一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用
文献发布时间：2023-06-19 19:30:30
技术领域
本发明涉及植物原生质体提取技术领域，尤其涉及一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用。
背景技术
单细胞转录组测序技术能够在单细胞分辨率下研究样本的转录组信息，可以完美解决细胞异质问题，能全面真实揭示细胞多样性和复杂性，在细胞类型、复杂细胞生物学进程解析、癌症和疾病发生机制探索等方面发挥重要作用。近年来，单细胞测序在植物上的应用也逐渐推广，植物单细胞转录组测序从不同层面对细胞发育、细胞功能及基因网络调控等方向进行深入研究探索，打开了我们对植物细胞真实的微观世界认知的大门。
植物细胞外面有一层坚硬的细胞壁，起着保护和支撑作用。植物细胞壁不易破坏分解，植物组织需要通过酶解消化掉细胞外面的一层细胞壁，解离成原生质体才能开展单细胞测序。由于植物中各种组织类型细胞壁的组成不同，破壁所需要的酶类型及浓度和其他反应条件不同，需要采用有针对性的原生质体制备方法。
专利号为CN113621552A、CN113046291A和CN114058564A的发明专利公开了紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织的原生质体提取方法，虽然水稻与紫花苜蓿、棉花、艾草同属于植物，但是由于生存于不同的环境中，植物通常表现出截然不同的生长发育特性，造成了水稻茎细胞与紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织细胞在生理生化、结构、功能等方面均具有非常大的差异，适用于紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织原生质体提取的方法在水稻茎细胞中不能有效发挥功能，亟需开发一种适用于水稻茎组织原生质体的提取方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种适用于水稻茎组织原生质体的提取方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：第一，本发明提供了一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，包括如下步骤：
S1，水稻培养
取水稻成熟种子，经消毒处理后，培养至孕穗分化期；
S2，水稻茎预处理
取培育好的水稻，并将水稻茎节切成0.5-1mm长度，用D-山梨醇溶液浸泡10-20min；
S3，酶解
取浸泡好的茎节加入到酶解液中进行酶解，酶解时间为3-5h；所述酶解液包括纤维素酶RS、离析酶R-10、蜗牛酶、D-山梨醇、MES、KCl、CaCl
S4，原生质体释放
向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇释放原生质体；
S5，分离
将酶解液和原生质体释放液的混合液过滤，离心分离，得到原生质体。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶解液的配方为：1％-3％纤维素酶RS、0.5％-2％离析酶R-10、0.5％-1％蜗牛酶、80-95g/L D-山梨醇、20-30mmol/L MES、10-20mmol/L KCl、10-20mmol/L CaCl
在以上技术方案的基础上，优选的，酶解时需在25-28℃避光条件下，以50-70rpm/min转速酶解3-5h。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5中离心分离方法为：利用孔径为70μm的细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将上清液置于离心管中，利用300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心后，再重悬，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5离心分离后用含有D-山梨醇的W1溶液2次重悬细胞和离心，清洗Ca
在以上技术方案的基础上，优选的，所述原生质体释放液的配方为：80-95g/L D-山梨醇、20-25mmol/L MgCl2、4-6mmol/LMES和0.1％-0.3％BSA，溶剂为去离子水，pH为5-6。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述W1溶液的配方为80-95g/L D-山梨醇、3-5mmol/LMES和15-25mmol/LKCl，溶剂为去离子水，pH为5-6。
在以上技术方案的基础上，优选的，水稻茎节选取水稻第一剑叶位置的茎节。
第二，本发明提供了水稻茎单细胞原生质体的提取方法所提取的原生质体。
第三，本发明提供了原生质体在单细胞转录组测序中的应用。
本发明的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)蜗牛酶是一种混合酶，可以使植物组织解离出更多的原生质体；D-山梨醇起到维持细胞渗透压的作用，同时还可被细胞部分吸收利用维持生存。两者协同作用，可以获得更多的活性原生质体，降低细胞裂解的碎片率；同时山梨醇作为多元醇还能起到降低细胞结团的效果。
(2)本发明通过对酶解液、酶解时间、原生质体清洗步骤进行优化，得到一套高效分离、高活力及高数量水稻茎原生质体制备的体系和方法，0.2g水稻茎可以制备出约5×10
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1水稻原生质体消化状态图；
图2为本发明对比例1水稻原生质体消化状态图；
图3为本发明对比例2水稻原生质体消化状态图；
图4为本发明实施例1水稻原生质体活力检测图；
图5为本发明对比例1水稻原生质体活力检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明所用试剂和酶均为市场上所购买，其中水稻培养液的配方如下：
母液I：NH
母液II：CaCl
母液III：MgCl
母液IV：FeSO
母液V：H
配置母液I、母液II、母液III、母液IV、母液V，将1ml母液I、1ml母液II、1ml母液III、1ml母液V和5ml母液IV加入到ddH
实施例一
本实施例的适用于水稻茎单细胞转录组测序测的原生质体制备方法，包括如下步骤：
S1，水稻培养
将“日本晴”水稻种子置于干净的烧杯中，加入蒸馏水没过种子，早晚更换蒸馏水，37℃避光培养。待种子露白后，将种子转移至水稻培养液中，在28℃光照培养箱中培养，光照强度为10,0001x，每天14h黑暗，10h光照。每天更换培养液，培养至孕穗分化期。
S2，水稻茎预处理
取培育好的水稻第一剑叶位置的茎节，剥除外面叶鞘，将内部茎节切成0.5mm长度，取材时间尽量控制在1h以内；取0.2g茎节材料，用91.1g/L的D-山梨醇溶液黑暗浸泡10min茎节。
S3，酶解
取浸泡好的茎节加入到酶解液中，在25℃避光条件，50rpm/min转速酶解5h；酶解液的配方为：1％纤维素酶RS、0.5％离析酶R-10、0.5％蜗牛酶、80g/L D-山梨醇、20mmol/LMES(pH5.7)、10mmol/LKCl、10mmol/L CaCl
S4，原生质体释放
S41，向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇2min释放原生质体，得到混合液。
S42，利用孔径为70μm的Biologix细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将过滤液过滤到50ml离心管中，300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心(使用20ml原生质体释放液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min；去掉上清液，加入30ml原生质体释放液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min。)后，再次加入原生质体释放液重悬细胞，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的Biologix细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。
S43，离心分离后，去掉上清液，用W1溶液2次重悬细胞和离心(加入20mL W1溶液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min；去掉上清液后，加入20mL W1溶液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min。)，然后加入20mLW1溶液轻摇重悬，得到原生质体。
原生质体释放液的配方为：80g/L D-山梨醇、20mmol/LMgCl
W1溶液的配方为80g/L D-山梨醇、3mmol/LMES(pH5.7)和15mmol/L KCl，溶剂为去离子水，pH为5。
实施例二
本实施例的适用于水稻茎单细胞转录组测序的原生质体制备方法，包括如下步骤：
S1，水稻培养
将“日本晴”水稻种子置于干净的烧杯中，加入蒸馏水没过种子，早晚更换蒸馏水，37℃避光培养。待种子露白后，将种子转移至水稻培养液中，在28℃光照培养箱中培养，光照强度为10,0001x，每天14h黑暗，10h光照。每天更换培养液，培养至孕穗分化期。
S2，水稻茎预处理
取培育好的水稻第一剑叶位置的茎节，剥除外面叶鞘，将内部茎节切成0.8mm长度，取材时间尽量控制在1h以内；取0.2g茎节材料，用91.1g/L的D-山梨醇溶液黑暗浸泡15min茎节。
S3，酶解
取浸泡好的茎节加入到酶解液中，在26℃避光条件，60rpm/min转速酶解4h；酶解液的配方为：1.5％纤维素酶RS、0.7％离析酶R-10、0.7％蜗牛酶、91.1g/L D-山梨醇、25mmol/LMES(pH5.7)、15mmol/LKCl、15mmol/L CaCl
S4，原生质体释放
S41，向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇2min释放原生质体，得到混合液。
S42，利用孔径为70μm的Biologix细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将过滤液过滤到50ml离心管中，300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心(使用20ml原生质体释放液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min；去掉上清液，加入30ml原生质体释放液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min。)后，再次加入原生质体释放液重悬细胞，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的Biologix细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。
S43，离心分离后，去掉上清液，用W1溶液2次重悬细胞和离心(加入20mL W1溶液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min；去掉上清液后，加入20mL W1溶液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min。)，然后加入20mLW1溶液轻摇重悬，得到原生质体。
原生质体释放液的配方为：91.1g/L D-山梨醇、22mmol/L MgCl
W1溶液的配方为91.1g/L D-山梨醇、4mmol/LMES(pH5.7)和20mmol/L KCl，溶剂为去离子水，pH为5.7。
实施例三
本实施例的适用于水稻茎单细胞转录组测序的原生质体制备方法，包括如下步骤：
S1，水稻培养
将“日本晴”水稻种子置于干净的烧杯中，加入蒸馏水没过种子，早晚更换蒸馏水，37℃避光培养。待种子露白后，将种子转移至水稻培养液中，在28℃光照培养箱中培养，光照强度为10,0001x，每天14h黑暗，10h光照。每天更换培养液，培养至孕穗分化期。
S2，水稻茎预处理
取培育好的水稻第一剑叶位置的茎节，剥除外面叶鞘，将内部茎节切成1mm长度，取材时间尽量控制在1h以内；取0.2g茎节材料，用91.1g/L的D-山梨醇溶液黑暗浸泡20min茎节。
S3，酶解
取浸泡好的茎节加入到酶解液中，在28℃避光条件，70rpm/min转速酶解2h；酶解液的配方为：3％纤维素酶RS、2％离析酶R-10、1％蜗牛酶、95g/L D-山梨醇、30mmol/L MES(pH5.7)、18mmol/LKCl、20mmol/L CaCl
S4，原生质体释放
S41，向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇2min释放原生质体，得到混合液。
S42，利用孔径为70μm的Biologix细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将过滤液过滤到50ml离心管中，300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心(使用20ml原生质体释放液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min；去掉上清液，加入30ml原生质体释放液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min。)后，再次加入原生质体释放液重悬细胞，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的Biologix细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。
S43，离心分离后，去掉上清液，用W1溶液2次重悬细胞和离心(加入20mL W1溶液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min；去掉上清液后，加入20mL W1溶液轻摇重悬沉淀，1500rpm，离心5min。)，然后加入20mLW1溶液轻摇重悬，得到原生质体。
原生质体释放液的配方为：95g/L D-山梨醇、25mmol/LMgCl
W1溶液的配方为95g/L D-山梨醇、5mmol/LMES(pH5.7)和25mmol/L KCl，溶剂为去离子水，pH为6。
对比例一
裂解液不含蜗牛酶，其余成分和步骤同实施例一。
对比例二
裂解液中、原生质体释放液和W1溶液中的不含山梨醇，由甘露醇代替，其余成分同实施例一。
对比例三
裂解液采用亚洲棉根尖裂解液的配方：纤维素酶R101.5％、果胶酶1％、D-甘露醇0.4mol/L、0.08mol/LMES、0.1mol/LKCl、0.02mol/L CaCl
对比例四
裂解液采用紫花苜蓿幼根的酶解液：2％纤维素酶、1％果胶酶、0.4％离析酶、0.5mol/L甘露醇、20mmol/LMES、20mmol/LKCl、10mmol/L CaCl
对比例五
裂解液采用艾叶组织的酶解液：2％纤维素酶R-10、0.4％离析酶R-10、1％果胶酶、1％半纤维素酶、0.5mol/L甘露醇、20mmol/L MES、20mmol/L KCl、10mmol/L CaCl
对比例六
酶解液中的蜗牛酶浓度为3％，其余组分同实施例一。
对比例七
酶解时需在30℃避光条件下，以200rpm/min转速酶解3h，其余步骤同实施例一。
取10μl实施例1和对比例原生质体悬液镜检观察，结果见图1-3，镜检可以看到完整的原生质体。另取10μl利用FDA染色细胞计数仪计数，检测原生质体的数量和活率，结果见图4-5。
表1原生质体数量和活性
由表1可知，相比于半纤维素酶和果胶酶，蜗牛酶可以提高水稻茎细胞原生质体制备得率，可为后续进行单细胞测序实验提供了充足的材料。图1-3可以看出D-山梨醇(实施例1)可以保持原生质的活性。增加蜗牛酶的浓度，增加酶解温度和转速，均会降低原生质体的存活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。