一株高接合转移效率哈维弧菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高接合转移效率哈维弧菌及其构建方法和应用。

背景技术

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖生物的重要条件致病菌，对海水养殖产业造成了巨大的危害。华南沿海海水鱼病害调查发现，海水鱼类弧菌病约70％为哈维弧菌所致，哈维弧菌的危害范围和程度已逐渐取代了溶藻弧菌和创伤弧菌，成为主要的病原弧菌。由于疫苗和免疫增强剂等其他控制方法的局限性，抗生素被认为是对抗细菌性传染病最有效、最灵活的武器，被广泛用于预防或治疗水产养殖中的细菌性疾病。目前，哈维弧菌的耐药形势严峻，耐药指数高达0.60。因此，阐明其致病机制和耐药机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。

致病机制和耐药机制研究以及减毒活疫苗等的研发通常涉及基因敲除的基因工程操作。但是，传统的使用大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细菌携带外源基因，并与受体菌接合转移实现外源载体进入受体细胞内，并进一步发生同源重组进行基因敲除的方法，在哈维弧菌中因接合转移成功率极低，甚至不能成功转移，而受到阻碍，这限制了该菌的遗传学研究。

基于以上问题，该专利发明了构建高接合转移效率哈维弧菌的方法，并提供高接合转移效率的哈维弧菌菌株，这对未来进行哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制和耐药机制等，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供敲除限制性内切酶BsuBI-R基因在提高菌株接合转移效率中的应用。

优选，所述的菌株是哈维弧菌，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp所示。

本发明的第二个目的是提供一种高接合转移效率哈维弧菌，其是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp。

本发明的第三个目的是提供一种高接合转移效率哈维弧菌的构建方法，其是将哈维弧菌的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除，获得高接合转移效率哈维弧菌，所述的限制性内切酶BsuBI-R基因是SEQ ID NO.1的921bp-1901bp。

优选，包括以下步骤：

步骤一、对哈维弧菌基因组上的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R设计基因敲除引物；

步骤二、以哈维弧菌为出发菌株，敲除所述的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R，相应获得基因缺失菌株V.harveyi 345-ΔBsuBI-R，即为高接合转移效率的哈维弧菌。

优选地，步骤一中所述基因敲除引物为：上游同源臂扩增引物：ataagcttgatatcgaattcCTAGAAGTGACAATAACCGTGTC和gagaagaacgACACTCCAATCGTCAGTTGG，下游同源臂扩增引物attggagtgtCGTTCTTCTCCTAGAATTAAATAACAAAG和taattggtaacgaatcagacACAAGATGTTTGCAGATCTTAGA所示。

优选地，步骤二中，所述的敲除所述的II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R具体包括如下步骤：

(1)PCR扩增所述BsuBI-R基因上下游同源臂和线性化自杀质粒；

(2)通过等温组装上下游同源臂和线性化自杀质粒，得到重组质粒，将所述的重组质粒先后转化入中间宿主E.coli GEB802和供体菌E.coli GEB883，并通过PCR鉴定；

(3)供体菌E.coli GEB883培养至对数早期(OD600nm＝0.3～0.7)，受体菌哈维弧菌345培养至对数早期(OD600nm＝0.3～0.7)；

(4)对数早期受体菌哈维弧菌345于40℃热击处理30min，并与对数早期供体菌E.coli GEB883进行接合转移实验；

(5)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得BsuBI-R基因缺失的菌株，即为高接合转移效率的哈维弧菌。

优选地，步骤(1)中，所述自杀质粒为pSW7848。

优选地，步骤(5)中，所述的单交换克隆子的筛选具体指通过含34μg/mL氯霉素和0.2％D-葡萄糖的平板筛选。

优选地，步骤(5)中，所述的双交换克隆子的筛选具体指通过含0.2％L-阿拉伯糖的平板筛选。

优选地，步骤(5)中，所述鉴定具体指设计通过引物对：CATAGGTTACATTGTGGGATCTGTTAG和GACATGCAATAGCATCTAGCTAGC进行PCR鉴定。

本发明的第四个目的是提供上述高接合转移效率哈维弧菌作为基因工程菌在基因敲除方面的应用。

本发明所述的出发菌株哈维弧菌345已经公布于NCBI(CP025537，CP025538，CP025539，CP025540)。本发明所涉及的重组质粒中间宿主E.coli GEB802、供体菌E.coliGEB883、质粒pSW7848已公布于该文献中：Deng YQ,Su YL,Liu SL,et al.Identificationof a novel small RNA srvg23535 in Vibrio alginolyticus ZJ-T and itscharacterization with phenotype microarray technology[J].Frontiers inmicrobiology,2018:2394。本发明人也持有上述微生物，并保证自申请日起20年内向公众提供。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

相比于基因工程出发菌，V.harveyi 345-ΔBsuBI-R的接合转移效率显著提高，且获得的单交换克隆子阳性率高，筛选工作量少，开辟了哈维弧菌通过接合转移及同源重组进行基因敲除的平台，有利于进一步的基因组改造和基因功能研究。

附图说明

图1为II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R基因敲除株的PCR鉴定；

其中，泳道M1：DNA Marker DL10000；泳道1：pSW7848线性化片段；泳道M2：DNAMarker DL2000；泳道2/3：BsuBI-R上/下游片段；泳道M3：DNA Marker DL10000；泳道4：重组子pSW7848-BsuBI-R检测片段；泳道M4：DNA Marker DL2000；泳道5：以野生株哈维弧菌345基因组DNA为模板，BsuBI-R基因敲除鉴定引物扩增结果；泳道6：以BsuBI-R候选突变株基因组DNA为模板，BsuBI-R基因敲除鉴定引物扩增结果。

图2为出发菌株V.harveyi 345和V.harveyi 345-ΔBsuBI-R在氯霉素平板中接合转移效率的比较图。

图3为V.harveyi 345-ΔBsuBI-R背景下，hfq基因敲除株的PCR鉴定。

其中，泳道M1：DNA Marker DL10000；泳道1：pSW7848线性化片段；泳道M2：DNAMarker DL2000；泳道2/3：hfq上/下游片段；泳道M3：DNA Marker DL10000；泳道4：重组子pSW7848-hfq检测片段；泳道M4：DNA Marker DL2000；泳道5：以背景菌株V.harveyi 345-ΔBsuBI-R基因组DNA为模板，hfq基因敲除鉴定引物扩增结果；泳道6：以背景菌株V.harveyi345-ΔBsuBI-R的hfq候选突变株基因组DNA为模板，hfq基因敲除鉴定引物扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

自杀质粒pSW7848的来源参见文献:Val,M-E.,Skovgaard,O.,Ducos-Galand,M.,Bland,M.J.,Mazel,D.,2012.Genome engineering in Vibrio cholerae:a feasibleapproach to address biological issues.PLoS Genet.8,e1002472.

E.coli GEB883的来源参见文献:Nguyen,A.N.,Disconzi,E.,Charrière,G.M.,Destoumieux-Garzón,D.,Bouloc,P.,Le Roux,F.,Jacq,A.,2018.csrB gene duplicationdrives the evolution of redundant regulatory pathways controlling expressionof the major toxic secreted metalloproteases in Vibrio tasmaniensisLGP32.mSphere.3,e00582-00518.

E.coli GEB802公开于文献Deng YQ,Su YL,Liu SL,et al.Identification ofanovel small RNA srvg23535 in Vibrio alginolyticus ZJ-T and itscharacterization with phenotype microarray technology[J].Frontiers inmicrobiology,2018:2394。E.coli GEB802是文章中的π3813。

实施例1

一、V.harveyi 345基因组中II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R(CU052_28220)的敲除

BsuBI-R是II型限制修饰系统BsuBI-R/M的限制性内切酶BsuBI-R，负责对非甲基化及错误甲基化核苷酸序列进行酶切。在实验中，我们针对BsuBI-R基因设计了相应的基因敲除引物(表1)。

表1基因敲除与鉴定相关引物

BsuBI-R基因ORF及其上下游序列(具体如SEQ ID NO.1所示)，斜体ATG及TGA分别为BsuBI-R起始密码子和终止密码子，即从921bp-1901bp，具体如下：

CTAGAAGTGACAATAACCGTGTC

通过PCR扩增获得BsuBI-R基因的上、下游侧翼序列以及线性化质粒pSW7848。利用无缝克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)将上下游侧翼序列与线性化质粒进行等温组装，获得的重组质粒pSW7848-BsuBI-R(其序列如SEQ ID NO.2所示)先后转化入中间宿主E.coli GEB802和供体菌E.coliGEB883，PCR筛选阳性克隆子。将受体菌哈维弧菌345培养至对数早期(OD

SEQ ID NO.2：

TCACTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGCTGGCCGGCGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTAGAAGTGACAATAACCGTGTCTCTTTGTGGTTCACCTTTTGTTAAGTGATAAATAACGTTTTCCTGCAGCACTTTATCAGCCTTGAATGCTGATTTACGGCTATTAAAAACATGAATTTTGTTGATTGAGCAAGAGTCTAATAACAATCTACGGAAATCGTTGAAGTATGGACCGTTACAGAATGAACGGGGAGTGATTGCGACAAGTTCACCGCCTTCTTCTAATAATTTTATCGCTAACCCTACAAACGCTGAGTATAGATTTCCAGTTTCAAAACTAACCTTTCTTAGTGCTGCTCGCTCAGTGCCTTTTGAAGAAATTTTTAAGTAAGGTGGGTTAAGAATGACTTTGTTATATTTAGGTTTGAAATTGTCGTTTAAGAGCTGTTCAACTGAGTGTTGAATAAAATCATCTTCAACTACGGTTTGATCCCACTGGACACCATATGATTCACACGTATTTGAACAATGCTTTAATGTATCAGACAGGTAATGATTCATTACGCTTGATAGTTCGAAGCAAGTTGAATCAATGCTTGTTGCATCGTTCTTAACTCGCTCAACAAACGCAGCCGTTAACGATCCTACTCCTGCTCCTGCATCAAGTAGACGGTGTTCACCATCTACATTTTCAAACATATCAGCAAGAAGCTTAGATACAGCAGAAGATGACATAAACTGACCTAATTTCCCTCTAAGCTTTTCATCGAGTTTTCCATTTGCCGCAACTCGGTTAACATCCGCAATATCATTTAAGTTAAGGGGTAAATTTTGAGCCAATTCAGTCATATATGTTTTTTTATACAGTTGTGTGTTGGACGGGCAGTATCGCAAAAAACCTGCACAAAAGGAAGAAAAAAACCTGCACATAGGTTACATTGTGGGATCTGTTAGTTTACTGGCTGATAAATAAAGAAAATGAGAGACAAAAAACTAGAACAAGCTAAAGAAATTCTCAAAGCTTTAGGCTTGCCAAAACAGCAATACAACGACAGATCCGCTTGGGTCTTTCTTGCTCTTGCTAATGTAAAACCAACTGACGATTGGAGTGTCGTTCTTCTCCTAGAATTAAATAACAAAGGTAGCGAGGAATACCTTGCTGCCTTTTAGTATTAACCCTCTTACAGCGATTATTCCTTTATAAATATAAAGTTACGTTCTTAGCGTACAATATTTTCCGAATCGTCGTGTGACTGTCGGTGGACAACAAAGTTTGAAACTCGAACAATAAAGATTAGAACTATGACAATAAAGTACGAAACTTTTCGGTGCCATTTGTCGTAGTTTGCCTTCTTCTCTGAGACGATTTTGCCCCAAAGCTAGCTAGATGCTATTGCATGTCTTATTAGTATATCTAACTTGAAATGTCATAATTACTATTTGAGCCACTTGTAGCACCATCCATCACTCATGAGCAATTTCCTGATTTTTGCTCTGTCATTAGCTTTAGCTCGCATATATATAGAGCGTATTTCTTGCTCATAAGAATCAGATTCAAAACCACGGTTAATCGCTTTTTGATACCACTCATGACCTTGGGAGATATCTCCACTCAACATTTTGCACGCACCAATCAAAGTGCATGGGCGGTAGTCCTGTAGAGTCAATTCATGAGCCTGTATGCCAAATTCGATAGCTTGTTCTAGCATATTTAAATCACGTTTAACACCGCCAGCCGTAGTAAGCAAAGCAGATTTTAACTTCTTATTTCCATTCGCAAATTTGAATGGAAAGTGCTTATTCACCAAGGTTAGGGCTGTTTTTGCCTTATCTGCTTTACGATAATCAGCAAGAGCATTAACCAAGTTCCACGGCTTATTGGTCGTATTCCATATTCGCTTGGAGTTCTCTGCGCGACGAAGGTAATACATGCTATTCACCTGATCATTCTCAAAGCCCTTCTGCTTAAGCCACAAGTAGTCGGCATCAGTGATCATACCTTTGTTGAGAGTCGTGAGAATATAAGCTGCTTTAGAGTGCCTACGAATCGAACTAATATTGAGTGAGGGGAAGTCGATGAATTGCTTATCATACTTAGCTCTAAGATCTGCAAACATCTTGTGTCTGATTCGTTACCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGAAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACTCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTAGTGCTCAAAAGCAG。

二、实施效果

将出发菌株哈维弧菌345与获得的突变株V.harveyi 345-ΔBsuBI-R分别与携带RP4型穿梭质粒pMMB207(具有氯霉素抗性，可在哈维弧菌345中自我复制，构建方法参见Liu,J.X.,Zhao,Z.,Deng,Y.Q.,Shi,Y.,Liu,Y.P.,Wu,C.,Luo,P.,Hu,C.Q.,2017.Completege nome sequence of Vibrio campbellii LMB 29isolated from red drum with fournative mega plasmids.Front.Microbiol.8,2035.https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02035)的大肠杆菌供体菌pMMB207-E.coli GEB883常温条件下进行接合，接合过夜后，菌斑用1mL新鲜培养基收集，并倍比稀释，吸取不同稀释度菌液各100μL涂布含34μg/mL氯霉素的LBS平板(按质量分数计，含1％的蛋白胨，0.5％酵母粉，3％氯化钠，1.5％技术琼脂粉)进行接合子的筛选，并统计接合转移效率，结果表明(图2，表2)，与出发菌株哈维弧菌345相比，V.harveyi 345-ΔBsuBI-R的接合转移效率，显著提高6.83倍。

表2 V.harveyi 345和V.harveyi 345-ΔBsuBI-R的接合转移效率

实施例2

在V.harveyi 345-ΔBsuBI-R菌株的基础上尝试进行其他片段的敲除。选取基因组中的基因hfq作为敲除对象，采用如上所述(与BsuBI-R敲除一样的步骤，但是接合的时候不进行受体菌40℃，30min的热击处理)的方法，接合在常温条件下进行，首先获得单交换克隆子，之后进行L-阿拉伯糖反筛选，获得双交换子。目的基因特异引物(表1)的PCR鉴定结果表明，hfq基因序列被成功敲除(图3)。

hfq基因ORF及其上下游序列，斜体ATG及TAA分别为hfq起始密码子和终止密码子，如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

CGGCGTTGATCTACAAAGACATGAACATTGGTACGGCGAAACCTGATGAGCGCGAGCTGAGTCTAGCGCCGCATCGTCTTATCGATATTCTTGACCCGAGCGAATCGTACTCTGCGGCGGACTTCCGTCGTGATGCACTACAAGCAATGGATGACATTGTTGCAGAAGGAAAAATTCCGCTCTTAGTTGGCGGTACAATGCTGTATTACAAAGCGTTACTTGAAGGCTTATCACCTCTTCCTGCTGCAAATCCTGAAATTCGTCAGCAAATTGAGCAAGAGGCATTGACTAAAGGTTGGTCGGTGTTGCACGATGAGCTGAAAGAGATTGATCCTGTATCAGCTGCGAGAATTCATCCAAACGATCCTCAACGTTTATCGAGAGCGTTGGAAGTCTTCCGTATTTCAGGTAAAACTCTTACTGAGTTGACTCAAACTAAAGGCGACAGCTTGCCTTACCGAGTCAAACAGTTTGCAATAGCTCCCAAGGACAGGGCAGAACTTCACCGTCGAATTGAACTGCGTTTCGATAAGATGATGGAAGCGGGTTTTGAAGAGGAAATGAAAGCGTTGTATGCGCGCAAGGATCTTCACCCTGATCTTCCTTCTATCCGTTGCGTTGGCTACAGACAGATGTGGGAGTACTTAGATGGGGACTGCACACGCGACGAAGCCGTTTTTCGTGGCATTTGTGCAACTCGTCAATTGGCCAAGCGTCAAATCACCTGGTTACGCAGCTGGAATGATTTAACTTGGTTGGATAGCGATAACATTGAACAGGCACTTGAAACCATGTCAGAAGCAATAGCATCTGATTGAGATAGCTGTGTATAATGTGATCGTTTTTGCGTGAACGCACTCTCAAAGGATCTGTTATTGGCGGTTTTTATACTATGCTGCTAATTACTTAGGGTGCATTTTTGATTCGTTTAGCTCAGATGCAAAAAGCAGTACCTTTTGCATTGCACCACTAGCTAAATAATTACAACTACAAATTAAATAAGGAAAATAAAATGGCTAAGGGGCAATCTCTACAAGACCCATTCCTAAATGCGCTACGTCGTGAGCGTATCCCGGTATCTATCTACCTTGTGAACGGTATCAAACTGCAAGGTCAGATCGAATCTTTCGATCAATTCGTGATCCTATTGAAGAACACTGTTAACCAAATGGTGTACAAGCACGCAATCTCTACAGTTGTGCCGGCTCGTCCAGTAAGCCACCACAGCGGTGATCGTGCTCAAGGTGATCGTCCACAAGAGAAATCTGAAGATTAATTCTTCATTTAGTATTTTTACAATAAGGAGTTGATTGCTTGTTTGACCGTTATGAATCCGGTGAGCGAGCCGTACTTGTTCATATCAACTTCACGCAAGAAGGTGAATGGGAAGATCTAGCTGAATTCGAAATGCTGGTTTCTTCCGCTGGGGTAGAGACGCTACAAGTTGTGACTGGTAGTCGTCAATCCCCACACCCGAAATACTATGTCGGAGAGGGTAAGGCACAAGAAATTGCTACTGCGGTGCAATTAACTGGTGCTGAAATTGTGATTTTTAATCACTCCCTCTCTCCTGCCCAAGAACGTAACCTCGAAGCACTGTGCAAATGTCGAGTTCTCGACCGCACTGGTCTCATCCTCGATATCTTTGCTCAACGAGCACGAACACACGAAGGTAAGCTACAAGTTGAGCTAGCCCAACTTCGCCATATTTCTACTCGTTTGATTCGCGGTTGGACGCACCTTGAAAGGCAGAAAGGCGGTATCGGTCTACGTGGTCCAGGTGAAACCCAGTTAGAAACCGACCGTCGTTTATTGCGTGACAGAATCAAAGCTATCTTGCGTCGACTTGAAAAAGTGGCCAAGCAGCGTGAACAAGGACGCCGTGCCCGAAACCGAGCTGAAATACCAACCATTTCTCTCGTGGGCTACACCAACGCGGGTAAGTCGACACTCTTCAACCGTATTACAGAAGCTGGCGTTTACGCGGCAGATCAACTGTTTGCTACTCTTGACCCAACTTTACGTAAGATAGAGTTAGCAGATGTAGGACCTGCAATACTTGCAGATACTGTTGGTTTTATCCGACACCTGCCTCACGATTTGGTTGCTGCCTTCAAAGCAACCTTGCAGGAAACGCAAGAAGCTGACATTTTGTTACATGTTGTTGATGC。

hfq基因上下游同源臂与自杀质粒线性化片段等温组装后的重组子序列，如SEQID NO.4所示，具体如下：

TCACTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGCTGGCCGGCGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGGCGTTGATCTACAAAGACATGAACATTGGTACGGCGAAACCTGATGAGCGCGAGCTGAGTCTAGCGCCGCATCGTCTTATCGATATTCTTGACCCGAGCGAATCGTACTCTGCGGCGGACTTCCGTCGTGATGCACTACAAGCAATGGATGACATTGTTGCAGAAGGAAAAATTCCGCTCTTAGTTGGCGGTACAATGCTGTATTACAAAGCGTTACTTGAAGGCTTATCACCTCTTCCTGCTGCAAATCCTGAAATTCGTCAGCAAATTGAGCAAGAGGCATTGACTAAAGGTTGGTCGGTGTTGCACGATGAGCTGAAAGAGATTGATCCTGTATCAGCTGCGAGAATTCATCCAAACGATCCTCAACGTTTATCGAGAGCGTTGGAAGTCTTCCGTATTTCAGGTAAAACTCTTACTGAGTTGACTCAAACTAAAGGCGACAGCTTGCCTTACCGAGTCAAACAGTTTGCAATAGCTCCCAAGGACAGGGCAGAACTTCACCGTCGAATTGAACTGCGTTTCGATAAGATGATGGAAGCGGGTTTTGAAGAGGAAATGAAAGCGTTGTATGCGCGCAAGGATCTTCACCCTGATCTTCCTTCTATCCGTTGCGTTGGCTACAGACAGATGTGGGAGTACTTAGATGGGGACTGCACACGCGACGAAGCCGTTTTTCGTGGCATTTGTGCAACTCGTCAATTGGCCAAGCGTCAAATCACCTGGTTACGCAGCTGGAATGATTTAACTTGGTTGGATAGCGATAACATTGAACAGGCACTTGAAACCATGTCAGAAGCAATAGCATCTGATTGAGATAGCTGTGTATAATGTGATCGTTTTTGCGTGAACGCACTCTCAAAGGATCTGTTATTGGCGGTTTTTATACTATGCTGCTAATTACTTAGGGTGCATTTTTGATTCGTTTAGCTCAGATGCAAAAAGCAGTACCTTTTGCATTGCACCACTAGCTAAATAATTACAACTACAAATTAAATAAGGAAAATAAATCCTATTGAAGAACACTGTTAACCAAATGGTGTACAAGCACGCAATCTCTACAGTTGTGCCGGCTCGTCCAGTAAGCCACCACAGCGGTGATCGTGCTCAAGGTGATCGTCCACAAGAGAAATCTGAAGATTAATTCTTCATTTAGTATTTTTACAATAAGGAGTTGATTGCTTGTTTGACCGTTATGAATCCGGTGAGCGAGCCGTACTTGTTCATATCAACTTCACGCAAGAAGGTGAATGGGAAGATCTAGCTGAATTCGAAATGCTGGTTTCTTCCGCTGGGGTAGAGACGCTACAAGTTGTGACTGGTAGTCGTCAATCCCCACACCCGAAATACTATGTCGGAGAGGGTAAGGCACAAGAAATTGCTACTGCGGTGCAATTAACTGGTGCTGAAATTGTGATTTTTAATCACTCCCTCTCTCCTGCCCAAGAACGTAACCTCGAAGCACTGTGCAAATGTCGAGTTCTCGACCGCACTGGTCTCATCCTCGATATCTTTGCTCAACGAGCACGAACACACGAAGGTAAGCTACAAGTTGAGCTAGCCCAACTTCGCCATATTTCTACTCGTTTGATTCGCGGTTGGACGCACCTTGAAAGGCAGAAAGGCGGTATCGGTCTACGTGGTCCAGGTGAAACCCAGTTAGAAACCGACCGTCGTTTATTGCGTGACAGAATCAAAGCTATCTTGCGTCGACTTGAAAAAGTGGCCAAGCAGCGTGAACAAGGACGCCGTGCCCGAAACCGAGCTGAAATACCAACCATTTCTCTCGTGGGCTACACCAACGCGGGTAAGTCGACACTCTTCAACCGTATTACAGAAGCTGGCGTTTACGCGGCAGATCAACTGTTTGCTACTCTTGACCCAACTTTACGTAAGATAGAGTTAGCAGATGTAGGACCTGCAATACTTGCAGATACTGTTGGTTTTATCCGACACCTGCCTCACGATTTGGTTGCTGCCTTCAAAGCAACCTTGCAGGAAACGCAAGAAGCTGACATTTTGTTACATGTTGTTGATGCGTCTGATTCGTTACCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGAAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACTCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTAGTGCTCAAAAGCAG。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如对V.harveyi 345-ΔBsuBI-R中任何基因或者核苷酸片段进行敲除。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。