SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用以及构建的基因工程菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用以及构建的基因工程菌。

背景技术

杆菌霉素L(Bacillomycin L)是一种由七个氨基酸残基(L-Asp-D-Tyr-D-Asn-L-Ser-L-Gln-D-Ser-L-Thr)的多肽链和14-17个β-氨基脂肪酸链连接组成的两亲性脂肽类化合物，与Iturin A、C、D、E，Bacillomycin D、F、Lc和Mycosubtilin同属于“Iturin”家族。杆菌霉素L对大部分酵母和霉菌有良好的抗真菌活性，也具有较好溶血活性。除此之外，杆菌霉素L能通过降解真菌细胞膜上的磷脂，改变细胞膜的通透性使真菌失去活性死亡。鉴于杆菌霉素L在农业生产、医药及环境治理等领域具有广泛的应用前景，但是贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314在微生物发酵工艺下生产杆菌霉素L的产量较低，选育能高效生产杆菌霉素L的微生物资源具有重要的价值。

杆菌霉素L以非线性核糖体途径合成，其基因簇全长约39kb，含有4个开放阅读框架，分别编码Bac D、Bac A、Bac B和Bac C四种多功能复合酶以催化完成合成过程。杆菌霉素L具有较强的抗真菌活性，是一种具有良好应用前景的抗微生物制剂。然而，野生菌株中低产量的特性限制了其进一步应用。申请人前期研究显示杆菌霉素L在贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中的产量极低，这是限制其应用的最大瓶颈。因此，挖掘与杆菌霉素L合成相关的调控基因，阐明其合成途径，可以为提高其产量奠定基础，再结合同源重组等技术手段构建高产工程菌，这对促进其开发应用具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对目前现有菌株生产杆菌霉素L的产量甚少，限制其广泛的运用，本发明提供SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用，本发明通过对以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组中负调控基因SerA及FliZ基因进行敲除或者缺失构建得到了全新的高产杆菌霉素L的基因工程菌。

本发明还提供所述高产杆菌霉素L的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述SerA和/或FliZ编码基因在调控贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量中的应用。

其中，通过敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌中SerA和/或FliZ编码基因提高贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量。

本发明所述一种高产杆菌霉素L的基因工程菌，所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SerA和/或FliZ所得。

其中，所述负调控基因SerA，FliZ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314。

本发明所述高产杆菌霉素L的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SerA，FliZ编码基因为模板设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的基因组DNA作为模板，扩增到部分SerA，FliZ基因片段；

(2)同源重组质粒载体pMUTINSerA的构建：扩增的SerA基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSerA；

(3)同源重组质粒载体pUCSCFliZ的构建：扩增的FliZ基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCFliZ；

(4)SerA基因失活突变菌株ΔSerA的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSerA转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314得到高产杆菌霉素L的SerA基因失活突变株ΔSerA；

(5)FliZ基因失活突变菌株ΔFliZ的构建：将构建好的重组质粒pUCSCFliZ转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314得到高产杆菌霉素L的FliZ基因失活突变株ΔFliZ；

(6)SerA与FliZ双基因失活突变菌株ΔSerA+FliZ的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSerA转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314突变株ΔFliZ中得到高产杆菌霉素L的SerA与FliZ双基因失活突变菌株ΔSerA+FliZ。

作为优选，步骤(1)所述的引物为SerA-F(5′-TTTAAGCTTCTCAGATAAGATGAGCAATG-3′)和SerA-R(5′-TTTGGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′)用于扩增SerA基因片段；FliZ-F(5’-TTTGGATCCTCTGCATCTTCTGTCTCCGC-3’)和FliZ-R(5’-TTTAAGCTTCTGATATCGCATAAGCGGG-3’)用于扩增FliZ基因片段。

作为优选，本发明所述高产杆菌霉素L的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SerA及FliZ编码基因为模板设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的基因组DNA作为模板，扩增获得部分SerA及FliZ基因片段；

(2)以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中SerA编码基因序列设计引物SerA-F和SerA-R，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组为模板，扩增部分SerA基因，获得757bp基因片段，扩增的SerA基因片段经过HindIII和BamHI双酶切，然后经过T4DNA连接酶连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCSerA转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314得到高产杆菌霉素L的基因工程菌SerA基因突变株ΔSerA；以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中FliZ编码基因序列设计引物FliZ-F和FliZ-R，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组为模板，扩增部分FliZ基因，获得921bp基因片段，扩增的FliZ基因片段经过BamHI和HindIII双酶切，然后经过T4DNA连接酶连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINFliZ，转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314得到高产杆菌霉素L的基因工程菌FliZ基因突变株ΔFliZ。

(3)ΔSerA突变菌株的构建

以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的SerA基因突变载体pMUTINSerA转化入贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，其中，所述重组质粒载体pMUTINSerA含有SerA基因同源双交换臂，红霉素抗性基因，可定向对贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中的SerA基因进行失活。

(4)ΔFliZ突变菌株的构建

以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的FliZ基因突变载体pUCSCFliZ转化入贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，其中，所述重组质粒载体pUCSCFliZ含有FliZ基因同源双交换臂，壮观霉素抗性基因，可定向对贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中的FliZ基因进行失活。

(5)ΔSerA+FliZ双基因失活突变菌株的构建

以突变菌株ΔFliZ为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的SerA基因突变载体pMUTINSerA转化入突变菌株ΔFliZ，其中，所述重组质粒载体pMUTINSerA含有SerA基因同源双交换臂，红霉素抗性基因，即可得到具有红霉素和壮观霉素抗性的SerA及FliZ双基因失活突变菌株ΔSerA+FliZ。

本发明所述高产杆菌霉素L的基因工程菌在发酵生产杆菌霉素L中的应用。

其中，所述发酵为通过基因工程菌进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在35-38℃，溶氧在25-35％之间；发酵周期40-50h。

作为优选，所述发酵培养基组成为：蔗糖20g/L，麦芽糖浆40-50g/L，玉米浆15-20g/L，尿素0.6-0.8g/L，K

作为优选，在上述发酵培养基和发酵条件可以提升所述高产工程菌中杆菌霉素L的产量达到3.67g/L。

本发明所述SerA和/或FliZ编码基因在调控贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量中的应用。

现有对杆菌霉素L的调控机理认识不清，导致对杆菌霉素L的研究进展缓慢，且菌株所产杆菌霉素L的产量较低，影响其后续商业化生产与运用。本发明通过基础研究，发现SerA和FliZ两个调控因子对杆菌霉素L的负调控作用，初步打断了对杆菌霉素L研究的瓶颈，提高了杆菌霉素L的产量，使杆菌霉素L的商业化生产成为可能。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次发现通过敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌中SerA和/或FliZ编码基因提高贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量。本发明利用同源重组的方法，成功构建了一株提高杆菌霉素L产量的菌株ΔSerA+FliZ。与原始菌株CPLK1314相比，经过菌种改良的菌株ΔSerA+FliZ产生杆菌霉素L的能力显著提高，产量是原始菌株CPLK1314的12倍，远超现有其他野生菌菌株或者工程菌株杆菌霉素L的产量。

此外，本发明还揭示了SerA及FliZ基因对杆菌霉素L的产生有阻抑作用，利用pUCSCFliZ及pMUTINSerA载体对任何可遗传转化的贝莱斯芽孢杆菌进行基因改良，以获得相应的改良菌种，达到提高杆菌霉素L产量的目的。在优化后的培养基中每升发酵液可制备获得3.67g杆菌霉素L纯品。本发明的基因工程菌及其构建方法为加速杆菌霉素L的产业化带来了可能与希望，也为其他脂肽类抗生素高产菌株的构建及产业化提供了可行的思路方案。

附图说明

图1为SerA及FliZ部分基因突变载体的构建流程图；

图2为为SerA及FliZ同源重组整合质粒载体验证电泳图；

图3为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314、突变株ΔSerA、突变株ΔFliZ、突变株ΔSerA+FliZ对镰刀菌孢子萌发抑菌活性的测定示意图；

图4为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314、突变株ΔSerA、突变株ΔFliZ、突变株ΔSerA+FliZ产杆菌霉素L高效液相色谱分析示意图；

图5为杆菌霉素L质谱分析图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

其中贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，保藏号CCTCC NO：M2017658，在很多在先申请中均有报道如CN112522169A(原名为解淀粉芽孢杆菌CPLK1314，现统一更名为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314)，由淮阴工学院提供，表面活性素、杆菌霉素L、杆菌霉素L和泛革素4种脂肽类抗生素高效制备方法及其生物学活性，西南农业学报，2018年31卷11期。

其中枯草芽孢杆菌Bs916，保藏号CGMCC No.0808，在很多在先申请中均有报道如CN103524600A，由淮阴工学院提供。

用于测定抑菌活性的是西瓜枯萎病原体镰刀菌，为野生型镰刀菌，由淮阴工学院提供。

其中pMUTINLoc质粒以pMUTIN4为骨架，在多克隆位点HindIII和BamHI处插入了外源DNA片段Loc(以LocDF(5’-TTTAAGCTTTCAGGTACCAACGATGAACA-3’)和LocDR(5’-TTTGGATCCTTGTCCATTACAGCTACGGT-3’)作为引物，以枯草芽孢杆菌Bs916的基因组DNA作为模板，PCR扩増到一条长812bp的片段为Loc，SEQ ID NO.3)，pMUTIN4购于美国芽孢杆菌菌株保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)，质粒编号为ECE139。

pUCSCSrf质粒以pUCSC为骨架，在多克隆位点HindIII和BamHI处插入了外源DNA片段Srf(以SrfA-AF(5’-TTTAAGCTTACACAGATATCAGGCAAGC-3’)和SrfA-AR(5’-TTT

以SpecF(5’-TTTGGATCCCTGCAGCCCTGGCGAATG-3’)和SpecR(5’-TTTGAATTCAGATCCCCCTATGCAAGG-3’)作为引物，以pDG1728质粒作为模板，PCR扩増到一条长1182bp的含有壮观霉素表达盒的片段；表达盒经BamHI和EcoRI双酶切后克隆至pUC19载体，构建为重组载体pUCSC。

质粒的构建参考文献：罗楚平.枯草芽孢杆菌Bs916产杆菌霉素L、表面活性素、杆菌霉素和泛革素的结构鉴定、合成途径及生物学功能[D].南京农业大学，2014.

SP盐：0.2％(NH

CAYE(100×)：2％Casamino acid，10％酵母膏。

SpI培养基：SP盐溶液加入1％体积浓度为50％葡萄糖溶液以及1％体积100×CAYE溶液。

SpII培养基：SPI培养基加入1％体积50mmol/L CaCl

实施例1

SerA及FliZ基因突变载体的构建

以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中基因组SerA基因基因序列设计引物SerA-F(5′-TTTAAGCTTCTCAGATAAGATGAGCAATG-3′)和SerA-R(5′-TTTGGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′)，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组为模板，扩增部分SerA基因序列，获得757bp基因片段；采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：94℃5min；35×(94℃30s；55℃30s；72℃1.5min)；72℃10min。如图2c所示，泳道4为扩增的SerA片段。

以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组中FliZ基因序列设计引物FliZ-F(5’-TTTGGATCCTCTGCATCTTCTGTCTCCGC-3’)和FliZ-R(5’-TTTAAGCTTCTGATATCGCATAAGCGGG-3’)用于，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组为模板，扩增部分FliZ基因序列，获得921bp基因片段；采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：94℃5min；35×(94℃30s；52℃30s；72℃1.5min)；72℃10min。如图2c所示，泳道5为扩增的FliZ片段。

PCR反应体系详见表1。扩增片段经过切胶回收后，保存备用。

表1PCR反应体系

将扩增获得的部分SerA片段与pMUTINLoc质粒经BamHI和HindIII 37℃双酶切3h后进行切胶回收，回收产物借助快速连接试剂盒(T4连接酶)进行连接(图1)。所得的连接产物可直接将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含氨苄青霉素的LB固体平板进行阳性克隆子的筛选。进一步地，对正确的转化子进行菌落PCR检测鉴定，以步骤(1)中所设计的上下引物进行扩增，以正确的转化子的菌落为模板，扩增条件如步骤(1)，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2c泳道6，为757bp大小的条带。其结果验证正确。通过提取质粒，酶切验证，如图2a所示，泳道2为经HindIII和BamHI双酶切后的pMUTINLoc质粒。重组质粒pMUTINSerA(图2a)双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到757bp和8610bp两条大小的条带，与预期结果相符合。验证成功的载体可用于枯草芽孢杆菌的转化。

将扩增获得的部分FliZ片段与pUCSCSrf质粒经HindIII和BamHI37℃双酶切3h后进行切胶回收，回收产物借助快速连接试剂盒(T4连接酶)进行连接(图1)。所得的连接产物可直接将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含氨苄青霉素的LB固体平板进行阳性克隆子的筛选。进一步地，对正确的转化子进行菌落PCR检测鉴定，以步骤(1)中所设计的上下引物进行扩增，以正确的转化子的菌落为模板，扩增条件如步骤(1)，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2c泳道5，为921bp大小的条带。其结果验证正确。通过提取质粒，酶切验证，如图2b所示，泳道3为经HindIII和BamHI双酶切后的pUCSCSrf质粒。重组质粒pUCSCFliZ(图2b)双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到921bp和4705bp两条大小的条带，与预期结果相符合。验证成功的载体可用于枯草芽孢杆菌的转化。

实施例2

基因突变芽孢杆菌ΔSerA、ΔFliZ、ΔSerA+FliZ的构建

将构建好的pMUTINSerA突变载体转化贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，通过同源重组的方式整合到贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组上，在CPLK1314基因组SerA位点发生双交换，抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为ΔSerA。该菌株的SerA基因被红霉素抗性基因所插入突变，成为突变了SerA基因的突变菌株，即所改良的菌株ΔSerA。

将构建好的pUCSCFliZ突变载体转化贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，通过同源重组的方式整合到贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组上，在CPLK1314基因组FliZ位点发生双交换，抗性平板上筛选得到壮观霉素抗性菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为ΔFliZ。该菌株的FliZ基因被壮观霉素抗性基因所插入突变，成为突变了FliZ基因的突变菌株，即所改良的菌株ΔFliZ。

具体过程为：挑贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314单菌落接种至25mLSpI培养基，30℃、180r/min振荡培养过夜。以1:25体积接种到新鲜的SpI培养基，30℃、250r/min振荡培养OD600至2.0，约3.5h；以1:10体积接种到SpII培养基，37℃、150r/min振荡培养1.5h后，以5000r/min离心收集。菌体以上清液1/10体积进行悬浮即用作贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314感受态细胞。在250μL感受态细胞中加入终浓度为1mmol/L EGTA，37℃，150r/min振荡培养，10min后加入1μg pMUTINSerA或者pUCSCFliZ质粒，37℃，150r/min振荡培养1h，再以37℃，250r/min继续振荡培养30min。最后涂布在含有红霉素(1μg/mL)或者壮观霉素(50μg/mL)的LB抗性平板上。

将构建好的pMUTINSerA突变载体转化至突变菌株ΔFliZ，通过同源重组的方式整合到突变菌株ΔFliZ基因组上，在突变菌株ΔFliZ基因组SerA位点发生双交换，抗性平板上筛选得到具有红霉素和壮观霉素抗性的菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为ΔSerA+FliZ。该菌株的SerA基因被红霉素和壮观霉素抗性基因所插入突变，成为突变了SerA基因和FliZ基因的突变菌株，即所改良的菌株为ΔSerA+FliZ。

具体过程为：挑突变菌株ΔFliZ单菌落接种至25ml SpI培养基，30℃、180r/min振荡培养过夜。以1:25体积接种到新鲜的SpI培养基，30℃、250r/min振荡培养OD600至2.0，约3.5h；以1:10体积接种到SpII培养基，37℃、150r/min振荡培养1.5h后，以5000r/min离心收集。菌体以上清液1/10体积进行悬浮即用作突变菌株ΔFliZ感受态细胞。在250μL感受态细胞中加入终浓度为1mmol/L EGTA，37℃，150r/min振荡培养，10min后加入1μgpMUTINSerA质粒，37℃，150r/min振荡培养1h，再以37℃，250r/min继续振荡培养30min。最后涂布在含有红霉素(1μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的LB双抗性平板上。

实施例3

贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，SerA基因失活突变株ΔSerA和FliZ基因失活突变株ΔFliZ、以及突变株ΔSerA+FliZ对镰刀菌孢子萌发抑菌活性的测定

具体步骤包括：活化贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314、突变菌株ΔSerA、突变菌株ΔFliZ和突变菌株ΔSerA+FliZ，取各个突变菌株单菌落于5mL LB液体培养基中于180rpm/min、37℃恒温箱中培养48h。将100mL LB固体培养基冷却至46℃后倒入无菌平板中，将平板做好标注。将镰刀菌孢子稀释到10

如图3，第3天贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314抑菌圈半径为5.5mm，ΔSerA抑菌圈半径为9.6mm，ΔFliZ抑菌圈半径为8mm，突变菌株ΔSerA+FliZ抑菌圈半径为11.0mm，抑制区面积分别为野生型菌的3倍，2.11倍，4倍。

综上所述，菌株ΔSerA+FliZ对镰刀菌孢子萌发有良好的抑制效果，并且比原始菌株和前两种突变株显著增效。

实施例4

贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314、突变菌株ΔSerA、突变菌株ΔFliZ和突变菌株ΔSerA+FliZ发酵产杆菌霉素L的定性定量分析

活化贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314、突变菌株ΔSerA、突变菌株ΔFliZ和突变菌株ΔSerA+FliZ，分别挑取单菌落至5mlLB液体培养基中37℃、180r/min培养12h，制备种子液，按照体积比1％接种量将种子液接入含有200ml LB培养液的500mL摇瓶中，37℃，180rpm培养48h，菌液离心(10000r/5min)取上清液酸沉，加盐酸调pH值2.8，在4°冰箱中静置24h，再次离心(12000r/15min)，取沉淀用100％甲醇浸提，浸提物过0.22μm滤膜，获得杆菌霉素L粗提物。

将粗提物采用去离子水稀释为含30％甲醇水溶液，加氢氧化钠调pH至7.0，过NH2固相萃取柱，分别用50％甲醇水，100％甲醇，0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在1％甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。将含1％甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30％甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用3倍柱体积的30％，50％，70％，90％甲醇水溶液梯度洗脱，其中在含70％甲醇水洗脱液中得到杆菌霉素L的纯品，将该含70％甲醇水的洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，得到杆菌霉素L纯品。

杆菌霉素L用于高效液相色谱检测(HPLC)的检测条件如下：采用C18(5μm；4.6×250mm；VYDAC218TP；VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸(40：60：0.5vol/vol)，流速0.5mL/min

实验结果如图4所示，目标化合物在1％甲酸甲醇洗脱溶液中检测到，杆菌霉素L同系物A的保留时间分别为12.2min，杆菌霉素L同系物B保留时间为17.03min。其中，出发菌株贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的峰面积为7026.3，突变体ΔFliZ的峰面积为13697.72，突变体ΔSerA的峰面积为48998.48，突变体ΔSerA+FliZ的峰面积为78967.4，即突变体ΔFliZ的产量约是野生型的2倍，突变体ΔSerA的产量约是野生型的7倍，突变体ΔSerA+FliZ的产量约是野生型的12倍，说明突变体ΔSerA+FliZ敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SerA和FliZ显著增效。此外，采用本发明优化后的培养基，其杆菌霉素L可以进一步提高(详见实施例5)。

杆菌霉素L的质谱检测操作如下：将上述杆菌霉素L纯品甲醇溶解后，通过电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2进行检测，喷雾条件为：毛细管电压32V，喷雾电压20kV，毛细管温度320℃。检测方式：正离子模式。结果如图5所示杆菌霉素L制备成功，其质谱图中含有2个主要的质荷比峰(m/z)，分子量分别为1044.7和1058.7，即杆菌霉素L的同系物A和B，二者相差一个亚甲基(-CH2)。

实施例5

突变菌株ΔSerA+FliZ高产杆菌霉素L的发酵培养基优化。

首先，利用LB培养基活化贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，突变株ΔSerA，突变株ΔFliZ和突变株ΔSerA+FliZ，37℃，180rpm条件下培养24h。

以此对数期培养液作为种子液，按体积比15％接种量接种于3L的LB培养基或优化培养基(蔗糖20g/L，麦芽糖浆40g/L，玉米浆15g/L，尿素0.8g/L，K

表1贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314和突变株ΔSerA+FliZ发酵产杆菌霉素L

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