软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9及其应用

技术领域

本申请属于猕猴桃基因工程技术领域，具体涉及一个软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9及其应用专利申请事宜。

背景技术

果树生产效益很大程度上取决于果实品质，品质提升是果树育种的重要目标之一。软枣猕猴桃作为近年的一种新兴果品，具有果形特异、果皮可食、无需后熟、采下即食的特性，特别是红色软枣猕猴桃外观鲜艳靓丽，富含花色苷抗氧化物质，受到了广大消费者的喜爱。但实际栽培中，软枣猕猴桃普遍存在着色不良、口感欠佳、采前落果等品质较差的生产问题，进而使得这一果品的推广受到了较大障碍。

遗传学研究表明，生物表型的显现取决于两个重要因素：遗传因素和环境因素，即基因型和环境因子。其中，基因型从根本上决定了生物是否具有表现该性状的能力，环境因子则对性状强弱具有直接影响。

近年来，随着基因工程技术的快速进展，以及猕猴桃基因工程的展开，挖掘与猕猴桃果实品质相关基因，对于改善果品品质、培育新品种，都具有极为重要的技术意义。

发明内容

本申请目的在于提供一个与软枣猕猴桃（

本申请所采取的技术方案详述如下。

软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下：

ATGTCTAGTGAGAAAGAGAAAGAATCGGCCGAGGGCTCGTCGCGATCGACGGCGACCATAAGCCGGTATGAGTCGCAGAAGCGTCGAGACTGGAACACCTTTGGCCAGTATTTGAAAAATCACATGCCGCCTGTACCTCTGTCTCAGTGCACTTGCAACCATGTCCTCGAGTTCCTTCGTTATCTCGATCAGTTCGGGAAGACTAAGGTTCACTTACATGGGTGTGTGTTTTTCGGGCAGCCAGACCCACCTGCCCCGTGCACTTGCCCGCTGAGGCAAGCGTGGGGATCGCTGGATGCCCTGATCGGACGGCTGAGAGCCGCCTATGAGGAGCACGGCGGGTCCCCGGAGACGAACCCATTTGGGAACGGGGCGATACGTGTATATTTACGGGAAGTTAAGGAGTGCCAAGCGAAGGCGCGAGGGATTCCGTACAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGATGATCAAAGCAAACCATGAAGAACTCAAGTCTTCCAAACAGCCCACTTGA。

所述软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9所编码蛋白光响应蛋白，其氨基酸序列（169aa）如SEQ ID No.2所示，具体为：

MSSEKEKESAEGSSRSTATISRYESQKRRDWNTFGQYLKNHMPPVPLSQCTCNHVLEFLRYLDQFGKTKVHLHGCVFFGQPDPPAPCTCPLRQAWGSLDALIGRLRAAYEEHGGSPETNPFGNGAIRVYLREVKECQAKARGIPYKKKKKKKKMIKANHEELKSSKQPT。

PCR扩增所述软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9用引物对，具体设计如下：

F：ATGTCTAGTGAGAAAGAGAAAGAATCG；

R：TCAAGTGGGCTGTTTGGAAGA。

所述软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9在软枣猕猴桃中应用，软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9所编码蛋白作为转录因子，与光响应相关。

含有所述软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9的重组超表达载体，以pBI121质粒为载体，重组含有AaHY5like9基因。

利用所述软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9的拟南芥新品种培育方法，通过超表达软枣猕猴桃光响应基因AaHY5like9，用于调节拟南芥种子发芽后的下胚轴长度。

多年调查研究中，发明人认为，软枣猕猴桃栽培中，光照不良（果园郁蔽）所导致的果实受光不足或者不均，是导致果实品质较差的主要原因。其技术原理是：一方面，光为植株正常进行光合作用提供了能量，保证了果实的生长发育，另一方面，光作为环境信号参与了果实的形态建成。因此，果实生长发育过程中接受足够的光照是高品质果实形成的前提。鉴于基因在果实品质中的决定性作用，因此，通过挖掘关键光响应基因对提升果实品质具有重要的技术意义。

本申请中，发明人利用全基因组水平的家族鉴定，克隆获得了一个与软枣猕猴桃果实品质相关的关键光响应基因AaHY5like9，并结合相关重组表达载体构建和异源转化验证，证实了AaHY5like9具有光响应特征。基于这一结果，可为软枣猕猴桃果实品质调控、以及高品质软枣猕猴桃新品种培育奠定一定基因遗传资源基础。

附图说明

图1为中华猕猴桃中15个HY5like基因的染色体位置分布示意图；

图2为中华猕猴桃中 15个HY5like基因结构分析；

图3为中华猕猴桃中 15个HY5like成员与其他32个物种HY5基因的系统发育分析；

图4为软枣猕猴桃中AaHY5like基因的同源克隆和候选基因的表达模式分析；其中：

a为15个中华猕猴桃中HY5like基因在软枣猕猴桃中的同源克隆结果；

b为软枣猕猴桃中AaHY5like2的表达水平分析；

c为软枣猕猴桃中AaHY5like9的表达水平分析；

d为软枣猕猴桃中AaHY5like11的表达水平分析；

e为软枣猕猴桃中AaHY5like2、AaHY5like9、AaHY5like11三个基因的表达模式聚类分析；

图5为软枣猕猴桃中AaHY5like9的亚细胞定位结果；其中：

a为所构建重组质粒载体pBI121::AaHY5like9结构示意图，其带有35S启动子和GFP标签；

b为绿色荧光信号的观察结果，可以看出：只携带GFP标签的空载体pBI121荧光位于细胞核和细胞质，而AaHY5like9-GFP定位于细胞核；

图6为拟南芥hy5突变体遗传转化PCR阳性检测结果；其中：前面16个泳道为阳性植株，片段大小670 bp，最后一个泳道为阴性对照（NC）；

图7为拟南芥hy5突变体的回补结果；其中：

a为野生型、hy5突变体、AaHY5like9转化hy5突变体的下胚轴表型；

b为下胚轴长度统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例1

鉴于光照对果树果实品质的重要影响，结合软枣猕猴桃栽培和果实品质改良需要，发明人认为有必要对软枣猕猴桃中光响应相关基因进行进一步挖掘和分析。因此，本实施例首先就相关基因的挖掘过程简要介绍如下。

（一）猕猴桃全基因组水平HY5基因家族鉴定

首先，发明人以中华猕猴桃（

进一步的，按照注释信息，将这15个基因按照染色体排列的先后顺序分别命名为HY5like1-HY5like15。同时，这15个HY5like基因不规则的分布于10条染色体上（Chr.3、Chr.12、Chr.13、Chr.15、Chr.17、Chr.18、Chr.22、Chr.23、Chr.26、和Chr.28）（参见图1）。

对这15个HY5like成员基因结构分析表明：其均含有UTR、CDS、Intron等基本的基因结构，并含有Motif基序：Motif1、Motif2和Motif3。为此，基于结构上的异同可以将这15个成员分成A和B两个亚家族。A亚家族中包括：HY5like1/4/5/6/10/12/13/14/15，B亚家族包含：HYlike2/3/7/8/9/11（分类结果如图2所示）。

为了确定这15个成员的进化特征，将32个其他物种中已报道的HY5成员与猕猴桃中的15个HY5进行系统发育分析，可以发现：猕猴桃中的15个HY5成员单独聚为一类，与其他物种的HY5没有聚类交叉（结果如图3所示），这一结果表明猕猴桃的15个HY5基因具有独立的进化模式。

（二）软枣猕猴桃中HY5基因家族克隆

基于软枣猕猴桃研究需要，为确定软枣猕猴桃中是否同样存在这15个HY5like基因，基于前述中华猕猴桃中系列HY5like基因序列，发明人设计了相关引物，并进行了相关基因序列的尝试性克隆，具体过程简介如下。

首先，基于中华猕猴桃中系列HY5like基因，发明人设计了系列PCR扩增用引物序列如下表1所示：

表1， 基于中华猕猴桃HY5like基因所设计的PCR扩增用引物序列

。

随后，以软枣猕猴桃品种‘红宝石星’果实（果实采自国家园艺种质资源库-猕猴桃分库，河南郑州）为实验样品，提取果实总RNA（多糖多酚植物RNA提取试剂盒，华越洋生物科技有限公司，北京）后，并反转录成cDNA（高效率逆转录试剂盒FsQ-101，东洋纺公司，日本）备用；

再后，以上述所制备cDNA作为模板，利用Phanta® Max Super-Fidelity DNAPolymerase高保真酶（P505，诺唯赞生物科技股份有限公司，南京），以前述所设计引物进行PCR扩增，20µL扩增体系设计如下：

Mix，10 µL；

cDNA模板，1 µL；

上、下游引物，各1 µL；

ddH

扩增程序为：94℃ 预热5 min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，33个循环；72℃终止延伸10 min；

最后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

需要说明的是，相关操作参考现有技术或者试剂盒说明书，常规操作即可，不再详述。

电泳检测结果如图4所示（图4a）。可以看出：只有AaHY5like2、AaHY5like9和AaHY5like11能够正常扩增出特异性单一条带，也即，在软枣猕猴桃中，HY5like家族只有AaHY5like2、AaHY5like9和AaHY5like11这3个同源基因存在，且这三个基因为单一同源，可作为后续研究的候选基因。

进一步对这3个同源基因进行测序分析，其中AaHY5like9序列（510bp）如SEQ IDNo.1所示，具体如下：

ATGTCTAGTGAGAAAGAGAAAGAATCGGCCGAGGGCTCGTCGCGATCGACGGCGACCATAAGCCGGTATGAGTCGCAGAAGCGTCGAGACTGGAACACCTTTGGCCAGTATTTGAAAAATCACATGCCGCCTGTACCTCTGTCTCAGTGCACTTGCAACCATGTCCTCGAGTTCCTTCGTTATCTCGATCAGTTCGGGAAGACTAAGGTTCACTTACATGGGTGTGTGTTTTTCGGGCAGCCAGACCCACCTGCCCCGTGCACTTGCCCGCTGAGGCAAGCGTGGGGATCGCTGGATGCCCTGATCGGACGGCTGAGAGCCGCCTATGAGGAGCACGGCGGGTCCCCGGAGACGAACCCATTTGGGAACGGGGCGATACGTGTATATTTACGGGAAGTTAAGGAGTGCCAAGCGAAGGCGCGAGGGATTCCGTACAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGATGATCAAAGCAAACCATGAAGAACTCAAGTCTTCCAAACAGCCCACTTGA。

进一步分析后，AaHY5like9所编码蛋白（169aa）序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

MSSEKEKESAEGSSRSTATISRYESQKRRDWNTFGQYLKNHMPPVPLSQCTCNHVLEFLRYLDQFGKTKVHLHGCVFFGQPDPPAPCTCPLRQAWGSLDALIGRLRAAYEEHGGSPETNPFGNGAIRVYLREVKECQAKARGIPYKKKKKKKKMIKANHEELKSSKQPT。

（三）研究对象的进一步确定

前期研究工作中，发明人发现套袋能够抑制软枣猕猴桃的果实着色。而结合本申请研究目的，为了筛选响应光照的关键HY5like基因，发明人选择了不同处理、不同时期的软枣猕猴桃果实样品，对前述候选的三个HY5like基因表达量进行了分析。具体样品（样品采自国家园艺种质资源库-猕猴桃分库，品种为‘红宝石星’，种植于郑州果树研究所，河南郑州）包括：UF70（不套袋盛花后70天果实，此时果实为绿色）、BF70（套袋盛花后70天果实，此时果实为绿色）、UF110（不套袋盛花后110天果实，此时果实为红色）、BF110（套袋盛花后110天果实，此时果实为绿色）。具体过程简介如下。

首先，设计表达量检测用PCR扩增引物序列如下：

针对AaHY5like2基因：

AaHY5like2-F：TAGCAGGTACGAGTCACAGAAGC，

AaHY5like2-R：TGATCGAGGTAACGAAGGAAAT；

针对AaHY5like9基因：

AaHY5like9-F：TGCCGCCTGTACCTCTGTCT，

AaHY5like9-R：TCCCAAATGGGTTCGTCTCC；

针对AaHY5like11基因：

AaHY5like11-F：TCCTTCGTTACCTCGATCAGTT，

AaHY5like11-R：GCCTTTGCTTGGCAGTCCTTA；

随后，参考前述操作，提取RNA并制备cDNA模板，

最后，进行PCR扩增，并进行检测分析；荧光定量PCR时，以猕猴桃β肌动蛋白为内参基因；

20µl反应体系设计如下：

qPCR mix，10 µL；

上游、下游引物，各1 µL；

cDNA模版，3 µL；

ddH

荧光定量PCR系统（罗氏480）程序为：95℃ 5min，95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，45个循环，65℃ 1min。

结果如图4所示（图4b、图4c、图4d）。分析可以看出：三个基因具有不同的表达规律，但AaHY5like9的表达与果实颜色（外观品质）密切相关，即在UF110和BF110果实样品中分别呈现显著高表达和低表达水平差别。

进一步的聚类分析结果显示（图4e）：AaHY5like9单独聚为一类，与AaHY5like2和AaHY5like11显著分开，这一结果也进一步表明AaHY5like9具有独立的表达模式。基于此，后续将AaHY5like9作为候选的光响应基因进行下一步研究。

实施例2

在前述实施例1基础上，为进一步明确和证实AaHY5like9基因的光响应特性，发明人构建了含有AaHY5like9基因的超表达载体，并通过异源转化拟南芥hy5突变体方式进行了实验验证，具体试验过程及结果简介如下。

（一）构建重组超表达载体

以pBI121质粒为载体，构建含有AaHY5like9基因的重组质粒载体pBI121::

（1）参考前述操作，PCR扩增制备AaHY5like9基因，并对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收（EasyPure® Quick Gel Extraction Kit，全式金生物技术股份有限公司，北京）目的片段。

（2）将所回收的AaHY5like9基因片段与T载体连接；连接体系为：

胶回收产物，4 µL；

5×TA/Blunt-Zero Cloning Mixa，1 µL；

PCR仪内，37℃、连接5 min。

（3）将上述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，并凃板培养，挑选阳性克隆菌进行PCR验证，并进一步对阳性菌液提取质粒进行测序验证。

（4）设计带有限制性酶切位点（Xba Ⅰ、Bam HI）的引物序列如下：

上游引物：gagaacacgggggactctagaATGTCTAGTGAGAAAGAGAAAGAATCG，

下游引物：gcccttgctcaccatggatccAGTGGGCTGTTTGGAAGACTTG；

以前述测序正确的质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增（获得去掉终止密码子的

进一步将回收产物与T载体连接后，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，并进行凃板培养和菌液PCR验证、以及测序验证。

（5）对前述测序正确的质粒和pBI121进行双酶切，40 µL酶切体系设计如下：

质粒（或pBI121载体），15 µL；

10 × FastDigest Buffer ，4 µL；

Xba

Bam

ddH

37℃ 酶切15 min；

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收质粒小片段和载体大片段，进一步利用T4连接酶进行连接反应，连接体系为：

AaHY5like9

pBI121载体，1.5 µL；

T4 DNA连接酶，1 µL；

连接Buffer，2.5 µL；

ddH

16℃连接 12 h。

（6）将上述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，并进一步涂板筛选，挑选阳性克隆进行菌液PCR验证和测序验证，确保重组质粒构建正确，最终完成获得重组质粒载体pBI121::

进一步地，为便于后续转化应用，将构建正确的重组质粒载体pBI121::

（二）本氏烟草叶片的侵染

将上述所制备感染（侵染）用转化菌（或对照用感染（侵染）菌）划线培养于含有抗生素的LB固体培养基上，倒扣培养72 h；

4000 r/min离心收集菌体，并用侵染液（10 mM MES、10 mM 氯化镁和200 µM AS）重悬菌体至OD

选择6周龄左右的本氏烟草叶片，用无针头的1 mL注射器从叶片背面轻缓注入侵染液（肉眼可见侵染液逐渐渗透叶片），同时以空载体所制备感染（侵染）用菌液作为对照同样方式注射。

侵染注射后的烟草植株遮光处理24 h，之后正常光照培养箱中光暗交替培养48 h后，激光共聚焦扫描仪下观察GFP荧光信号。

结果如图5（图5b）所示。分析可以看出：只携带GFP标签的空载体pBI121绿色荧光信号位于细胞核并均匀分布于细胞质；而注射重组质粒载体AaHY5like9-GFP的叶片样品中，仅在细胞核中观察到绿色荧光信号。分析认为，这是由于转录因子通常以激活下游基因表达的方式参与调控，均需要在细胞核里发挥作用。换言之，亚细胞定位结果表明：AaHY5like9基因编码的是一个转录因子，具有转录因子的一般特性，属于转录因子蛋白，能够在细胞核内发挥转录调控功能。

（3）拟南芥

拟南芥

首先，将拟南芥hy5突变体种子消毒后，温室培养至抽苔开花（生长条件为：相对湿度60%，温度22℃，16 h光照/8 h黑暗）；

随后，参考前述操作，活化含有重组质粒载体的农杆菌后，用转化Buffer重悬菌体（OD600 =1.0左右）

转化Buffer：每升含MS大量 25 mL、MS微量0.5 mL、MS有机5 mL、MS铁盐2.5 mL、蔗糖50 mL、1 mg/mL 6-BA 10 µL、SILWET-77 400 µL，PH=5.8；

转化时，采用浸染法（侵染法）：将正在抽苔开花拟南芥的所有花序浸入转化Buffer溶液中30s，7天之后重复转化一次；

浸染完成后，继续培养拟南芥，培养3周后，减少浇灌次数以加速植株衰老，最后收获种子，记为T0代种子。

参考前述操作及现有技术常规，将T0代种子消毒后，点种到含有卡那抗生素（100µg/mL）的1/2 MS筛选培养基上平板上，筛选阳性植株，并参考前述操作，对筛选所得阳性植株继续培养直至收获种子，记为T1代种子。同样筛选及培养操作，获得T2代种子。

筛选过程中，对采用含卡那霉素培养基筛选所得阳性植株进一步鉴定时，以植株叶片为样品（提取基因组DNA作为模板），基于卡那抗性基因NPT设计引物，进行PCR鉴定（阳性植株的目标片段大小为670 bp）；引物序列具体设计如下：

F：AAGATGGATTGCACGCAGGT，

R：TCACGGGTAGCCAACGCT。

最终鉴定获得了16个阳性株系（部分PCR鉴定结果如图6所示）。

进一步表型评价时，将T2代种子（即AaHY5like9转化突变体）消毒灭菌后，点种于1/2MS培养基上，垂直放置培养室培养7天，观察下胚轴表型变化（同时，以野生型拟南芥、

结果如图7所示。可以看出：野生型呈现短下胚轴表型，

进一步对下胚轴长度进行测定，结果表明：

部分样品的下胚轴测定结果如下（单位：cm）

。

上述结果表明，异源稳定遗传转化AaHY5like9基因后，能够显著弥补

需要解释的是，实际研究中，基于直观性和可测量性等原因，通常以下胚轴长度变化来间接反应光响应特性。以拟南芥为例，其主要技术理论为：对于野生型植株，正常光照条件下，植株呈现短的下胚轴，而在黑暗条件下则呈现长的下胚轴。但对于hy5突变体植株，无论正常光照还是黑暗条件，均呈现长的下胚轴。因此，通常将拟南芥中的hy5认定为光响应关键因子（基因）。而上述转化结果中，转化AaHY5like9的突变体能够恢复长下胚轴表型，因此可以认定AaHY5like9具有光响应的功能，是一个光响应基因。