一种降低菜豆离体再生体系褐化的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种降低菜豆离体再生体系褐化的方法。

背景技术

菜豆(Phaseolus vulgaris L.)，又称芸豆(俗称二季豆或四季豆)，是食用人群最多的食用豆类。菜豆中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素、纤维素及矿物质，蛋白质含量约为3％～6％，是植物中丰富的蛋白库，基本上可以满足非洲和拉丁美洲等一些国家人口对蛋白质的需求；同时菜豆也被称为“补钙冠军”，其钙含量约为0.3％～0.4％，是黄豆的近两倍；普通菜豆籽粒富含铁、钙、镁、锰和钾等矿物质元素，具有高蛋白、中淀粉、低脂肪以及营养元素丰富等特点，是人类饮食中植物蛋白的重要来源，深受消费者的喜爱。普通菜豆在l5世纪从欧洲引入中国，已有500多年的栽培历史。目前，中国种植的普通菜豆大多为地方品种，主要分布于云南、贵州、山西、陕西、甘肃、内蒙古和黑龙江等省区，是中国主要的出口创汇商品之一。

传统菜豆栽培种的产量低、病虫害严重，因此可以通过离体培养的方式来创新种质资源，选育新品种。菜豆离体培养研究国内仅有几例报道，且普遍存在诱导率不高、褐化严重的问题，褐化是植物离体再生培养中常见且不可避免的现象，尤其在豆科植物中。

因此本领域技术人员提供了一种降低菜豆离体再生体系褐化的方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导率高、低褐化率的降低菜豆离体再生体系褐化的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种降低菜豆离体再生体系褐化的方法，包括初代培养及生根培养，其中，所述初代培养包括以下步骤：

(1)选取饱满新鲜的种子，预处理后，接种于含MS培养基中，诱发形成无菌苗；

(2)用灭菌解剖刀从所得无菌苗上小心切取子叶节，将子叶节接种于防褐化培养基中，培养1周；

(3)然后切去主腋芽，再转瓶到防褐化培养基内继代培养，继代培养2周即可。

较佳地，所述预处理为将选取的种子，用75％酒精消毒1min，然后用无菌水冲洗3次后备用；用0.1％HgCl

较佳地，所述防褐化培养基由基础培养基及外源物质组成。

较佳地，所述基础培养基为MS、MSB5及B5中的一种。

较佳地，所述外源物质为6-BA、抗坏血酸、硝酸银及活性炭中的一种。

较佳地，所述6-BA在基础培养基中的添加量为1-2mg/L；所述抗坏血酸在基础培养基中的添加量为3-5mg/L。

较佳地，所述硝酸银在基础培养基中的添加量为20-40mg/L；所述活性炭在基础培养基中的添加量为0.5-1.5mg/L。

较佳地，所述生根培养的步骤为：将继代培养诱导后的不定芽转入生根培养基中进行生根培养，培养的时间为12-15天。

本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

本发明的降低菜豆离体再生体系褐化的方法，通过预处理诱发形成无菌苗，再将子叶节接种于防褐化培养基中进行初代培养及继代培养，有效改善了菜豆离体再生培养的褐化现象，褐化现象降到15.36％以下，炼苗移栽后成活率达89％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

实施例

一种降低菜豆离体再生体系褐化的方法，包括初代培养及生根培养，其中，所述初代培养包括以下步骤：

(1)选取饱满新鲜的种子，用75％酒精消毒1min，然后用无菌水冲洗3次后备用；用0.1％HgCl

(2)用灭菌解剖刀从所得无菌苗上小心切取子叶节，将子叶节接种于防褐化培养基中，培养1周；

(3)然后切去主腋芽，再转瓶到防褐化培养基内继代培养，继代培养2周即可。

本发明在前期试验基础上筛选出了“超级九粒白”菜豆作为供试品种、子叶节作为外植体，均在相对湿度为80％左右，16h/d光周期，光照强度2000lx的条件下培养。

其中防褐化培养基为分别添加了不同浓度的6-BA、抗坏血酸、硝酸银、活性炭的MS、MSB5和B5三种培养基。诱导出芽后再将未褐化的芽置于每种防褐化培养基的各添加物最优添加量下继续继代培养2周，每隔1周观察外植体芽的诱导情况，并记录数据。将诱导后的不定芽转接入前期试验筛选的生根培养基MSB5+1.0mg/L IBA培养基中进行生根培养，记录数据。

将子叶节分别接种在：MS、MSB5、B5+6-BA(1、1.5、2mg/L)；MS、MSB5、B5+抗坏血酸(3、4、5mg/L)；MS、MSB5、B5+硝酸银(20、30、40mg/L)；MS、MSB5、B5+活性炭(0.5、1、1.5mg/L)这四类培养基中各60块，进行诱导培养。培养7d后切去主腋芽，再继代培养2周。各培养基类型与添加物的比例详见表1，同时记录了褐化率、诱导率及平均芽数，详见表1。

表1

从表1结果可知，MS培养基上添加6-BA、抗坏血酸、硝酸盐和活性炭的褐化率最低的组合分别为MS+1.5mg/L6-BA、MS+4mg/L抗坏血酸、MS+30mg/L硝酸盐、MS+1g/L活性炭，其中褐化率最低的是MS+30mg/L硝酸盐，相应的，在该浓度组合下不定芽诱导率、平均芽数也处于较高水平。MSB5培养基褐化率最低的组合分别为MSB5+1mg/L6-BA、MSB5+4mg/L抗坏血酸、MSB5+30mg/L硝酸盐、MSB5+1g/L活性炭。

其中防褐化效果最好的是MSB5+1mg/L6-BA和MSB5+4mg/L抗坏血酸，诱导率和不定芽数前者稍高于后者；B5培养基褐化率最低的组合分别为B5+1mg/L6-BA、B5+5mg/L抗坏血酸、B5+30mg/L硝酸盐、B5+1.5g/L活性炭，防褐化效果最好的是B5+1mg/L6-BA.诱导率和平均芽数也高于其他组合。

从整体来看，三种培养基防褐化效果依次是：MSB5培养基>MS培养基>B5培养基。

将没有发生褐化的不定芽切去基部组织后接入各培养基各添加物最优添加量下继续继代培养，每周继代一次，继代2次后记录褐化率、诱导率和平均芽数，详见表2。

表2

从表2结果可知，同种培养基褐化率最低的分别是MS+1.5mg/L6-BA、MSB5+4mg/L抗坏血酸、B5+1.5g/L活性炭，同时该浓度组合下诱导率和平均芽数也较高。

防褐化效果依次是：MSB5+4mg/L抗坏血酸>MS+1.5mg/L6-BA>B5+1.5g/L活性炭。

生根培养实施例

将继代培养诱导后的不定芽转接入前期试验筛选的生根培养基MSB5+1.0mg/LIBA培养基中进行生根培养，培养时间14天，长出9～12条根，平均根长是8.20cm，炼苗移栽后成活率达89％。

本发明的降低菜豆离体再生体系褐化的方法，通过预处理诱发形成无菌苗，再将子叶节接种于防褐化培养基中进行初代培养及继代培养，有效改善了菜豆离体再生培养的褐化现象，褐化现象降到15.36％以下，炼苗移栽后成活率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。