用于南丰蜜桔特早熟品种桂月红鉴定的InDel标记开发及应用

技术领域

本发明属于遗传育种及分子生物学技术领域，具体为鉴定南丰蜜桔特早熟芽变品种‘桂月红’的分子标记引物及应用。

背景技术

南丰蜜桔是原产于我国的地方特色桔类品种，距今已有1300多年的栽培历史，因其果小皮薄、汁多无渣、味甜易剥等特点而享有“桔中之王”的美誉，南丰蜜桔同时也是江西省南丰县县域经济发展的支柱产业。然而种植规模和产量不断提升导致果实保有量激增，此外，品种结构单一，熟期集中以及苗木不纯等弊端也逐渐凸显。南丰蜜桔的价格也从早期的1.8元/斤逐年下滑至0.5～0.7元/斤，滞销现象频发。种植效益的不断降低遏制了桔农的种植积极性，管理粗放化程度加剧，造成果实品质的进一步下降，进而对南丰蜜桔品牌形象及口碑带来严重的负面影响。因此，需要选育具有与主栽品系存在明显熟期差异的南丰蜜桔新品种，拉开上市时期。目前多数柑桔新品种均来源于自然芽变，如何准确、快速地对芽变材料进行鉴定，这对于新品种保护及推广具有重要意义。传统鉴定芽变材料的方法主要通过形态学、细胞学和生化层面进行的，但存在着易受环境干扰、多态性较差以及区分度不高等弊端。鉴于市场中苗木品质良莠不齐和苗木不纯等现象频发，目前仅借助传统的鉴定技术已无法满足新品种鉴定需求，限制了产业良性发展。

分子标记技术直接以DNA序列差异为研究对象，从分子层面反映遗传物质的变化，与其它鉴定方法相比具有高效性、便捷性以及高多态性等诸多优良特性，鉴定结果稳定可靠，已逐渐成为芽变鉴定的首要手段。根据鉴定材料特性选择适宜的分子标记类型并建立对应的品种指纹图谱，可为后期品种真实性检测和苗木快速鉴定提供相应的技术支撑。分子标记技术的应用对于打击种苗假冒伪劣、保护育种人员和种植户利益、提高市场监管效率、维护产业健康发展具有重要意义。

InDel(Insertion/Deletion)标记是基于全基因组重测序的分子标记。其具有变异位点丰富，分布密度大；多态性高，具有较强的种间种内通用性；准确性高、变异稳定易于分型；检测简便，扩增产物带型清晰等优点。已在柑桔、苹果、玉米等全种类园艺作物品种鉴定上得到了广泛的应用。特早熟南丰蜜桔属于种内变异，应用形态学观察结合InDel标记可更准确地鉴定该芽变材料，提升南丰蜜桔新品种选育效率。

南丰蜜桔品种‘桂月红’是于江西省南丰县下甘村发现的南丰蜜桔特早熟芽变单株，其成熟期为9月下旬，相较于11月中旬成熟的普通南丰蜜桔品系提前了近60天。完熟的‘桂月红’果实为扁圆形，单果重量22.72g，无籽；果皮果肉均为金黄色，外观品质优良；可溶性固形物15.63％，可滴定酸0.49％，VC含量为22.44mg/100g，糖酸方面均显著优于同一时期的普通南丰蜜桔品系；年平均单株产量57.93kg，丰产稳产性良好，大小年现象不明显。

本发明旨在开发针对于‘桂月红’特早熟南丰蜜桔的特异性分子标记，有利于从分子水平上将该品种与目前主栽的南丰蜜桔品系进行区分界定，同时可为品种保护与快速鉴定提供技术支持。

发明内容

本发明通过对20个南丰蜜桔品种/品系材料进行全基因组重测序和分析筛选，获得2个核心InDel标记并进行引物设计，利用设计的两对InDel引物对，可对南丰蜜桔‘桂月红’品种实现特异性扩增，还可广泛应用于南丰蜜桔的遗传多样性分析。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

用于南丰蜜桔‘桂月红’品种鉴定的分子标记引物的获得：对本发明的20个南丰蜜桔品种/品系材料进行全基因组重测序后利用bwa软件将过滤并获得的clean reads与甜橙参考基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/download.php)进行比对。进一步对比分析‘桂月红’品种与其他19个南丰蜜桔品种/品系间的差异InDel位点，从而筛选出两者间的特异InDel位点。再根据结果选取插入/缺失片段大于3bp的InDel位点，同时剔除上下游50bp存在另外插入/缺失片段的InDel位点，最终获得差异InDel位点库。随后再基于甜橙全基因组序列，将筛选出的InDel位点定位在基因组上，取InDel位点两翼各300bp碱基长度，共600bp片段长度进行引物设计。利用设计合成的引物对南丰蜜桔‘桂月红’品种进行PCR扩增，筛选得到两对InDel引物：TZS-InDel-16和TZS-InDel-56，针对其设计的引物为TZS-InDel-16-F：GCATGACCAACATATGCTTG(SEQ ID NO.1)、TZS-InDel-16-R：AGACACATCATCGGTTGCAG(SEQID NO.2)和TZS-InDel-56-F：TCCACTTCGAAGGCCACACTTTCTG(SEQ ID NO.3)、TZS-InDel-56-R：ATGGAGGGATAGAGGAGGGT(SEQ ID NO.4)。

上述引物对在南丰蜜桔特早熟桂月红品种育种或品种鉴定中的应用：利用上述引物对在桂月红品种中扩增出189bp和259bp两条条带。

上述引物对在南丰蜜桔品种鉴定中的应用，所述的南丰蜜桔品种包括桂橘一号、南丰2号、杨小2-6、火桔、97-2小果和大叶红桔，具体地，桂橘一号扩增出185bp、195bp、259bp三条条带，南丰2号扩增出184bp、190bp、256bp、271bp四条条带，杨小2-6扩增出189bp、238bp、259bp、268bp四条条带，火桔扩增出182bp、190bp、238bp、259bp、269bp五条条带，97-2小果扩增出181bp、189bp、185bp、269bp四条条带，大叶红桔扩增出180bp、240bp、272bp三条条带。

与现有技术相比，本发明的优点：

1.分子标记技术操作便捷，不受组织类别、发育阶段、环境条件的影响，是DNA水平遗传多态性的直接反映。其中InDel标记具有遗传稳定性高、分布广泛、多态性高和适用于亲缘关系较近的品种间研究等优点。

2.本发明的分子标记引物可在南丰蜜桔芽变材料中扩增得到不同片段大小的DNA分子条带，该分子标记扩增稳定，可直接用于‘桂月红’品种的快速鉴定。

3.本发明提供的分子标记引物适用性广，可从20个现有的南丰蜜桔主栽品种/品系中对‘桂月红’品种进行鉴定，筛选出的TZS-InDel-16和TZS-InDel-56引物对‘桂月红’品种扩增后可分别特异性的获得189bp和259bp两条多态性条带。

4.本发明可特异性鉴定‘桂月红’品种外，还可根据所得到的条带数目和大小，对‘桂橘一号’、‘南丰2号’、‘杨小2-6’、‘火桔’、‘97-2小果’、‘大叶红桔’南丰蜜桔的不同品种/品系进行区分鉴定。

附图说明

图1：基于InDel引物TZS-InDel-16(A)与TZS-InDel-56(B)绘制的20个南丰蜜桔品种/品系指纹图谱。

具体实施方式

实施例1：用于南丰蜜桔‘桂月红’品种鉴定的分子标记引物的获得

选取20个南丰蜜桔品种/品系材料(表1)进行全基因组重测序后利用bwa软件将过滤并获得的clean reads与甜橙参考基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/download.php)进行比对。进一步对比分析‘桂月红’品种与其他19个南丰蜜桔品种/品系间的差异InDel位点，从而筛选出两者间的特异InDel位点。再根据结果选取插入/缺失片段大于3bp的InDel位点，同时剔除上下游50bp存在另外插入/缺失片段的InDel位点，最终获得差异InDel位点库。随后再基于甜橙全基因组序列，将筛选出的InDel位点定位在基因组上，取InDel位点两翼各300bp碱基长度，共600bp片段长度进行引物设计。

表1 20个南丰蜜桔品种/品系材料

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通过Primer Premier 5.0软件共设计出91对引物。其中86对引物扩增出目标条带，成功扩增率为94.5％；统计发现37对引物在两个及两个以上南丰蜜桔品系中显示出多态性，多态率为40.66％，多态性引物见表2。

表2引物序列

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进一步利用设计合成的InDel引物对南丰蜜桔‘桂月红’品种及其余18个南丰蜜桔品种/品系进行PCR扩增，筛选得到核心InDel标记：TZS-InDel-16和TZS-InDel-56，针对其设计的引物为TZS-InDel-16-F：GCATGACCAACATATGCTTG、TZS-InDel-16-R：AGACACATCATCGGTTGCAG和TZS-InDel-56-F：TCCACTTCGAAGGCCACACTTTCTG、TZS-InDel-56-R：ATGGAGGGATAGAGGAGGGT。

实施例2：用于南丰蜜桔‘桂月红’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用

(1)CTAB法提取20个南丰蜜桔品种/品系样品DNA(具体样品名称见表1)。

(2)以20份南丰蜜桔DNA为模板，进行以下PCR扩增反应。

a.PCR反应体系

25μL反应体系的配置：

两对InDel引物所用体系一致，所述引物F和引物R分别为TZS-InDel-16-F：GCATGACCAACATATGCTTG、TZS-InDel-16-R：AGACACATCATCGGTTGCAG和TZS-InDel-56-F：TCCACTTCGAAGGCCACACTTTCTG、TZS-InDel-56-R：ATGGAGGGATAGAGGAGGGT。

b.PCR反应条件

95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃-50℃(-1℃/循环)退火30s，72℃延伸30s，10个循环；95℃变性30s，47℃-60℃(根据引物退火温度设定具体数值)退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，12℃保持。

(3)采取全自动毛细管电泳系统(QI Advanced，QIAGEN)对PCR扩增产物进行分离，仪器操作流程遵循QIAxcel Advanced厂家说明书进行。

a.样品运行

分别准备装有15μL Alignment Marker和Size Marker稀释液的12联排管，确保液体中没有液泡。将准备好的Alignment Marker放入buffer试剂槽中的MARKER 1位置。打开样品门，将样品与Size Marker共同放入96孔架中。若96孔架中某孔中样品存在空缺，空缺处使用15μL DNA dilution buffer进行补齐。设置运行参数、Size Marker位置，并在样品选择界面设置样品行、Alignment Marker等信息。设置完成后点击“运行”按钮开启运行进程。

b.结果分析

根据Alignment Marker对齐各个毛细管泳道的绝对迁徙距离，配合系统中赋值得出样品条带的结果，所有结果的处理与分析都在QIAxcel ScreenGel软件中进行。

(4)利用筛选的TZS-InDel-16和TZS-InDel-56两对引物扩增全部南丰蜜桔DNA样品，仅‘桂月红’品种可在扩增后分别特异性的获得189bp和259bp两条多态性条带，结果如图1(A：引物TZS-InDel-16，B：引物TZS-InDel-56)所示。

此外，根据筛选出两对核心引物扩增全部材料所得条带的数目和大小绘制20个南丰蜜桔指纹图谱(表4)，可进一步对南丰蜜桔的不同品种/品系包括：桂橘一号、南丰2号、杨小2-6、火桔、97-2小果和大叶红桔进行区分鉴定，具体扩增结果如表3所示：

表3扩增结果

注：3(185,195,259)表示扩增条带数为3，扩增片段大小分别为189,195和259bp，依次类推。

表4 20个南非蜜桔品种/品系指纹图谱

注：在相同的迁移位置上，以“1”“0”标记扩增片段多态性的有无，有条带标记“1”，无条带标记“0”。