一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法
文献发布时间：2023-06-19 19:30:30
技术领域
本发明涉及有机合成技术领域，尤其是涉及一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法。
背景技术
6-FAM亚磷酰胺(6-Fluorescein Phosphoramidite，6-FAM)是一种荧光素衍生物类的标记物，主要在荧光标记技术中，应用于核酸探针和DNA自动测序等。6-FAM亚磷酰胺分子式为C46H58N3O10P，分子量约为843.9。其主要结构中，苯环上较大的羧基使芬香环保持在生色团垂直的位置上，这提高了荧光量子的产率。此外，6-FAM亚磷酰胺还具有无毒、成本低等优点。传统的荧光素类衍生物存在着ph敏感性较强、光淬灭率较高、发射光谱较宽、斯托克位移小等缺点，但有研究表明，酰胺类荧光素衍生物能够提供多种吸收和发射最大值，具有良好的特异选择性和光稳定性，适合在酸性、中性和碱性环境下进行标记，且因斯托克位移大而使得样品背景干扰小。因此，开发6-FAM亚磷酰胺的制备方法很有必要。
6-羧基荧光素作为6-FAM亚磷酰胺的基础原料，传统的化学合成方法是先用偏苯三酸酐和间苯二酚在酸性条件下缩合生成，该合成路线不可避免的会出现几乎等量的5-羧基荧光素的同分异构体，现有工艺是把5(6)-羧基荧光素的同分异构体通过柱层析等方法提纯分离得到6-羧基荧光素，然后用6-羧基荧光素作为起始原料，再经过三步反应合成6-FAM亚磷酰胺，该路线存在起始原料分离过程复杂且产率低的缺点。
因此，有必要提供一种新的6-FAM亚磷酰胺的制备方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，能够有效避免起始原料进行手性拆分的过程，且制备的产物收率高。
根据本发明的第一方面实施例的提供的6-FAM亚磷酰胺的制备方法，包括如下步骤：
S1、将5(6)-羧基荧光素、有机碱和特戊酸酐进行反应，得到5(6)-羧基荧光素特戊酸酯；
S2、在醇溶剂中，将5(6)-羧基荧光素特戊酸酯和有机胺进行混合，在-10～-40℃下静置，析出固体6-羧基荧光素特戊酸酯；
S3、在第一有机溶剂中，将6-羧基荧光素特戊酸酯、N-羟基丁二酰亚胺和N,N'-二环己基碳二亚胺进行反应得到中间体1；将中间体1、6-氨基-1-己醇和第二有机溶剂中进行反应得到6-羧基荧光素特戊酸酯酰胺醇；
S4、在第三有机溶剂和惰性气氛下，将6-羧基荧光素特戊酸酯酰胺醇、四氮唑和2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺进行反应，得到6-FAM亚磷酰胺；
其中，中间体1的结构式如下：
其中，5(6)-羧基荧光素的CAS号为72088-94-9；6-FAM亚磷酰胺的CAS号为204697-37-0。
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：
本发明采用5(6)-羧基荧光素混合物无需分离纯化，用该混合物为原料、有机碱和特戊酸酐进行反应生成5(6)-羧基荧光素特戊酸酯，然后通过有机胺和5(6)-羧基荧光素特戊酸酯形成胺盐，在-10～-40℃下6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐会析出，再通过酸化生成6-羧基荧光素特戊酸酯实现同分异构体的分离，后续通过两步反应合成6-FAM亚磷酰胺。从而实现了由5(6)-羧基荧光素混合物为原料合成6-FAM亚磷酰胺的新路线。避免了传统工艺合成6-FAM亚磷酰胺时需要在原料阶段拆分5(6)-羧基荧光素为6-羧基荧光素的复杂步骤。
根据本发明的一些实施例，所述有机胺选自二异丙胺、三乙胺或N-甲基苄胺中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，5(6)-羧基荧光素特戊酸酯和有机胺在-20～-30℃下进行混合。由此，该反应具有较高的产率，当温度高于-20℃时，产率降低。
根据本发明的一些实施例，所述醇溶剂选自乙醇、甲醇或异丙醇中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯和有机胺的摩尔比为1：(3～4)。
根据本发明的一些实施例，所述酸化采用盐酸酸化。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述有机碱选自吡啶、三乙胺或二异丙基乙胺中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述第一有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述第二有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述第三有机溶剂选自二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述惰性气氛包括氮气、氩气中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述5(6)-羧基荧光素可以通过购买得到，或者采用本发明如下的方法制备得到：反应方程式如下：
将间苯二酚溶解、甲基磺酸和溶剂中加入到反应瓶中,加入偏苯三酸酐，氮气保护下加热反应得到5(6)-羧基荧光素。
根据本发明的一些实施例，所述加热反应的温度为100～130℃。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
实施例1提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，包括如下步骤：
5(6)-羧基荧光素的制备：
室温下，将间苯二酚(5.72g，52mmol)溶解于15mL甲基磺酸和25mL乙酸中加入到250mL圆底烧瓶中,加入偏苯三酸酐(5g，26mmol)，氮气保护下加热至100-130度反应6-12小时，TLC监测反应完全后，停止加热，待反应液冷却至室温后，将反应液倒入大量冰水中搅拌，待产物沉淀析出，过滤后干燥得到棕色固体产物5(6)-羧基荧光素混合物7.64克，收率78％。
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S1、向250mL圆底烧瓶中加入10克5(6)-羧基荧光素和100mL吡啶，氮气保护下加入20mL特戊酸酐，室温反应2-8小时。TLC监测反应完全后，减压蒸除吡啶，加入100mL水和200mL乙酸乙酯萃取分液，干燥有机相，蒸干溶剂后得到黑色粘稠物5(6)-羧基荧光素特戊酸酯。
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S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL乙醇，然后加入10mL二异丙胺，将反应体系冷却至-25℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体5.5克，收率38％。注：该步骤属于同分异构体的拆分，理论产率只有50％。
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S3、向250mL圆底烧瓶中加入5.0克6-羧基荧光素特戊酸酯(9.2mmol)，1.2克N-羟基丁二酰亚胺(10.4mmol)和2.0克N,N'-二环己基碳二亚胺(9.7mmol)，然后加入60毫升乙酸乙酯，室温下搅拌反应一小时，TLC监测反应完全后，过滤除掉瓶重生成的固体，滤液用水洗后将有机相蒸干后得到产物6-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺4.8克，该产物无需进一步纯化即可投入下一步反应。将上步所得产物(4.8克，7.5mmol)溶解于60毫升二氯甲烷中，然后加入1.3克6-氨基-1-己醇(11.2mmol)，室温下搅拌反应一小时后，TLC监测反应完全后，加入60毫升水，取下层有机相蒸去溶剂后，得到黄色固体3.6克，该产物无需进一步纯化即可投入下一步反应。
S4、向100mL反应瓶中投入3.2克6-羧基荧光素特戊酸酯酰胺醇(5mmol)，加入50mL二氯甲烷溶解，加入0.07克四氮唑(1mmol)和2.1克2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(7mmol)，氮气保护下室温搅拌反应2-4小时；TLC监测反应进行完全后旋蒸除去溶剂，通过柱层析分离提纯得到目标产物黄色固体6-FAM亚磷酰胺酯3.1克，收率73％。
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实施例2
实施例2提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL乙醇，加入10mL N-甲基苄胺，将反应体系冷却至-25℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯N-甲基苄胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体4.8克，收率33％。
实施例3
实施例3提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL乙醇，加入10mL三乙胺，将反应体系冷却至-25℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯三乙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量冷无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体4.3克，收率30％。
实施例4
实施例4提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL乙醇，加入10mL二异丙胺，将反应体系冷却至-10℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体4.2克，收率29％。
实施例5
实施例5提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL乙醇，加入10mL二异丙胺，将反应体系冷却至-30℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量冷无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体3.6克，收率25％。
实施例6
实施例6提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL乙醇，加入10mL二异丙胺，将反应体系冷却至-40℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体3.2克，收率22％。
实施例7
实施例7提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL甲醇，加入10mL二异丙胺，将反应体系冷却至-25℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量冷无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体5.0克，收率35％。
实施例8
实施例8提供一种6-FAM亚磷酰胺的制备方法，其原料、制备方法和用量基本与实施例1相同，其区别在于步骤S2中不同：
S2、向上述5(6)-羧基荧光素特戊酸酯里加入40mL异丙醇，加入10mL二异丙胺，将反应体系冷却至-25℃，在该温度下静置12-24小时后，6-羧基荧光素特戊酸酯二异丙胺盐析出，5-异构体则主要留在母液中。过滤得到黄色固体，用少量无水乙醇洗涤后干燥，再用1M的稀盐酸酸化，析出6-羧基荧光素特戊酸酯黄色固体2.2克，收率15％。
上面结合本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。