一株降解污废水中总氮的Paracandidimonas soli菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株降解污废水中总氮的Paracandidimonas soli菌株以及该菌株在污废水的净化方面的应用，属于环境微生物技术领域。

背景技术

随着人类生产生活的快速发展，氮污染已成为全球高度关注的重大问题，总氮排放量已经远远超出受纳水体的环境容载量，总氮超标导致的水体富营养化以及水质恶化问题在工业和农业生产中日渐突出。由于水污染而产生的环境事件、公共安全事件甚至重大社会事件，严重影响人民的正常生产生活和身心体健康。因此，如何消减水体中的氮素污染逐渐成为水环境治理领域的研究热点问题。

目前的污水处理方法中，总氮的去除方法主要包括物理法、化学法与生物法，化学法普遍存在成本高，周期长，有效期短，环境不友好等一系列问题，与物理法和化学法相比，生物法具有安全、经济、成本低、耗能少且无二次污染等优点，已经成为了应用最为广泛的处理方法。

传统的生物脱氮要经过好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，首先通过好氧硝化菌的作用把氨氮转变为硝态氮，继而在厌氧环境下通过反硝化菌作用把硝态氮转变为氮气从而实现氮素的去除。其中，反硝化细菌为兼性厌氧菌，而硝化细菌为好氧菌，因此硝化过程和反硝化过程通常在两个反应池中进行，导致污水处理难度和成本显著增加。因此，运用理想的总氮降解微生物通过一个反应池来去除废水中的氮污染便成为水处理研究中的重要课题。

发明内容

本发明针对传统的生物脱氮过程所存在的不足，提供一株可一步降解污废水中总氮的Paracandidimonas soli菌株及其应用。

一株降解污废水中总氮的Paracandidimonas soli菌株DB311，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.24445，保藏日期为：2022年2月28日，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的Paracandidimonassoli菌株均是指Paracandidimonas soli菌株DB311。

本发明还要求保护包含上述Paracandidimonas soli菌株的微生物菌剂。

本发明提供的Paracandidimonas soli菌株的有益效果是：

1)该菌株可高效降解水体中的总氮，可用于改善水体的总氮污染问题，用于降低各类污水中的总氮含量；

2)该菌株生长较快，可快速形成优势菌群，培养方法简单，可耐受高浓度总氮且适应性强，安全性较高；

3)该菌株的微生物菌剂易生产，成本较低，产量高，活菌数高，使用时添加量低，不破坏原始环境，且处理效果好。

本发明还要求保护包含上述Paracandidimonas soli菌株的微生物菌剂的发酵方法，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：无菌条件下取Paracandidimonas soli菌株接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；(2)二级种子培养：无菌条件下将一级种子培养液按照0.5-5vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；

(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)和转速80-150rpm的条件下发酵，发酵过程中调节pH＝6-7.5，待溶氧开始上升时停止发酵，得Paracandidimonas soli菌株的发酵液。

进一步，所述富集培养基的组成为：硝酸钾1-3g/L，磷酸氢二钾0.2-0.8g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，酒石酸钾钠10-30g/L，余量为水，且pH为6.5-8。

进一步，所述发酵培养基的组成为：碳源15-30g/L、氮源5-15g/L、PO

进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种；

所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。

优选的，所述PO

本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。

该发酵方法的有益效果是：采用本发明的发酵工艺，发酵周期缩短至9h，发酵残留营养物质低，活菌数高达2500亿cfu/mL，菌体活力强，在最佳pH＝9.0的条件下，菌粉保存时限长达6个月不衰减。

本发明还要求保护使用上述Paracandidimonas soli菌株的活化液或包含Paracandidimonas soli菌株的微生物菌剂净化水体的方法，包括向水体中施加Paracandidimonas soli菌株的活化液或包含Paracandidimonas soli菌株的微生物菌剂的步骤。

优选的，所述Paracandidimonas soli菌株的活化液或微生物菌剂的接种量为100ppm以上，优选100-10000ppm，最优选100-1000ppm。

本发明还要求保护上述的Paracandidimonas soli菌株和包含Paracandidimonassoli菌株的微生物菌剂在水净化领域的应用。

优选的，所述Paracandidimonas soli菌株和微生物菌剂用于降解水中的含氮物质。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1.菌株筛选与性能检测

1.富集培养

采集某工业反应器的颗粒污泥及泥悬液，吸取10mL颗粒污泥及泥悬液转接至装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃的培养箱内培养24h，进行第一轮富集。然后再吸取10mL富集液，加入新的富集培养基中，30℃条件下静置培养24h，进行第二轮富集。按以上富集方法再进行第三轮富集。

2.初筛

配制无菌水，将富集液逐级稀释到10

按上述分离方法共得到5株菌，分别编号为：DB311、DB312、DB313、DB314和DB315。

3.复筛

将初筛得到的5株菌分别接种于装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃条件下静置培养48h，进行活化。

分别吸取5μL各菌株的活化液接种至含有100mL评价培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，30℃静置条件下培养。用无菌水代替活化液作为空白，每个实验组设置3个平行，定期检测培养基中的总氮含量。

结果如表1所示。

表1初筛所得的各菌株对评价培养基中总氮的去除率

根据表1中的24h检测结果，初筛的5株菌中，因为接种量较小，各菌株未表现出明显的除总氮能力，48h时DB311表现出较其他菌株更强的除总氮能力，96h降解效率达到93％，效果突出的菌株重新接种至总氮培养基中制作活化液，后进行甘油管-80℃保藏。

实施例2.DB311菌株鉴定

DB311菌种斜面经过16SrNDA基因序列测序将测序得到的序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Bl astSearch&LINK_LOC＝blasthome)中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果(详见分析比对结果)。

表2样品NCBI比对结果

实施例3.Paracandidimonas soli菌株的发酵生产及后续工艺处理1、一级摇瓶活化

无菌环境中挑取1环Paracandidimonas soli菌株接入装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，后置于30℃静置条件下培养24h，得到一级活化液。

2、二级摇瓶培养

无菌环境中，将一级活化液分别转接5mL至四个装有500mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的1L三角瓶中，置于30℃静置培养24h。

3、1t罐发酵培养

除了葡萄糖单独配料和消毒灭菌外，其他物料均在配料罐中配料，然后打入1t发酵罐，发酵培养基的组成为：每1L发酵培养基中包含葡萄糖21.68g、酵母浸粉6.71g、磷酸氢二钾0.43g、硫酸镁0.26g、一水硫酸锰0.01g、七水硫酸亚铁0.04g，定位600L，开始消毒灭菌。

发酵罐实消条件：蒸汽直接进内层升温，110℃开始排汽，排汽时间：20分钟，排汽温度：115℃，发酵罐培养基实消条件：蒸汽直接进内层升温至118℃开始排汽，排汽时间30分钟，排汽温度121℃，消毒后体积约700L，然后冷却至30℃，等待接种；

4、发酵：将二级种子培养液2000mL通过压差接种法接种至发酵罐的发酵培养基中，初始pH调节为7.0，控制温度为30℃，通气比控制为1:1.25(m

表3活菌数随发酵生长周期的变化

5、发酵液的后处理工艺

发酵液离心后取菌泥，称重。按质量比1:1向其中加入保护剂，混匀后放入冻干机托盘，20h冻干完成，取出粉碎。

实施例4.不同接种量下Paracandidimonas soli菌株的总氮降解能力测定

在无菌条件下，将Paracandidimonas soli菌株接种于含有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的250mL锥形瓶中，在30℃，200rpm的摇床中振荡培养24h进行菌株活化，得活菌数为13亿cfu/mL的活化液。

分别取活化液10μL、100μL、1000μL，将其接种至100mL已灭菌的评价培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)中，置于30℃，200rpm摇床中振荡培养，每组设3个平行，使用无菌水作为空白对照，每隔24h检测培养基中的总氮含量。

表4不同接种量Paracandidimonas soli菌株活化液的总氮降解效果

由表4中的数据可以看出，接种量越大降解速率越快，降解效果越好，接种量为10000ppm时降解效率最快，降解效果最好，72h时可达到93％的降解率，但接种量从1000ppm增长到10000ppm，总氮降解效率提高不大，出于经济考虑，接种量选择1000ppm为最优。

实施例5.某化工废水降解总氮效果测定

1、菌种的活化

将纯化好的Paracandidimonas soli菌株接种到装有100mL富集培养基(硝酸钾2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，酒石酸钾钠20g/L，调pH＝7.20)的250mL三角瓶中，置于30℃、120rpm条件下培养24h，得到活化菌液，稀释活菌含量至100亿cfu/mL待用。

2、Paracandidimonas soli菌株降总氮能力评价实验

分别向装有100mL某化工废水的250mL三角瓶中加入活化菌液5μL、10μL、100μL，各接种量分别置于30℃、20℃、10℃，120rpm条件下培养，每隔24h检测培养基中的总氮含量，共设置3个平行实验组，和1个用无菌水替代活化菌液的空白对照组。具体实验安排如下：

空白对照组1：不加活化菌液；

实验组2：活化菌液添加量50ppm，30℃培养；

实验组3：活化菌液添加量100ppm，30℃培养；

实验组4：活化菌液添加量1000ppm，30℃培养；

实验组5：活化菌液添加量50ppm，20℃培养；

实验组6：活化菌液添加量100ppm，20℃培养；

实验组7：活化菌液添加量1000ppm，20℃培养；

实验组8：活化菌液添加量50ppm，10℃培养；

实验组9：活化菌液添加量100ppm，10℃培养；

实验组10：活化菌液添加量1000ppm，10℃培养。

3、实验结果

评价实验结果见下表。

表5.某化工废水中Paracandidimonas soli菌株的降总氮能力

由表5可知，30℃、接种量1000ppm时该菌96h总氮降解率最高达到90％，温度越高降解速率越快，30℃明显优于10℃，接种量越大降解速率越快，同时可以看到，10℃接种量1000ppm时96h降解率可达84.0％，证明该菌在10℃时仍有降解能力，但受温度影响效率略有降低。

本发明中所用的原料与设备，若无特殊说明，均为本领域的常用原料与设备；本发明中所用方法，若无特殊说明，均为本领域的常规方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。