)(罗得西亚甲基杆菌(Methylorubrum rhodesianum))；驹形甲基杆菌(Methylobacterium komagatae)；罗丹明甲基杆菌(Methylobacteriumrhodinum)(罗丹明甲基杆菌(Methylorubrum rhodinum))；长甲基杆菌(Methylobacteriumlongum)；输卵管甲基杆菌(Methylobacterium salsuginis)(输卵管甲基杆菌(Methylorubrum salsuginis))；马尔尚甲基杆菌(Methylobacterium marchantiae)；索氏甲基杆菌(Methylobacterium suomiense)(索氏甲基杆菌(Methylorubrum suomiense))；嗜中温甲基杆菌(Methylobacterium mesophilicum)；硫氰酸甲基杆菌(Methylobacteriumthiocyanatum)(硫氰酸甲基杆菌(Methylorubrum thiocyanatum))；结瘤甲基杆菌；西班牙甲基杆菌(Methylobacterium zatmanii)(西班牙甲基杆菌(Methylorubrum zatmanii))；嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)。

如本文所使用的，短语“固体物质”是指不溶于或部分溶于水或水溶液的物质。

如本文所使用的，短语“可以悬浮于其中的固相”是指可以通过搅拌分布在整个液体中的固体物质。

如本文所使用的，术语“不可再生的”是指不能再生为整个植物的植物部分或经处理的植物产品。

如本文所使用的，短语“基本上所有的固相悬浮在液相中”是指其中构成固相的至少95％、98％或99％的固体物质通过搅拌分布在整个液体中的介质。

如本文所使用的，短语“基本上所有的固相不悬浮在液相中”是指其中小于5％、2％或1％的固体为通过搅拌分布在整个介质中的颗粒形式的介质。

应理解，当任何前述定义与以引用的方式并入本文中的任何专利或非专利参考文献、本文中列举的任何专利或非专利参考文献或在别处发现的任何专利或非专利参考文献中所提供的定义不一致时，本文中将使用前述定义。

产量增强甲基杆菌、包含产量增强甲基杆菌的组合物、其使用方法和制备方法

本文提供了各种产量增强甲基杆菌分离物、包含这些甲基杆菌的组合物、使用所述组合物来提高大豆植物产量的方法以及制备所述组合物的方法。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌分离物选自NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体，以及甲基杆菌分离物NLS0109(NRRL B-67340)或其变体与甲基杆菌分离物NLS0017(B-50931)或NLS0610(ISO26)或其变体的组合。可以通过测量相对于未处理的植物或植物部分的产量的任何或所有变化来确定足以提供提高的大豆植物产量的包含产量增强甲基杆菌的组合物的量。在某些实施例中，产量可以通过在单位面积基础上(即每英亩蒲式耳、每公顷千克等)测量种子的产量来评估，其中产量增强甲基杆菌处理的植物或从甲基杆菌处理的种子生长的植物以与对照植物大约相同的密度生长。在某些实施例中，与未处理的对照植物相比，可以通过测量产量增强甲基杆菌处理的植物在每株植物或每株植物部分基础上的产量(每株植物的种子克数、每荚种子克数、每株植物的荚数、每荚种子数等)来评估产量。

本文提供了分离的产量增强甲基杆菌。在某些实施例中，甲基杆菌选自由格雷格甲基杆菌、丹氏甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、驹形甲基杆菌和泡状甲基杆菌组成的群组。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌分离物选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体以及它们的组合组成的群组。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌分离物选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS1181(ISO25)及其变体组成的群组。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌是甲基杆菌分离物NLS0109和NLS0017(NRRL B-50931)或NLS0610(ISO26)的组合。在某些实施例中，当施用于大豆种子时，当在大豆发育的营养阶段中施用时，或者当在大豆发育的生殖阶段期间施用时，产量增强甲基杆菌分离物可以提高产量。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌具有与NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)或NLS0610(ISO26))的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA；或者产量增强甲基杆菌是NLS0109的甲基杆菌变体与NLS0017(NRRL B-50931)或NLS0610(ISO26)的变体的组合，所述NLS0109的甲基杆菌变体具有与NLS0109(NRRL B-67340)的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA，所述NLS0017(NRRL B-50931)或NLS0610(ISO26)的变体具有与NLS0017(NRRL B-50931)或NLS0610(ISO26)的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA。在某些实施例中，与未经处理的对照植物或由未经处理的种子生长的植物相比，产量增强甲基杆菌提供经处理的植物或由经处理的种子产生的植物的产量的至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％或至少约15％的增加。在某些实施例中，与未经处理的对照植物或由未经处理的种子产生的植物相比，产量增强甲基杆菌提供经处理的植物或由经处理的种子生长的植物的产量的至少约2％或至少约5％到至少约10％或至少约20％的增加。

在某些实施例中，当施用于种子时，产量增强甲基杆菌提供了增加的产量。在某些实施例中，当在大豆发育的营养阶段期间施用时，产量增强甲基杆菌提供了产量的增加。在某些实施例中，当刚好在大豆发育的生殖阶段之前或期间施用时，产量增强甲基杆菌提供了增加的产量。在一些实施例中，甲基杆菌施用多于一次，其中此类施用可以在一个或多个发育阶段施用于大豆种子和大豆植物，或者可以在两个或更多个发育阶段施用于大豆植物多于一次。在任何上述组合物的某些实施例中，所述组合物包含固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物被粘附于固体物质上。在其中甲基杆菌粘附于固体物质的某些实施例中，组合物包含由上面粘附有甲基杆菌的单培养物或共培养物的固体物质和液体形成的胶体。在某些实施例中，胶体是凝胶。在某些上述组合物的某些实施例中，组合物是不含固体物质的乳液。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRLB-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体组成的群组。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是甲基杆菌NLS0109和NLS0017或NLS0610的组合。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌具有与NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)或NLS0610(ISO26)的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA；或产量增强甲基杆菌是NLS0109的甲基杆菌变体与NLS0017或NLS0610的甲基杆菌变体的组合，所述NLS0109、NLS0017或NLS0610的甲基杆菌变体具有与NLS0109(NRRL B-67340)、NLS0017(NRRL B-50931)或NLS0610的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA。

在某些实施例中，可以通过处理植物、种子、其中生长所述植物或由所述种子产生的植物的土壤、或其中生长所述植物或由所述种子产生的植物的其它植物生长培养基并测定增加的产量来鉴定分离的产量增强甲基杆菌。

在某些实施例中，用产量增强甲基杆菌处理大豆种子或处于发育营养阶段的大豆。大豆的营养阶段如下：VE(出苗)、VC(子叶期)、V1(第一片三小叶叶子)、V2(第二片三小叶叶子)、V3(第三片三小叶叶子)、V4(第四片三小叶叶子)、直至V(n)(第n片三小叶叶子，其中三小叶叶子的最终数量取决于大豆品种和环境条件)。大豆营养阶段的描述可以在万维网(因特网)上以extension.agron.iastate.edu/soybean/production_growthstages.html和“大豆生长与发育(Soybean Growth and Development)”，Pedersen，P.，爱荷华州立大学推广和外展出版物(Iowa State University Extension andOutreach publication)PM 1945，2009年12月)找到。在某些实施例中，在约VE至约V4、V5、V6或Vn发育阶段施用产量增强甲基杆菌，其中n是在进入发育的生殖阶段之前存在的三小叶叶子的数目。在某些实施例中，在约VC、V1、V2或V3至约V4、V5、V6或Vn发育阶段施用产量增强甲基杆菌，其中n是在进入发育的生殖阶段之前存在的三小叶叶子的数量。在某些实施例中，施用于种子或在营养阶段期间施用的产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体组成的群组。

在某些实施例中，将产量增强甲基杆菌施用于耐除草剂、耐昆虫或耐疾病的转基因大豆植物。在某些实施例中，在将草甘膦施用到耐受草甘膦的转基因大豆植物之前、期间或之后施用产量增强甲基杆菌。可以使用的市售草甘膦制剂包括但不限于：RoundupOriginal

在某些实施例中，用产量增强甲基杆菌处理处于发育的后期营养阶段至生殖阶段的大豆种子或大豆。大豆的后期营养阶段是V5或V6至V(n)(第n片三小叶叶子，其中三小叶叶子的最终数量取决于大豆品种和环境条件)阶段。大豆发育的生殖阶段为：R1(开始开花-在任意节点上至少一朵花)；R2(完全开花-在两个最上面的节点之一的盛开的花)；R3(开始结荚-在四个最上面的节点之一上，豆荚为5mm)；R4(完全豆荚-在四个最上面节点之一上，豆荚为2cm)；R5(开始结种-种子在主茎上四个最上面的节点之一的豆荚中长3mm)；R6(完全种子-包含绿色种子的豆荚，种子充满主茎上四个最上面节点之一处的豆荚容量)；R7(开始成熟-主茎上的一个正常豆荚已达到其成熟豆荚颜色)；和R8(完全成熟-95％的豆荚已经达到其完全成熟的颜色。在某些实施例中，施用于晚期营养阶段或生殖阶段的产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体，以及甲基杆菌NLS0109和NLS0017或NLS0610及其变体的组合组成的群组。

本文提供的各种甲基杆菌分离物在表1中公开。

表1：甲基杆菌分离物

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表1中所列的甲基杆菌分离物的变体包括通过遗传转化、诱变和/或插入异源序列获得的衍生物。在一些实施例中，通过存在与其所衍生自的菌株的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA来鉴定此类变体。在某些实施例中，通过存在一种或多种单一DNA序列来区分衍生物和其它变体，所述单一DNA序列包括：(i)SEQ ID NO：1-15和SEQ ID NO：61-79的单一序列。在本文的实例和WO2020010264中描述了使用此类序列用于特异性检测来自分离的DNA或来自处理过的植物的各种样品的甲基杆菌菌株的特异性测定和引物序列。

共同转让的专利或专利申请均据此通过引用以其整体并入本文，所述专利或专利申请公开了表1的某些甲基杆菌菌株的附加特定用途，例如：提高玉米产量(US20160295868)；改善莴苣栽培(USPN 10,212,939)；改善番茄生长(US10,368,547)；提高大豆产量(US2016/0302423)；提高水果产量(USPN 10,111,438)；控制玉米根虫(US20170238553)；控制根病变线虫(US10,448,645)；控制根结线虫(USPN 10,098,353)；和控制真菌疾病(US20180295841和US20190364905)。

本文还提供了用于提高大豆产量的方法，所述方法包括向植物或植物部分施用本文提供的任何上述组合物，其量为相对于未接受所述组合物的施用的对照植物、植物部分或由其获得的植物的感染，在所述植物、植物部分或由其获得的植物中提供增加的大豆产量。在某些实施例中，植物部分选自由叶、茎、花、根、荚、胚芽鞘和种子组成的群组。在某些实施例中，所述方法进一步包括从植物或植物部分收获至少一个选自由叶、茎、花、根、荚或种子组成的群组的植物部分的步骤。在任何上述方法的某些实施例中，所述方法进一步包括从植物或植物部分获得经处理的食品或饲料组合物。在某些实施例中，经处理的食品或饲料组合物是粉状物或糊状物。在任何上述方法的某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体组成的群组。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是甲基杆菌NLS0109和NLS0017或NLS0610或其变体的组合。

还提供了制备可用于提高大豆产量的组合物的方法，所述方法包括将产量增强甲基杆菌与农业上可接受的赋形剂和/或与农业上可接受的佐剂组合。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌被粘附于固体物质。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌被粘附于固体物质，其中所述固体物质与液体结合以形成为胶体的组合物。在所述方法的某些实施例中，胶体是凝胶。在所述方法的某些实施例中，通过在固体物质的存在下培养甲基杆菌来提供粘附于固体物质的甲基杆菌。在所述方法的某些实施例中，组合物包含乳液。在所述方法的某些实施例中，通过在乳液中培养甲基杆菌来提供甲基杆菌。在任何上述方法的某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体组成的群组。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是甲基杆菌NLS0109和NLS0017或NLS0610或其变体的组合。

已经发现与在单独的液体培养基中培养甲基杆菌的方法相比，在包含液相和固体物质的两相培养基中培养甲基杆菌的方法可显著增加甲基杆菌的所得产量。在某些实施例中，所述方法可包括使甲基杆菌在具有粒状固体物质的液体培养基中生长，所述粒状固体物质可在提供用于甲基杆菌生长的条件下通过搅拌悬浮于液体中。在其中使用粒状固体物质的某些实施例中，至少基本上所有固相可由此在搅拌时悬浮于液相中。此类粒状固体物质可包含长度或直径为约1毫米或更小的材料。在某些实施例中，搅拌程度足以提供粒状固体物质于液相中的均匀分布和/或最佳培养物掺气含量。然而，在本文中提供的其它实施例中，至少基本上所有固相不悬浮于液相中，或部分固相悬浮于液相中而部分固相不悬浮于液相中。其中固相不悬浮于液相中的某些两相培养基中可使用非粒状固体物质。此类非粒状固体物质包括但不限于长度或直径大于约1毫米的材料。此类粒状和非粒状固体物质还包括但不限于多孔、纤维或按其它方式配置以提供用于甲基杆菌的粘附性生长的增加的表面积的材料。其中部分固相悬浮于液相中而部分固相不悬浮于液相中的两相培养基可包含粒状和非粒状固体物质的混合物。任一种前述两相培养基中使用的此类粒状和非粒状固体物质还包括但不限于多孔、纤维或按其它方式配置以提供用于甲基杆菌的粘附性生长的增加的表面积的材料。在某些实施例中，培养基包含由固体和液相形成的胶体。可预先形成包含固体和液体的胶体并且添加到液体培养基中或可在含有固体和液体的培养基中形成。包含固体和液体的胶体可通过使某些固体物质经历化学和/或热变化来形成。在某些实施例中，胶体是凝胶。在某些实施例中，培养基的液相是乳液。在某些实施例中，乳液包含水性液体和在水性液体中不混溶或仅部分混溶的液体。在水中不混溶或仅部分混溶的液体包括但不限于以下中的任何一种：(1)在25℃时，在水中的混溶性等于或小于戊醇、己醇或庚醇的液体；(2)包含醇、醛、酮、脂肪酸、磷脂或其任意组合的液体；(3)选自由含有至少5个碳的脂族醇和甾醇组成的群组的醇；(4)动物油、微生物油、合成油、植物油或其组合；和/或(5)选自由玉米、大豆、棉花、花生、向日葵、橄榄、亚麻、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻、红花及其组合组成的群组的植物油。在某些实施例中，不混溶的或部分不混溶的液体可以按质量计占液相的至少约0.02％至约20％。在某些实施例中，所述方法可以包括获得包含液体、固体和甲基杆菌的两相培养基，并且在提供用于甲基杆菌生长的条件下培育培养物。包含液体、固体和甲基杆菌的两相培养基可以通过多种方法获得，所述方法包括但不限于以下中的任何一种：(a)用甲基杆菌接种包含液体和固体物质的两相培养基；(b)用甲基杆菌接种固体物质，然后将包含甲基杆菌的固体物质引入到液体培养基中；(c)用甲基杆菌接种固体物质，在固体物质上孵育甲基杆菌，然后将包含甲基杆菌的固体物质引入到液体培养基中；或(d)(a)、(b)或(c)的任意组合。在共同受让的美国专利9,181,541和9,845,462(其通过引用以其整体并入本文)中和2013年12月5日公布的共同受让的国际专利公开WO2013181610(其通过引用以其整体并入本文)中公开了用于在包含液体和固体的两相培养基中生长甲基杆菌的方法和组合物。

也已经发现与在单独的液体培养基中培养甲基杆菌的方法相比，在包含乳液的培养基中培养甲基杆菌的方法可显著增加甲基杆菌的所得产量。在某些实施例中，用于制备本文中提供的组合物的方法可包括使产量增强甲基杆菌在提供用于甲基杆菌生长的条件下，在乳液中生长。可以通过多种方法来获得包含乳液和产量增强甲基杆菌的培养基，所述方法包括但不限于以下中的任何一种：(a)用甲基杆菌接种包含乳液的培养基；(b)用甲基杆菌接种水性液体，引入非水性液体，并混合以形成乳液；(c)用甲基杆菌接种水性液体，引入非水性液体，并混合以形成乳液；或(d)(a)、(b)或(c)的任意组合。在某些实施例中，乳液包含水性液体和在水性液体中不混溶或仅部分混溶的液体。在水中不混溶或仅部分混溶的非水性液体包括但不限于以下中的任何一种：(1)在25℃时，在水中的混溶性等于或小于正戊醇、正己醇或正庚醇的液体；(2)包含醇、醛、酮、脂肪酸、磷脂或其任意组合的液体；(3)选自由含有至少5、6或7个碳的脂族醇和甾醇组成的群组的醇；(4)动物油、微生物油、合成油、植物油或其组合；和/或(5)选自由玉米、大豆、棉花、花生、向日葵、橄榄、亚麻、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻、红花及其组合组成的群组的植物油。在某些实施例中，不混溶的或部分不混溶的非水性液体可以按质量计占乳液的至少约0.02％至约20％。在某些实施例中，不混溶的或部分不混溶的非水性液体可以按质量计占乳液的至少约0.05％、0.1％、0.5％或1％至约3％、5％、10％或20％中的任一种。在共同受让的美国专利10,287,544和2014年12月4日公布的国际专利公开WO2014194189(其通过引用以其整体并入本文)中公开了用于在包含乳液的培养基中生长甲基杆菌的方法和组合物。

在一些实施例中，本文公开的组合物或方法可以包含一种或多种附加组分。在一些实施例中，附加组分可以是附加活性成分，例如除害剂或第二生物制剂。除害剂可以是例如杀虫剂、杀真菌剂、除草剂或杀线虫剂。第二生物制剂可以是生物控制剂。

杀虫剂和杀线虫剂的非限制性实例包括氨基甲酸酯类、二酰胺类、大环内酯类、新烟碱类、有机磷酸酯类、苯基吡唑类、除虫菊酯类、多杀菌素、合成拟除虫菊酯、特窗酸和特特拉姆酸(tetramic acid)。在特定的实施例中，杀虫剂和杀线虫剂包括阿维菌素(abamectin)、涕灭威(aldicarb)、涕灭砜威(aldoxycarb)、联苯菊酯(bifenthrin)、卡巴呋喃(carbofuran)、氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliporle)、噻虫胺(chlothianidin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、呋虫胺(dinotefuran)、依马菌素(emamectin)、乙虫腈(ethiprole)、克线磷(fenamiphos)、氟虫腈(fipronil)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、噻唑膦(fosthiazate)、吡虫啉(imidacloprid)、伊维菌素(ivermectin)、高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、弥拜菌素(milbemectin)、烯啶虫胺(nitenpyram)、草氨酰(oxamyl)、苄氯菊酯(permethrin)、噻恶嗪芬(tioxazafen)、乙基多杀菌素(spinetoram)、多杀菌素(spinosad)、螺螨酯(spirodichlofen)、螺虫乙酯(spirotetramat)、七氟菊酯(tefluthrin)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)以及硫双威(thiodicarb)。

有用的杀真菌剂的非限制性实例包括芳香烃类、苯并咪唑类、苯并噻二唑类、甲酰胺类、羧酸酰胺类、吗啉类、苯酰胺类、膦酸脂类、醌外部抑制剂(例如嗜球果伞素(strobilurin))、噻唑烷类、硫菌灵类(thiophanate)、噻吩甲酰胺类以及三唑。杀真菌剂的具体实例包括阿拉酸式苯-S-甲酯(acibenzolar-S-methyl)、嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜灵(benalaxyl)、联苯吡菌胺(bixafen)、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、环丙唑醇(cyproconazole)、烯酰吗啉(dimethomorph)、氟环唑(epoxiconazole)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟噻菌净(flutianil)、氟酰胺(flutolanil)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)、三乙膦酸铝(fosetyl-Al)、种菌唑(ipconazole)、吡唑菌萘胺(isopyrazam)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、精甲霜灵(mefenoxam)、甲霜灵、叶菌唑(metconazole)、腈菌唑(myclobutanil)、肟醚菌胺(orysastrobin)、戊苯吡菌胺(penflufen)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙环唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、吡唑醚菌酯、氟唑环菌胺(sedaxane)、硫硅菌胺(silthiofam)、戊唑醇(tebuconazole)、噻氟酰胺(thifluzamide)、硫菌灵、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)以及灭菌唑(triticonazole)。

除草剂的非限制性实例包括ACC酶抑制剂、乙酰苯胺、AHAS抑制剂、类胡萝卜素生物合成抑制剂、EPSPS抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂、PPO抑制剂、PS II抑制剂以及合成生长素。除草剂的具体实例包括乙草胺、烯草酮、麦草畏、丙炔氟草胺、氟磺胺草醚、草甘膦、草铵膦、硝磺草酮、喹禾灵、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、磺草酮以及2，4-D。

在一些实施例中，本文公开的组合物或方法可以包含附加活性成分，其可以是附加生物制剂。附加生物制剂可以是生物控制剂、其它有益微生物、微生物提取物、天然产物、植物生长激活剂或植物防御剂。生物控制剂的非限制性实例包括细菌、真菌、有益线虫和病毒。

在某些实施例中，附加生物制剂可以是甲基杆菌。在某些实施例中，附加生物制剂是表1中列出的甲基杆菌或其变体。因此，本文所包含的组合物或方法可以包含NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)或其变体中的两种或更多种。在某些实施例中，附加生物制剂选自由ISO01(NRRL B-50929)、ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO05(NRRL B-50933)、ISO06(NRRL B-50934)、ISO07(NRRL B-50935)、ISO08(NRRL B-50936)、ISO09(NRRL B-50937)、ISO10(NRRLB-50938)、ISO11(NRRL B-50939)、ISO12(NRRLB-50940)、ISO13(NRRL B-50941)、ISO14(NRRL B-50942)、ISO16(NRRL B-67340)及其变体组成的群组在某些实施例中，其前述变体可以是具有与ISO01(NRRL B-50929)、ISO02(NRRLB-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO05(NRRL B-50933)、ISO06(NRRL B-50934)、ISO07(NRRL B-50935)、ISO08(NRRL B-50936)、ISO09(NRRL B-50937)、ISO10(NRRLB-50938)、ISO11(NRRL B-50939)、ISO12(NRRL B-50940)、ISO13(NRRL B-50941)、ISO14(NRRL B-50942)或ISO16(NRRL B-67340)的染色体基因组DNA具有至少99％、99.9％、99.8％、99.7％、99.6％或99.5％序列同一性的染色体基因组DNA的甲基杆菌。在某些实施例中，附加生物制剂可以是选自格雷格甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、群体甲基杆菌、输卵管甲基杆菌、臂形甲基杆菌和驹形甲基杆菌的甲基杆菌。

在某些实施例中，附加生物制剂可以是以下菌属的细菌：放线菌属(Actinomycetes)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、金杆菌属(Aureobacterium)、固氮菌属(Azobacter)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、色杆菌属(Chromobacterium)、梭菌属(Clostridium)、棒形杆菌属(Clavibacter)、丛毛单胞菌属(Comomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、鞘脂杆菌属(phingobacterium)、发光杆菌属(Photorhabdus)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、贪噬菌属(Variovorax)或致病杆菌属(Xenorhadbus)。在特定的实施例中，细菌选自由以下组成的群组：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、色素杆菌(Chromobacterium suttsuga)、穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)、Pasteuria usage以及荧光假单胞菌(Pseudomonafluorescen)。

在某些实施例中，附加生物制剂可以是以下真菌属：链格孢属(Alternaria)、白粉寄生菌属(Ampelomyces)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、刺盘孢属(Colletotrichum)、盾壳霉属(Coniothyrium)、粘帚霉属(Gliocladium)、绿僵菌属(Metarhizium)、产气霉属(Muscodor)、拟青霉属(Paecilomyces)、木霉属(Trichoderma)、核瑚菌属(Typhula)、细基格孢属(Ulocladium)或轮枝孢属(Verticillium)。在特定的实施例中，真菌是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、小盾壳霉(Coniothyrium minitans)、绿粘帚霉(Gliocladium virens)、白色产气霉(Muscodor albus)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)或多孢木霉(Trichodermapolysporum)。

在进一步的实施例中，附加生物制剂可以是结瘤相关因子、植物生长激活剂或植物防御剂，包括但不限于超敏蛋白(harpin)、大虎杖(Reynoutria sachalinensis)、茉莉酮酸酯(jasmonate)、脂质几丁寡糖(lipochitooligosaccharides)(LCO)以及异黄酮。在某些实施例中，附加生物制剂组分可以包括细菌和结瘤相关因子、植物生长激活剂或植物防御剂的组合。一种此类组合包括但不限于

在进一步的实施例中，附加生物制剂可以包括但不限于各种芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)、盾壳霉属种(Coniothyrium sp.)、泛生菌属种(Pantoea sp.)、链霉菌属种(Streptomyces sp.)和木霉属种(Trichodermasp.)。微生物生物杀虫剂可以是细菌、真菌、病毒或原生动物。特别有用的生物杀虫性微生物包括多种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿木霉(Trichoderma virens)以及利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)菌株。所添加的其它微生物可以是经基因工程改造的或野生型分离物，其可按纯培养物形式使用。在某些实施例中，预期生物制剂或生物控制剂可以以孢子的形式被提供在发酵液、发酵液产物或组合物中。

在某些实施例中，包含产量增强甲基杆菌的发酵液、发酵液产物或组合物可以进一步包含一种或多种引入的除甲基杆菌以外的预定特性的附加活性成分或微生物。

在某些实施例中，由便宜和容易获得的组分制备液体培养基，包括但不限于无机盐，如磷酸钾、硫酸镁等；碳源，如丙三醇、甲醇、谷氨酸、天冬氨酸、丁二酸等；和氨基酸掺合物，如蛋白胨、胰蛋白胨等。可以使用的示例性液体培养基包括但不限于铵矿物盐(AMS)培养基(Whittenbury等人，1970)、Vogel-Bonner(VB)基本培养基(minimal culture medium)(Vogel和Bonner，1956)和LB培养液(“Luria-Bertani培养液”)。

通常，可以用于所述方法和组合物中以提供甲基杆菌的有效生长的固体物质可以是不溶于水或水溶液或仅部分溶于水或水溶液的任何合适的固体物质。当在液体培养基中提供固体物质时，与产量增强甲基杆菌相比，此类合适的固体物质也是非杀菌性或非抑菌性。在某些实施例中，此类合适的固体物质也是易于以无菌形式获得或使其无菌的固体物质。固体物质可通过任何可移除受污染的微生物的方法除菌并且因此包括但不限于如高压灭菌、辐射、化学处理和其任何组合的方法。这些固体物质包括动物、植物、微生物、真菌或矿物质源的天然物质、人工物质或天然和人工物质的组合。在某些实施例中，固体物质是无生命的固体物质。动物、植物、微生物或真菌来源的无生命固体物质可以从无法存活(即不再存活)或已变得无法存活的动物、植物、微生物或真菌中获得。因此，当已经移除先前相关的硅藻或按其它方式使其不再存活时，硅藻壳是无生命固体物质。因为硅藻壳是无生命固体物质，其不被视为光合生物体或光合微生物。在某些实施例中，固体物质包括但不限于砂、粉砂、土壤、粘土、灰分、木炭、硅藻土和其它类似矿石、毛玻璃或玻璃珠粒、磨砂陶瓷材料、瓷珠、膨润土、高岭土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、二氧化硅、石英粉末、蒙脱石和其组合。在某些实施例中，固体物质可以是聚合物或聚合物珠。可以用作固体物质的聚合物包括但不限于各种多糖，例如不溶于或仅部分溶于水或水溶液的纤维素聚合物和几丁质聚合物、琼脂(即半乳聚糖)及其组合。在某些实施例中，固体物质可以是不溶的或仅部分可溶的盐晶体。可以使用的盐晶体包括但不限于不溶或仅部分可溶的碳酸盐、铬酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氧化物和硫化物。在某些实施例中，固体物质可以是微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在某些实施例中，固体物质可以是微生物细胞或微生物孢子，其中微生物细胞或微生物孢子不是光合微生物。在某些实施例中，微生物细胞或微生物孢子不是光合微生物，其中光合微生物选自由以下各项组成的群组：藻类、蓝藻细菌、硅藻、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻(Chlorella)、盐生杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)、江蓠(Gracilaria)、颗石藻(Pleurochrysis carterae)、马尾藻(Sargassum)和石莼(Ulva)。在其它实施例中，固体物质可以是灭活的(即不可存活的)微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在其它实施例中，固体物质可以是静止的(即存活但不主动分裂的)微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在其它实施例中，固体物质可以是微生物来源的细胞碎片。在其它实施例中，固体物质可以是来自植物的任何部分的颗粒物质。可以用于获得固体物质的植物部分包括但不限于穗轴、外皮、壳、叶子、根、花、茎、树皮、种子和其组合。也可以使用从经处理的植物部分获得的产品，包括但不限于甘蔗渣、麦麸、大豆粗粉、压碎的籽饼、秸秆等。可研磨此类植物部分、经处理的植物和/或经处理的植物部分以便获得可使用的粒状形式的固体材料。在某些实施例中，可使用木材或木材产物，包括但不限于木浆、锯屑、刨花等。在某些实施例中，固体物质可以是来自动物的颗粒物质，包括但不限于骨粉、明胶、研磨或粉末状壳、毛发、浸软兽皮等。

在某些实施例中，以提供固体物质在培养基中的分布的颗粒形式提供固体物质。在某些实施例中，固体物质由平均长度或平均直径为约2微米至约1000微米的颗粒组成。在某些实施例中，固体物质由平均长度或平均直径为约1微米至约1000微米的颗粒组成。在某些实施例中，固体物质是平均长度或平均直径为约1、2、4、10、20或40微米至约100、200、500、750或1000微米中的任一种的颗粒。本文中提供的方法和组合物中使用的颗粒的理想特征包括适当的可湿性，使得颗粒在搅拌时可悬浮于整个培养基中。

在某些实施例中，以胶体形式在培养基中提供固体物质，其中连续相是液体并且分散相是固体。可用于在用于生长产量增强甲基杆菌的液体培养基中形成胶体的合适的固体包括但不限于多种被称为亲水胶体的固体。本文中提供的培养基、方法和组合物中使用的此类亲水胶体可以是植物、动物、微生物或合成来源的亲水性聚合物。所述方法中使用的亲水胶体聚合物可含有多个羟基和/或可以是聚电解质。本文中提供的组合物和方法中使用的亲水胶体聚合物包括但不限于琼脂、海藻酸盐、阿拉伯木聚糖、角叉菜胶、羧甲基纤维素、纤维素、凝胶多糖(curdlan)、明胶、结冷胶、β-葡聚糖、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、刺槐豆胶、果胶、淀粉、黄原胶和其混合物。在某些实施例中，本文提供的培养基、方法和组合物中使用的胶体可以包含水状胶体聚合物和一种或多种蛋白质。

在某些实施例中，固体物质可以提供产量增强甲基杆菌在固体物质上的粘附生长。粘附于固体物质的产量增强甲基杆菌是无法通过简单地用生长培养基洗涤具有粘附性产量增强甲基杆菌的固体物质来基本上去除的甲基杆菌，而非粘附性甲基杆菌可通过用液体生长培养基洗涤固体物质来基本上去除。在本文中，“基本上去除”是指当用三体积的液体生长培养基洗涤固体物质时，至少约30％、40％、50％、60％、70％或80％存在的甲基杆菌被去除。此类洗涤可通过多种方法实现，包括但不限于从经洗涤的固相倾析液体或使液体通过过滤器上的固相，所述过滤器允许液体中的细菌流过。在某些实施例中，与固体缔合的粘附性产量增强甲基杆菌可以包括直接附接到固体的甲基杆菌和/或间接附接到固体物质的甲基杆菌。间接附接到固体物质的甲基杆菌包括但不限于附接到另一种甲基杆菌或另一种微生物的甲基杆菌，所述另一种甲基杆菌或另一种微生物附接到固体物质，通过附接到另一种物质(其附接到固体物质)而附接到固体物质的甲基杆菌等。在某些实施例中，发酵液、发酵液产物或组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的甲基杆菌是粘附于固体物质的甲基杆菌。在某些实施例中，粘附性产量增强甲基杆菌可按以下密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米、至少约1个甲基杆菌/5平方微米、至少约1个甲基杆菌/2平方微米或至少约1个甲基杆菌/平方微米。在某些实施例中，粘附性产量增强甲基杆菌可按以下密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米、至少约1个甲基杆菌/5平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米或至少约1个甲基杆菌/2平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米。在某些实施例中，粘附性产量增强甲基杆菌可按以下密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米或至少约1个甲基杆菌/5平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米。本文中提供的两相发酵培养液可包含液相，其含有非粘附性甲基杆菌。在某些实施例中，液相中非粘附性甲基杆菌的滴度可以小于约100,000、10,000或1,000个菌落形成单位(CFU)/ml。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体组成的群组。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS1181(ISO25)及其变体组成的群组。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是甲基杆菌NLS0109和NLS0017或其变体的组合。

本文提供了具有大于约5×10

产量增强甲基杆菌可以作为发酵产物获得，并且可以用于制备可用于处理植物或植物部分以提高大豆产量的各种组合物。甲基杆菌组合物可以以各种形式被施用于植物或植物部分，包括例如作为液体组合物或作为干燥组合物，例如干燥粉末。干燥粉末可以通过各种方法获得，包括例如喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干和流化床干燥。因此提供了已经用包含产量增强甲基杆菌的发酵液产物或组合物至少部分地涂布或涂布的植物或植物部分。在某些实施例中，植物部分是种子。植物、植物部分如种子的部分涂布包括但不限于涂布植物、植物部分或植物种子的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。还提供了经处理的植物产物，其包含具有产量增强甲基杆菌或粘附性产量增强甲基杆菌的发酵液产物或组合物。在一些实施例中，具有粘附性产量增强甲基杆菌的固体物质可以用于制备特别用于处理植物种子的各种组合物。因此提供了用发酵液产物或组合物至少部分地涂布的种子。种子的部分涂布包括但不限于涂布种子的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。还提供经处理的种子产物，其包括但不限于含有本文中提供的发酵液产物或组合物的粉状物、粉末、饲料和薄片。在某些实施例中，经处理的植物产物将是不可再生的(即将不能发育成植物)。在某些实施例中，在发酵产物或组合物中使用的至少部分地涂布植物或植物部分或包含在经处理的植物或植物部分产物中的固体物质包括固体物质和相关的或粘附性产量增强甲基杆菌，其可以通过比较处理的和未处理的植物或植物部分或其经处理的产物容易地鉴定。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)、NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体组成的群组。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由NLS0934(NRRL B-67341)和/或NLS1181(ISO25)组成的群组。在任何上述组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是甲基杆菌NLS0109和NLS0017或NLS0610或其变体的组合。

包含产量增强甲基杆菌的可用于处理植物或植物部分的组合物还可以进一步包含附加组分，包括活性成分、农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂通常是在暴露于植物或植物部分时不引起不当植物毒性或其它副作用的成分。在某些实施例中，在发酵液中使用的固体物质本身可以是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂，只要其对甲基杆菌没有杀菌或抑菌作用。在一些实施例中，将农业上可接受的佐剂和/或赋形剂添加到甲基杆菌中以增加稳定性和/或保存期。在其它实施例中，组合物进一步包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。

任何上述组合物还可以进一步包含附加活性成分。在某些实施例中，附加活性成分是在组合物中使用的基本上不抑制甲基杆菌的生长的除害剂。由于甲基杆菌是革兰氏阴性细菌(gram negative bacteria)，组合物中使用的合适的杀细菌剂可包括但不限于呈现针对革兰氏阳性细菌(gram positive bacteria)而非革兰氏阴性细菌的活性的杀细菌剂。本文中提供的组合物还可以包含抑菌剂，其不会实质上抑制甲基杆菌的生长。本文中提供的组合物中适用的抑菌剂包括但不限于呈现针对革兰氏阳性细菌而非革兰氏阴性细菌的活性的抑菌剂。任何上述组合物也可以是基本上干燥的产品(即具有约5％或更低的水含量)、组合物与乳液的混合物或悬浮液。

在包含产量增强甲基杆菌的组合物中使用的农业上可接受的佐剂包括但不限于增强产物功效的组分和/或增强产物应用容易性的产物。增强产物功效的佐剂可包括多种润湿剂/散布剂(其促进植物部分上组合物的粘附和扩散)、促进与植物部分的粘附的粘着剂、可促进活性剂与内部组织的接触的渗透剂、通过抑制环境降解来增加活性剂的半衰期的填充剂和增加喷雾组合物的密度或干燥时间的保湿剂。组合物中使用的润湿剂/散布剂可包括但不限于非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂、有机硅酸盐表面活性剂和/或酸化表面活性剂。组合物中使用的粘着剂可包括但不限于基于乳胶的物质、萜/松脂二烯和基于吡咯烷酮的物质。渗透剂可包括矿物油、植物油、酯化植物油、有机硅酸盐表面活性剂和酸化表面活性剂。组合物中使用的填充剂可包括但不限于硫酸铵或基于薄荷烯的物质。组合物中使用的保湿剂可包括但不限于丙三醇、丙二醇和二乙二醇。提高产物应用简易性的佐剂包括但不限于酸化/缓冲剂、去泡/消泡剂、相容性试剂、偏移减小剂、染料和水调节剂。组合物中使用的去泡/消泡剂可包括但不限于二甲聚硅氧烷。组合物中使用的相容性试剂可包括但不限于硫酸铵。组合物中使用的偏移减小剂可包括但不限于聚丙烯酰胺和多糖。组合物中使用的水调节剂可包括但不限于硫酸铵。

本文还提供了用包含产量增强甲基杆菌的发酵液、发酵液产物和组合物处理植物和/或植物部分的方法。经处理的植物和由其获得的经处理的植物部分包括但不限于大豆。如本文所使用的，术语大豆包括但不限于大豆(Glycine max)的所有品种、亚种和栽培品种。大豆亚种包括但不限于大豆L.ssp.Max和大豆ssp.Formosana。经处理的植物部分包括但不限于叶、茎、花、根、种子、荚等。可用本文中提供的发酵液、发酵液产物、发酵产物和/或组合物处理任何前述植物的种子或其它繁殖体。

在某些实施例中，植物和/或植物部分通过将包含产量增强甲基杆菌的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物作为喷雾剂施用来处理。此类喷雾施用包括但不限于处理单一植物部分或植物部分的任何组合。可用任何将发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物散布到植物和/或植物部分的装置实现喷雾。有用的喷雾装置包括悬臂式喷雾器、手动或背负式喷雾器、作物喷粉机(即空中喷雾)等。还可以使用实现向近轴面和/或远轴面中的任一个或两个施用发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物的喷雾装置和/或方法。本文还提供至少部分涂有两相发酵液、发酵液产物、发酵产物或组合物中的任一种的植物和/或植物部分，所述两相发酵液、发酵液产物、发酵产物或组合物包含上面粘附有产量增强甲基杆菌的固体物质。在某些实施例中，植物部分是种子。植物或植物部分的部分涂布包括但不限于涂布植物或植物部分的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。在一些实施例中，植物部分是种子，并且部分涂布包括但不限于涂布种子的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。本文还提供了经处理的植物产物，所述经处理的植物产物包含附着有产量增强甲基杆菌的固体物质。

在某些实施例中，通过将种子暴露于包含产量增强甲基杆菌的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物来处理种子。种子可以用本文提供的发酵液、发酵液产物和组合物通过包括但不限于浸润、涂布、喷雾的方法进行处理。种子处理可以通过连续和/或分批种子处理器进行。在某些实施例中，涂布的种子可以通过用包含有包含产量增强甲基杆菌的发酵液或发酵液产物的涂层组合物将种子浆化并风干所得的产物来制备。风干可以在对种子或甲基杆菌无害的任何温度下完成。在某些实施例中，风干在不高于30℃的温度下完成。包含产量增强甲基杆菌的涂层的比例包括但不限于种子重量的0.1-25％、种子重量的0.5-5％和种子重量的0.5-2.5％的范围。在某些实施例中，种子涂布或处理中使用的固体物质上面粘附有产量增强甲基杆菌。在某些实施例中，用于种子涂布或处理的固体物质将与产量增强甲基杆菌相关联，并且将存在于通过本文提供的方法获得的发酵液、发酵液产物或组合物中。美国专利号5,106,648、5,512,069和8,181,388中公开的各种种子处理组合物和种子处理的方法通过引用以其整体并入本文，并且可以适于与包含本文提供的发酵液、发酵液产物或组合物的活性剂一起使用。在某些实施例中，用于处理种子的组合物可含有农业上可接受的赋形剂，其包括但不限于木屑、粘土、活性碳、硅藻土、细粒无机固体、碳酸钙等。可与本文中提供的发酵液、发酵液产物或组合物一起使用的粘土和无机固体包括但不限于钙膨润土、高岭土、瓷土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、二氧化硅、石英粉末、蒙脱石和其混合物。可使用的促进与种子的粘着的农业上可接受的佐剂包括但不限于聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、水解聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯甲醚、聚乙烯甲醚-顺丁烯二酸酐共聚物、蜡、乳胶聚合物、纤维素(包括乙基纤维素和甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基甲基丙基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸酯、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白质、剌梧桐树胶、瓜尔胶、黄蓍胶、多糖胶、胶浆、阿拉伯胶、虫胶、偏二氯乙烯聚合物和共聚物、基于大豆的蛋白质聚合物和共聚物、木质磺酸酯、丙烯酸共聚物、淀粉、聚乙烯丙烯酸酯、玉米蛋白、明胶、羧甲基纤维素、聚氨基葡萄糖、聚氧化乙烯、丙烯酰胺聚合物和共聚物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体、海藻酸酯、乙基纤维素、聚氯丁二烯和糖浆或其混合物。可促进涂布的其它适用的农业上可接受的佐剂包括但不限于乙酸乙烯酯的聚合物和共聚物、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和水溶性蜡。在本文和美国专利第8,181,388号中公开的各种表面活性剂、分散剂、抗结块剂、泡沫控制剂和染料可以适于与包含本文提供的发酵液、发酵液产物或组合物的活性剂一起使用。

本发明提供了包含产量增强甲基杆菌的组合物，其相对于未处理的植物、植物部分和从其获得的尚未暴露于所述组合物的植物提供增加的大豆植物的产量。在某些实施例中，植物部分，包括但不限于种子、叶、花、茎、根、荚或胚芽鞘，可以用本文提供的组合物处理以增加大豆植物产量。处理或施用可包括但不限于用本文中提供的组合物喷雾、涂布、部分涂布、浸没和/或浸润植物或植物部分。大豆植物或大豆植物部分的部分涂布包括但不限于涂布大豆植物或大豆植物部分的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。在一些实施例中，被部分涂布的大豆植物部分是大豆植物种子。在某些实施例中，种子、叶、花、茎、根、荚或胚芽鞘可以用本文提供的组合物的液体、半液体、乳液或浆料浸没和/或浸润。与未处理的大豆植物或由未处理的种子生长的大豆植物相比，此类种子浸没或浸润足以在经处理的大豆植物或由经处理的种子生长的大豆植物中提供增加的产量。在某些实施例中，可以将植物种子浸没和/或浸润至少1、2、3、4、5或6小时。在某些实施例中，此类浸没和/或浸润可在不会对植物种子或甲基杆菌有害的温度下进行。在某些实施例中，可在约15℃至约30℃或约20℃至约25℃下处理种子。在某些实施例中，可在温和搅拌下进行种子浸润和/或浸没。在某些实施例中，通过在犁沟中提供组合物，将大豆种子或VE阶段大豆植物暴露于组合物。在犁沟中提供组合物代表了本文提供的用于在大豆植物发育的大约VE阶段将组合物施用于大豆种子或大豆植物的几种方法之一。

因此，预期本文提供的包含产量增强甲基杆菌的组合物和相关方法可用于提高多种大豆植物的产量，所述大豆植物包括但不限于大豆(Glycine max)的所有品种、亚种和栽培品种。

在某些实施例中，本文提供的足以提供增加的大豆产量的组合物的量可以是具有产量增强甲基杆菌的组合物，所述产量增强甲基杆菌的滴度为至少约1×10

在某些实施例中，本文提供的足以提供增加的大豆产量的组合物的量可以是具有以下滴度的甲基杆菌的组合物：至少约1×10

实例

包括以下实例以便说明本公开的说明性、非限制性实施例。本领域的技术人员应了解，以下实例中披露的技术表示由申请人发现的在本发明的实践中起良好作用的技术。然而，根据本公开，本领域的技术人员应了解，可在不脱离本公开的范围的情况下在所披露的特定实施例中进行多种变化，同时仍获得相同或类似结果。

实例1：

甲基杆菌的制备

在准备田间试验时，将甲基杆菌培养物在铵矿物盐(AMS)+含有碳源(AMS+碳(15g/升)+蛋白胨(10g/升))的蛋白胨培养基中在30℃下生长4天。为了制备1升的液体AMS培养基+碳+蛋白胨(“AMS培养基溶液”)，将以下组分加入到总体积为一(1)升的蒸馏水中：700毫克的无水磷酸氢二钾，540毫克的无水磷酸二氢钾，1克的七水硫酸镁，500毫克的无水氯化铵，200毫克的二水氯化钙，15g的碳源，和10g的蛋白胨。

通过高压灭菌对AMS培养基溶液进行灭菌。在30℃下生长4天后，通过以5000rpm离心10分钟收获培养物，然后重新悬浮在含有20％(v/v)甘油作为冷冻保护剂的AMS培养基溶液中。等分培养物，并在-80℃下冷冻，直到解冻使用。将液体甲基杆菌制剂施用于已经用常规杀真菌剂和杀虫剂处理的商品大豆种子。将液体甲基杆菌制剂以约1×10

实例2：

在2017年产量试验中通过施用甲基杆菌组合物提高大豆产量

在整个中西部大豆种植区的四个地点建立了大豆微区田间试验，以用于评估作为种子处理施用于商品大豆种子的67种甲基杆菌分离物。在试验中包括6个未用甲基杆菌分离物处理的对照。

微区试验以随机完全区组设计进行。在每个地点处都存在甲基杆菌分离物和对照中的每一种的6个重复。这些试验是在现有的农民田间试验点内进行的，并按照当地的农艺措施进行管理。使用的所有大豆品种都是耐草甘膦品种。用市售采集组合在生理学成熟期收集试验物以便获得产量。

结果

产量结果的分析由JMP14(赛仕软件研亢所(SAS Institute))进行，并且在执行方差分析(ANOVA)之前，对正态性和等方差的假设进行了检验。ANOVA采用分析-拟合模型常规方法进行。在平均值的差异为零的零假设下，使用双尾t检验将甲基杆菌分离物与六个未处理对照的平均值进行比较，所述双尾t检验应用于从ANOVA模型估计的最小二乘均值之间的成对差异。

根据以下模型对四个地点进行跨地点分析：[2]Y

选择用于进一步分析的分离物的产量结果在下表2中示出。

表2来自2017年大豆产量试验的产量结果

*P值取自将每种处理与未处理检查(UTC)进行比较的双尾t检验。

实例3：

在2018年产量试验中通过施用甲基杆菌组合物提高大豆产量

基于来自上述2017年田间试验的结果选择用于2018年田间试验的菌株，并且如实例1所述制备用于接种的培养物。选择了2017年表现出阳性产量结果的分离物和若干表现出对产量产生负面影响的分离物。在整个中西部大豆种植区的四个地点建立了大豆田间试验，以用于评估作为种子处理施用于商品大豆种子的甲基杆菌分离物。在试验中包括未用甲基杆菌分离物处理的对照。

这些试验以随机完全区组设计进行，由四行30英寸、40英尺长的行组成。在每个地点处存在甲基杆菌分离物和对照中的每一种的四个重复。这些试验是在现有的农民田间试验点内进行的，并按照当地的农艺措施进行管理。收割是按照标准种植者的实践进行的，并且使用常规的计量联合收割机测定地块产量。使用地块试验权重来计算每个地块的bu/英亩产量估计值。

结果

产量结果的分析如上所述进行。显示大豆产量增加的分离物的数据在下表3中提供。

表3来自2018年大豆产量试验的产量结果。

*P值取自将每种处理与未处理检查(UTC)进行比较的双尾t检验。

实例4：

通过施用干燥甲基杆菌组合物提高大豆产量

在准备田间试验时，将甲基杆菌培养物在铵矿物盐(AMS)+含有碳源(AMS+碳(15g/升)+蛋白胨(10g/升))的蛋白胨培养基中在30至下生长4天。为了制备1升的液体AMS培养基+碳+蛋白胨(“AMS培养基溶液”)，将以下组分加入到总体积为一(1)升的蒸馏水中：700毫克的无水磷酸氢二钾，540毫克的无水磷酸二氢钾，1克的七水硫酸镁，500毫克的无水氯化铵，200毫克的二水氯化钙，15g的碳源，和10g的蛋白胨。

通过高压灭菌对AMS培养基溶液进行灭菌。在30℃下生长4天后，通过以5000rpm离心10分钟收获培养物，并将来自离心的细胞沉淀重新悬浮在原始体积十分之一的AMS培养基溶液中(“浓缩浆料”)。

将浓缩浆料与商业制剂添加剂混合，并将所得的混合物在-80℃下冷冻。使用标准工业冷冻干燥条件将冷冻混合物冷冻干燥，然后研磨成粉末。将该粉末以约1×10

在整个中西部大豆种植区的四个地点建立了大豆田间试验(2017年9个地点和2018年11个地点)。这些试验以随机完全区组设计进行，由四行30英寸、40英尺长的行组成。在每个地点处存在甲基杆菌分离物和对照中的每一种的四个重复。甲基杆菌S6阳性对照含有一种甲基杆菌分离物，该分离物先前显示可增加大豆产量(US20160302423)。这些试验是在现有的农民田间试验点内进行的，并按照当地的农艺措施进行管理。收割是按照标准种植者的实践进行的，并且使用常规的计量联合收割机测定地块产量。使用地块试验权重来计算每个地块的bu/英亩产量估计值。数据报告于下面的表4中。

表4

实例5甲基杆菌菌株、变体和衍生物的检测和鉴定

公开了用于检测或鉴定特定甲基杆菌菌株和密切相关的衍生物的测定法。鉴定了甲基杆菌菌株特有的基因组DNA片段，并开发了基于qPCR锁定核酸(LNA)的测定。

通过对大约300bp片段的BLAST分析，使用1-25个核苷酸的滑动窗口，将甲基杆菌菌株的基因组DNA序列与超过1000个公共和专有甲基杆菌分离物的全基因组序列进行比较。基因组DNA片段被鉴定为具有弱BLAST比对，表明整个片段与感兴趣的甲基杆菌的相应片段具有约60-95％的同一性。选择来自靶甲基杆菌菌株基因组的与所鉴定的弱比对区域相对应的片段用于测定开发。

区分NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)和NLS0610(ISO26)与相关甲基杆菌分离物的目标片段序列在下表5中提供。

表5.甲基杆菌菌株的特有片段序列

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选择SEQ ID NO：1-15中的区域，其中其它甲基杆菌菌株中的相应区域被鉴定为与目标甲基杆菌菌株序列具有一个或多个核苷酸错配，并且使用Primer3软件(Untergasser等人(2012)，Koressaar等人(2007))设计了qPCR引物，以位于错配区域的侧面，其解链温度(Tm)在55-60度范围内，并产生约100bp的PCR DNA片段。探针序列采用5′FAM报告染料、3′爱荷华黑色FQ猝灭剂(Iowa Black FQ quencher)设计，并且含有1至6个LNA碱基(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，爱荷华州科拉尔维尔)。至少1个LNA碱基处于错配的位置，而其它LNA碱基用于提高Tm。探针序列的Tm目标是比引物的Tm高10度。

用于特异性检测NLS0497(ISO22)、NLS0693(ISO23)、NLS1179(ISO24)、NLS1181(ISO25)、NLS0610(ISO26)及其变体的引物和探针序列作为表6中的SEQ ID NO：16-51提供。每个探针包含一种5′FAM报告染料和一种3′爱荷华黑色FQ猝灭剂。

表6用于特异性检测菌株的引物和探针

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*粗体和带下划线的字母代表LNA碱基的位置

在分离的DNA上使用引物/探针组来检测特定的甲基杆菌分离物及其变体，并与相

每个10ul qPCR反应包含5ul的Quantabio PerfeCTa qPCR ToughMix 2xMastermix，来自VWR的Low ROX、0.05ul 100uM正向引物、0.05ul的100uM反向引物、.05ul的50uM探针、2.85ul的无核酸酶水和2ul的DNA模板。每次反应使用约1ng的DNA模板。反应在ThermoFisher QuantStudio

使用如上所述的测定，通过DNA片段的存在来鉴定表1中所列的其它甲基杆菌分离物及其变体。在表7中提供了用于此类方法的特有片段。

表7

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参考文献

Altschul S.F.，Gish W.，Miller W.，Myers E.W.，Lipman D.J.(1990)“基本局部对齐搜索工具(Basic local alignment search tool)”.《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215：403-410

Bentley D.R.，Balasubramanian S.，Swerdlow H.P.，Smith G.P.，Milton J.，Brown D.G.，Hall K.P.，Evers D.J.，Barnes C.L.，Bignell H.R等人(2008)“使用可逆终止子化学的精确全人类基因组测序(Accurate whole human genome sequencing usingreversible terminator chemistry)”.《自然(Nature)》456：53-59.

Caporaso J.G.，Lauber C.L.，Walters W.A.，Berg-Lyons D.，Huntley J.，Fierer N.，Owens S.M.，Betley J.，Fraser L.，Bauer M.，Gormley N.，Gilbert J.A.，Smith G.，Knight R.(2012)“Illumina HiSeq和MiSeq平台上的超高通量微生物群分析(Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq andMiSeq platforms)”.《国际微生物生态学学会杂志(ISME J)》6：1621-1624.

Comai等人(1983)“改变的aroA基因产物赋予对除草剂草甘膦的抗性(An alteredaroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate)”.《科学(Science)》221(4608)：370-371.

Green，P.N.2005.“甲基杆菌(Methylobacterium)”.在Brenner，D.J.，N.R.Krieg和J.T.Staley(编辑)“伯杰系统细菌学手册(Bergey′s Manual of SystematicBacteriology)”.第二卷(Volume two)，“变形菌门(The Proteobacteria).C部分，α-、β-、δ-和ε-蛋白酶原杆菌(Part C，The alpha-，beta-，delta-，and epsilonproteobacteria)”第二版.纽约斯普林格(Springer，New York).第567-571页.

Green，P.N.2006.“甲基杆菌(Methylobacterium)”.在Dworkin，M.，S.Falkow，E.Rosenberg，K.-H.Schleifer和E.Stackebrandt(编辑)“原核生物(The Prokaryotes).《细菌生物学手册(A Handbook on the Biology of Bacteria)》.第5卷.“变形菌门：α和β亚类(Proteobacteria：Alpha and Beta Subclasses)”第三版纽约斯普林格.第257-265页.

Green和Ardley(2018)“甲基杆菌属及其近缘生物体的综述：将一些甲基杆菌属种重新分类为新属Methylorubrum gen.nov的建议(Review of the genusMethylobacterium and closely related organisms：a proposal that someMethylobacterium species be reclassified into a new genus，Methylorubrumgen.nov)”.《国际系统和进化微生物学杂志(International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology)》68：2727-2748.

Konstantinidis，K.T.和Tiedje J.M.(2005)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》102：2567-2572.

Lidstrom，M.E.2006.“需氧甲基营养原核生物(Aerobic methylotrophicprokaryotes)”在Dworkin，M.，S.Falkow，E.Rosenberg，K.-H.Schleifer和E.Stackebrandt(编辑)“原核生物《细菌生物学手册》第2卷.《生态生理学和生物化学(Ecophysiology andbiochemistry)》”第三版.纽约斯普林格.第618-634液.

Sanger F，Nicklen S，Coulson AR(1977)“用链终止抑制剂进行DNA测序(DNAsequencing with chain-terminating inhibitors)”.《美国国家科学院院刊》.74(12)：5463-5467

Sy，A.，Giraud，E.，Jourand，P.，Garcia，N.，Willems，A.，De Lajudie，P.，Prin，Y，Neyra，M.，Gillis，M.，Boivin-Masson，C和Dreyfus，B.2001.“甲基营养型甲基杆菌与豆科植物共生时结瘤并固定氮(Methylotrophic Methylobacterium Bacteria Nodulate andFix Nitrogen in Symbiosis with Legumes)”.《细菌学杂志(Jour.Bacteriol)》.183(1)：214-220.

Vogel，H.J和D.M.Bonner.1956.“大肠杆菌的乙酰基鸟氨酸酶：部分纯化和一些特性(Acetylornithinase of Escherichia coli：Partial purification and someproperties)”.《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》218：97-106.

Whittenbury，R.，S.L.Davies和J.F.Wilkinson.1970.“利用甲烷的细菌的富集、分离和一些特性(Enrichment，isolation and some properties ofmethane-utilizingbacteria)”.《普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)》61：205-218.

已说明和描述本公开的原理，本领域的技术人员应显而易见，可在不脱离此类原理的情况下修改本公开的配置和细节。

尽管已经根据各种实施例和说明性实例描述了材料和方法，但是对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本公开的概念、精神和范围的情况下，可以对此处描述的材料和方法进行变化。对所属领域的技术人员显而易见的所有这些类似代替和修改均认为在如由所附权利要求书限定的本公开的精神、范围和概念内。

序列表

<110> 新叶共生有限公司

<120> 用于提高大豆产量的方法和组合物

<130> IP224857PCT-CN

<150> US 62/884,423

<151> 2019-08-08

<160> 79

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 1

ctcaacgttg ccgccttaac cgaagactaa ctaacataaa tttcagttag ccgcgaaaca 60

gaatatgata cttggtctta tacgacgcat agaggcgcat tccgtcaagt cgcgcattgc 120

agagtccccc cgaaaattcg ttttctggga gcgagcagaa acgtgtgcac gtgttctgtc 180

actctatttt ctggtttaga gcaatcatct cgcggctcag atcccgtcgt tccatagagt 240

ggtttccggt tcagtatgaa ttgtgagcag cccctgcggc tatatctact tcgacgtata 300

<210> 2

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 2

accaacaggc agaagaggct tacaaaaatg ctctagatat ctataatcgc gccggtctgg 60

ataataggcg ggaaaagtca aatattctta tcggacttgg cgatgcagct agcgcactga 120

gcaaatttat agacgcgaaa aatttctaca gtgaaggttt agcagtccga gcgcggtcat 180

gacggtgctt gcggactagt gtctgctcgc aattcagagc agccgcttcg gctggttcag 240

tttgggtatg ccctttctgt accagcctgt gactggtctg gtatgtagcc cttgaccaat 300

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 3

atgaagctcc gtcgtgttta tgtaaagaac gttcgcagtt tctacgatgc tgaagaactc 60

attctggacg gagatatttc tattattata ggcccaaatg gtggaggaaa aacaaatcta 120

cttgatgcga cgatacactt gttgagaaga catttattgc aatcgtgggc tgtcgttcgc 180

catacataca cgccaataaa ctattccgat cacttccaac caaatgatca aatcacaaac 240

tatgcgctgg agaagtacag cggtcgcgaa agcgaagacc aagtcgttga gttcgatatc 300

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 4

cgggggcggt ctcctcatat atggagggaa ttaatctgaa gggtcggagc ccccgctacg 60

gcacacacac ggcggcgggc ggtgggctcc ttcctcatat acgcttcctg ataatttcga 120

ccgtaatcgc ccgccggccg agcggccaga ccttattagt ccagcatcac acggtgcatc 180

gtatcgtgga gggcgaacaa ccgcctaagg ttcgccacgt agccatccac atccgccctt 240

gccgctcgcg caagggaagc agaatgcttg atagcgactt cgcgggcgtc tttggtagcc 300

<210> 5

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 5

tgtgggcgct catggaaacg ggggacgtgc ttttttgatc tctagccatt gtcatcatcc 60

atcggtccgg gtgacaggcc tttacgcaca taacaacggt tatttcgatc agccccctcc 120

tgatcgcaca agtcagctat acagatgctt ctgaaagcca acaaaggcgt tacgtatctg 180

cgtgacccca ccgagctgcg ctgcggcatc gctgacagct ctgtatttta attcgaggag 240

gtggggcaat ttagcctggt caagctcgcc aacgtcttcc ttcacatatt gagacaggac 300

<210> 6

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 6

agagtgtatt tccccaagac tttatctctt tgctcatcac aaaacagccc gctcaagatg 60

atatgcgctg ggatttgtgc cgcgacccgt tgtaattgta tttacctctc ggctcatgtt 120

ccctgtcgcc ggagcgattg gaggtaaagt aatctcaact ttgcggccca tggctgatgc 180

tagctcagct acgcgaccta aggtaatatc tttgtgtccg cggagttcgc gatgaatgac 240

cgagcgattg acgccgatgg tgcgggcaat atcggcttga gttagaccgt tcttggcttc 300

<210> 7

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 7

acctgtctcg acatcggggg cagccacgag gcgtcggccg tggtagatct cggcgaagcg 60

gtagtagtgg gcgaggtccc catcgggatc gatgggggag tccggcgtac cttctccctc 120

ttctgcgatt agcgacaggg ctcgcatggc gctgggtgcg tcagtgatgg cgaacaacct 180

actatcgggg aaccaccgcc tgtcgacgag ctggcggtcc gggtttcctt tgaagacagc 240

gtcacccagc gcttcgatct tctcaatcaa ggctgcgtag aactgcccga tggtcgcgaa 300

<210> 8

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 8

gacgtggtga cggtggcacc agtcgcccag cgaagcggct actgtactga gcccgcagtc 60

atgtcggctg aagaaatggt cgatatgccc cagggaggtc gggcgtaggt cgtacctcaa 120

attcaccggc aggatcttgt ccagcaaggc gtccgaattc gcatcgacct gacttaggaa 180

attaccgagg taatcgctcg gtccgttcgc gtcggcggcc tgcatcgcca gcagcgcctt 240

atgctcggtc gtcaactcac gagcgaatat tgtccaggac aggttgtcga cctcggcgac 300

<210> 9

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 9

gagcatggca ggccaccacg catcgcttct tcatcacctt gctcggacga cttgctgctt 60

tgtcggtctc tctctcaagg acgagacgct gcgacacttg cttcgtcaga gtgccaggat 120

taatcccggt caataccact actacgtcag ctggcgtgcg ccgggcggca cgagggacgt 180

cgacgcggaa cgattgattc gagacgctaa ctttgacgtg tacaatttag tcacgctttt 240

ccttagcgac gccgagatag cctcgttggg ccgcttgctc accgccgatg cagccgagtt 300

<210> 10

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 10

aacgcgatgg gagcagcacg taatgggcgt catacaagat ataaaagaag gacttgaagg 60

tagaatagat aaccttaagg aaaatattga taatatcagt tccagtatca catgcacaat 120

acaaggagtg ccgaaggtcg agtcagaaag aattttggga tgtgcaaacg cttcgtttga 180

ccaaatacag aaaatgtgga tgaatggtcc tacggatagg gctgcatttc tcgacgccgt 240

gaaaagtttg atagaccgca acgcaagtaa tggaaaattc ggagttccag gatcatattg 300

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 11

ttttcctttc gcgcctatga cctgagtgcg gccgaagctg tccgcttatt agagttttac 60

aaccagatgc gagcggctta gctcttcctc cgttattaag cagggcgcct cttcttaggg 120

gcgccccttc atatttaatc ttgtctgatg tctggcgcca tatcagacaa acatcagcgt 180

tgaccttgat tttgcatcta cattagggtt gctcccagaa tggagccgcc gatgtccgtc 240

ccgtacctca agcgagagat gtggggtgtg tattacatcc attggcgcga gggcggccgc 300

<210> 12

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 12

gttggagatg gtgccgtttg caaccgtcag atcgcctact gtgaatccgg tgacctcccg 60

agagaacgtg aaggtaactg tcgtagtctc gccaactgcc aaagaggtgt ccgcaacggc 120

gatggtcgct gtcggggcgc ttgtttggac atcaacggtg agacccgccg aggcaggccc 180

cgtgttacca gcggtatcga cggccctagc ggtgaccgtg tgcgatccag ccgttagcgt 240

cgaactggtg atgctatagg tcccgccgat cgccactgcc gagcccagaa tggtcgtgcc 300

<210> 13

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 13

accgaaggcg tccccggaca cgaaggcctg aaacaccata tctgtggcga tcaggccgac 60

gtggtcgcgg acttcaactg gcagagaatg ccaggccgct tcgatttcag atgatactgg 120

tacggacata ggagcggctt agctttctca gtgcaaatgt gattgattcc ggctcaaaaa 180

tgatcttgat cggacgagac gttttcaatc catgtcgtgt tgccatcgcc gatcggtgcg 240

tcaagagaca gatggcgccg accgtagata cgcgttcggg ttgcccgcac cgcttctcca 300

<210> 14

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 14

ggaggtgtga tctgatgatg tgctggatga aattggcggt cgagcacttg ttcagcttgg 60

ccagctcgac gagatcggcg tgatgctcgg cgtcgatcag gatgttcagc gagaccggac 120

gtacgcagga cttggtatta gcgccgttgc gcatcagctt gcagccttgc tctgcttctc 180

agcgtgccgc gtcaggatga ccctgatgta gctgttgagg ttgatgccgt aatagcctgc 240

ggactctgtg agatcccggc gaagatcgtc ggcgagggtc aggcggatgg tgctggtcgg 300

<210> 15

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 15

aagtaaccgc tcaacatgat cttcagcatg ttgtccaaca gcaggagaat acatgtaatt 60

caccatgacc ggcaagctgc gactggccat tgcttccacc gcttgaatgt agcgatcgaa 120

tttcgcaaaa tcagggtgga atgaaaatat cgaaccaaac tgcgagcctt gaatccgttc 180

tgcaaaatta tcgaaaaatt ttcttggccg actgccgttc gaaaacattc ttacgtttac 240

atgcggcccg cctgaaacaa gacagtctac cagctctggg aaatgggggt gaagggtcgg 300

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

cacgtgttct gtcactctat t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gaaccggaaa ccactctatg 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 18

agcaatcatc tcgcggctc 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gcgcactgag caaatttata g 21

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ctgaattgcg agcagaca 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 21

agtgaaggtt tagcagtccg 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

ctacttgatg cgacgataca c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ggttggaagt gatcggaata g 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 24

tcgttcgcca tacatacacg 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gctccttcct catatacgct tc 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ccgtgtgatg ctggactaat aa 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 27

taatttcgac cgtaatcgcc 20

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

tgatcgcaca agtcagctat ac 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cgagcttgac caggctaaat 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 30

acgcctttgt tggctttcag 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

cggagcgatt ggaggtaaag 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ctccgcggac acaaagatat ta 22

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 33

aatctcaact ttgcggccc 19

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

cttctccctc ttctgcgatt ag 22

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gacgctgtct tcaaaggaaa c 21

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 36

tgatggcgaa caacctact 19

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gcatcgacct gacttaggaa a 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

gagttgacga ccgagcataa 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 39

aggtaatcgc tcggtccgt 19

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ctttgtcggt ctctctctca ag 22

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

cagctgacgt agtagtggta ttg 23

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 42

tcgtcagagt gccaggatt 19

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

gttccagtat cacatgcaca atac 24

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

cgtaggacca ttcatccaca t 21

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 45

tttgggatgt gcaaacgct 19

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

gcttagctct tcctccgtta tt 22

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

attctgggag caaccctaat g 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 48

atcttgtctg atgtctggcg 20

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

cgtgaaggta actgtcgtag tc 22

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

caccgttgat gtccaaacaa g 21

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 51

aactgccaaa gaggtgtcc 19

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

cataggagcg gcttagcttt ct 22

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

gatggcaaca cgacatggat tg 22

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 54

cagtgcaaat gtgattgatt c 21

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

gacgtacgca ggacttggta ttag 24

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

ctcaacagct acatcagggt catc 24

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 57

ttgctctgct tctcagcgtg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

aaccaaactg cgagccttga 20

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

gggccgcatg taaacgtaag a 21

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 60

ttcttggccg actgccg 17

<210> 61

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 61

gcaaaacgac ctaatagttc tacagcggca tgcgccaagt cagcgcggtg aacagtatac 60

ctgggagcaa cttgtcctcc gaaacccaca taaaacaaat tactcctggc agtgcccagt 120

ccatcaaaat cgaatacaat atttctcgag gaggcatctg taatagcctg ccaaagcaac 180

aaagctatgg cgccgttatg actttcattg cttctggtag acataaaata atatgccgat 240

ttgtgatccc aaatgtagaa tattgccgca tcaattgcgc caagtttatt tcggatcgat 300

<210> 62

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 62

ggcgccaacg gtatgatcgc atgattttcc tgcggcatag cttgcgggaa tggcgtattt 60

ggcgctctcc tcaggaattt ctaagggcat acgcaggaac tctacagcac ttttactggt 120

attttgtagt gacagcggag gaggctggtg ctcaaggtaa tcgtgatgaa gtgatccggg 180

ccattcgggg cgcgtttcta gtctttccaa tccgcgccct gtaccacgta ttacgccgga 240

ccggtctgcg ccgcgccgcc ctcttgaccg ccctaaatgt ctaagagcgt ctaacaaagc 300

<210> 63

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 63

gacgatatcg ctcatcttca ctgcattgaa gctggtgccg tactgcatag ggatgaaaaa 60

gtgatgcgga tagacggctg acgggaaagc gcctggtcga tcgaagactt tgctgacgag 120

gttgtggtag ccccggatat aggcatcgaa ggccgggacg ttgatcccat cctttgcctt 180

atcttgactg gcgtcgtcgc gtgccgtcag aacgggcacg tcgcaggtca tcgaggccag 240

caccttgcgg aacacctgcg ttccgccgtt gggattatcg acggcgaacg cggtggccgc 300

<210> 64

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 64

gcccttctgt caggcgatat tgtataatgg cgttgcccca atagaagcag ccattcgtgc 60

gagggcagca gcgacgctag gtcgaaagag catcctaatc tcgatcaaga tgcgactgag 120

atttctgatg aaaatatcta gacacaagca aagctggtga aattacaacg atcatggcga 180

caattgcggc caattcggcc ggaacttgaa ggaacataaa aatgaatatt acaaatatac 240

cgcaaagcat gtagagttgc tacaccaagg gtcgggacgt ccaaaaaaac tcactgagga 300

<210> 65

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 65

ggaacataaa aatgaatatt acaaatatac cgcaaagcat gtagagttgc tacaccaagg 60

gtcgggacgt ccaaaaaaac tcactgagga agtcgactgg aagcacgagg cgcccccccc 120

aggagcgggg cgaccggcaa gggggcccgc aattgtcgcc atgatcgacc agcttaggta 180

ggatcctctt tcgacctaac gaatggctgc ttctattggg gcaacgccat tatacaatat 240

cgcctgacca tctggaacgc ggcccggtcc accggcaggt tggcgacgac agcgtcggag 300

<210> 66

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 66

cggcgtcgac cagccgggcg aactgcttgg gcatgctctc ccgcgacgcc ggccacagcc 60

gcgtccccgt ccctccgcac aggatcatcg ggtggatttg aaaggcaaaa cgggacatca 120

ggataggccg ctcaggcgtt ggcgctgagg cgcttgatgt cggcgtcgac catctcggtg 180

atcagcgcct cgaggctggt ctcggcctcc cagccgaagg tcgccttggc cttggcgggg 240

ttgcccagca gcacctcgac ctctgccggc cggaacagcg ccgggtcgac gatcaggtgg 300

<210> 67

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 67

ctggacatgc gcccaccccg gccaagtccg accgcaccgg caaccgctcc tgtagtcgtc 60

gtcatcgttc tcacccctga ggcggagacc gtccgctaac ggggtgtctc aagcaaccgt 120

ggggcggagg aacacgcacg tagtcgcgtt tcaaggttcg cacgaacgcc tcggccatgc 180

cgttgctctg cgggctctcc agcggcgtcg tttttggcac caaaccaagg tcgcgggcga 240

agcggcgcgt gtcgcgggga ctgtcaggaa tttcgtgtgg gggcggccat agtggatccg 300

<210> 68

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 68

ggaaatcggc ttcaagtacg acgtcacgcc ggccatgcag gtcacgggtg cactgttcaa 60

tctcgagcgc gacaaccagc cgttcccctc gaacgtggag tccggcctcg tccttggcgc 120

aggtcagaca cgcacccagg gcgcggaaat cggcctggcc ggctatctaa ccgattggtg 180

gcaggtcttt ggcggctacg cttataccga ggcacgcgta ctctcgccac tggaagacga 240

tggagacgtg atcgcagcag gtaatctcgt cggcaacgtt ccgctaaata ctttcagtct 300

<210> 69

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 69

cggcctggcc ggctatctaa ccgattggtg gcaggtcttt ggcggctacg cttataccga 60

ggcacgcgta ctctcgccac tggaagacga tggagacgtg atcgcagcag gtaatctcgt 120

cggcaacgtt ccgctaaata ctttcagtct gttcaacaag ttcgatatca acgagaattt 180

ctccgttgct ctgggctatt actatcagga tgccagcttt gcctcctcag acaatgcagt 240

gcgtttgcca agttattcgc ggttcgatgg cgggttgttc tatcgattcg acgagttgac 300

<210> 70

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 70

acgttccgct aaatactttc agtctgttca acaagttcga tatcaacgag aatttctccg 60

ttgctctggg ctattactat caggatgcca gctttgcctc ctcagacaat gcagtgcgtt 120

tgccaagtta ttcgcggttc gatggcgggt tgttctatcg attcgacgag ttgacacgcg 180

ttcagcttag cgtcgagaac attttcgaca ggcgttacat catcaactcc aacaacaaca 240

acaacctcac gcctggcgcg ccgagaacag tccgcgtgca attgatcgct cggttctaaa 300

<210> 71

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 71

agcccacaag cctgatgcac ttaactacat cctctaatgt cgcgccaatt tgcttggcgg 60

caggggatgt tgtatcgtca taggcttgtc taaccggaac ttgtttgcca atctctttgg 120

cgatcgcaac cgccatctcg tgttcgtcaa ccatgtgcgc gttcctctaa ttgcactcat 180

ggtgccacgt gcacctccga tcgtctcgtg tctagaatga aggtgggaac aaccttacac 240

aggctttcgc gacgcgcgaa tttctggttt ctccgcctcg gatgtgggtt tgagcgcttc 300

<210> 72

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 72

cttttcattt gtcatgatct cgaccaaggt attcacggca agctcggtct gttgcttagc 60

aagtgcctga acttcgcgaa cgatcggctc tcgacccttc gggttcgaga cctgtccctt 120

ttgaaaacca cgtgccctac acttttcggg atcaaggtgc gggttggctt tggtcaaaat 180

tctctggcgt cccattacac gccctccgca tcatcgttcc cgcgaacgat ctgacccccg 240

acttccgcga ggaagcgtgt ggcgtgatcc tcgaagcgga atgccacctc gaactgttcc 300

<210> 73

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 73

cagcagcaag cagatcgttg aaaaccgctt gaaccgcatc ttgatcggga ccggaaccaa 60

tcaggtcatc taggtaaacc gagacgtaaa ctcgtttgcg ctcggcatct ttcagaacgt 120

ccgtgatgcc agaccgcatt agtaccatcg tcgccaaggc gggcgactga acgaagccga 180

tcggcagaga gtaacgggga ccgcccctaa tcgggttgcg aacgcaagac cacttagcaa 240

aggttcgagc acggccgaac ttcgcatggt ggagagccgc ggcaacacgg ttccgtgata 300

<210> 74

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 74

tagacattcc aacaaaccgg caagaggctc gtcctcactc gaggatttgt tgggacttgc 60

atgatgtcga agcggagccg ttatgacctg ggtgcgatca tgcgccgagc atgggagatg 120

gctcgggagg cggcattcgc ggttggcgag cgggcacgga ctcaccttgc tgccgcgatg 180

cgcagcgcgt gggccgaagc caagttggca ctcgcgccca cgaagacgga gcaggatcgt 240

ctctctccga gcgacatgat cggacatgag gacgcctacc aaggccgggt tctaaaatat 300

<210> 75

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 75

aagatggata cgacaagcgc gattacatta tttgcgaaat agatggacaa ataaaagaca 60

aaggactgat gtatttcctt aaatctggac aagttgacct ctttcacata gaagtcacca 120

ctccctttgg gacaatttgg tgtcacgaaa acatagaggc cgaacttctt agctgaatta 180

tcgcgctccg ggttcttatg cggctgagtg aagcgcggga cagcttgcga gcagggccgc 240

caatggcagc cgggatgaca caatgctcgg tctcccgacg cttcttcaat cgggagcgct 300

<210> 76

<211> 299

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 76

agctgaatta tcgcgctccg ggttcttatg cggctgagtg aagcgcggga cagcttgcga 60

gcagggccgc caatggcagc cgggatgaca caatgctcgg tctcccgacg cttcttcaat 120

cgggagcgct tcgcagcccg gggcggcgcg ctcatgcgtc acgacctggg ccctgcgcac 180

cttcgcggcc ccgccgtccc ggcagatccc tgatgcccca agtgggcggc cactccatca 240

aagaaccccg gcctgtggca gatctcgtag gcataccgag gttccgcagt gcccccacc 299

<210> 77

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 77

acggtcaccc cacggactgg gcgagtacct caccggtgtt ctatcataac gccgagttag 60

ttttcgaccg tcccttatgc gatgtaccac cggtgtcggc agccgatttc gtcccaccgg 120

gagctggcgt tccggttcag accaccatca tcggtcacga tgtctggatt ggacacgggg 180

ccttcatctc ccccggcgtg actataggaa acggcgcgat cgtcggggcc caggcggtcg 240

tcacaagaga tgtcccaccc tatgcggtag ttgctggcgt ccccgcgacc gtacgacgat 300

<210> 78

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 78

ccaataaaag cgttggccgc ctgggcaacc cgatccgagc ctaagactca aagcgcaagc 60

gaacacttgg tagagacagc ccgccgacta cggcgttcca gcactctccg gctttgatcg 120

gataggcatt ggtcaaggtg ccggtggtga tgacctcgcc cgccgcaagc ggcgaattac 180

tcggatcagc ggccagcacc tcgaccaagt gtcggagcgc gaccaaaggg ccacgttcga 240

ggacgtttga ggcgcgacca gtctcgatag tctcatcgtc gcggcgaagc tgcacctcga 300

<210> 79

<211> 300

<212> DNA

<213> 甲基杆菌

<400> 79

cgatggcacc gacctgccat gcctctgccg tccgcgccag aatggtaaag aggacgaagg 60

gggtaaggat cgtcgctgca gtgttgagca gcgaccagag aagggggccg aacatcggca 120

tcaaacctcg attgccactc ggacgcgaag cgcgtcttga aggagggatg gaagcgaaac 180

ggccgcagag taaccgccga cgaaagattg cacccctcat cgagcaggat cggaggtgaa 240

ggcaagcgtg ggttattggt aagtgcaaaa aatataatgg tagcgtcaga tctagcgttc 300