一种积雪草3号提取物的新用途

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其是一种积雪草3号提取物的新用途。

背景技术

积雪草为伞形科积雪草属Centella L.植物积雪草Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草，又名“雷公根”、“铜钱草”、“崩大碗”等，广泛分布于长江流域以南各地(四川、云南、贵州)。积雪草始载于《神农本草经》，为《中华人民共和国药典》收载用药。其味苦、辛，性寒，归肝、脾、肾经，具有清热利湿、解毒消肿的功效，现多用于治疗湿热黄疸、痈肿疮毒、跌扑损伤等。

皮肤光老化属于外源性老化，是引起皮肤衰老的重要原因之一，严重损害人体健康，甚至会引起皮肤癌。外源性衰老通常是由紫外线辐射、吸烟及接触有害化学物质等环境因素引起的皮肤衰老。来自太阳的紫外线(ultraviolet，UV)包括长波紫外线UVA，320～400nm)、中波紫外线(UVB，290～320nm)和短波紫外线(UVC，270～290nm)。其中，UVB对皮肤伤害最大，长期照射会导致皮肤松弛、粗糙和出现红斑。

皮肤光老化组织学变化主要表现多为表皮不规则增厚，过量的UVB照射会对人体表皮产生较大损害。角质层是表皮的最外层，主要由角质形成细胞组成，占表皮细胞的90％以上，易被UVB损害，而HaCaT细胞是一种被转化但不致癌的角质形成细胞系，也是UVB的靶细胞，在形态学和生物学特性上与正常人角质形成细胞相似，保留了所有的表皮分化能力，现代药理学研究中HaCaT细胞常用于评价抗光老化活性。

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的细胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外，因此可以通过检测细胞培养上清中LDH活性判断细胞的受损程度。这也成为研究中药提取物对UVB损伤影响程度的重要参照。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种积雪草3号提取物的新用途。

本发明采用的技术方案是：

一种积雪草3号提取物，为三萜类化合物2α,3β,6β,23-四羟基-齐墩果烷-13-烯-28-酸-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，具有(Ⅰ)所示结构：

上述积雪草3号提取物的制备方法，具体步骤如下：

(1)积雪草乙醇溶液加热回流提取，收集提取液；

(2)提取液减压浓缩得到粗提物浸膏，以水分散后经大孔树脂柱色谱，得到水层和乙醇层；

(3)将得到的95％乙醇层干法上样，经过开放硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/二氯甲烷-甲醇-水进行梯度洗脱，得到组分Fr.34；

(4)Fr.34经MCI柱色谱，以甲醇-水梯度洗脱得到组分Fr.34.9；

(5)Fr.34.9经高效液相色谱制备得到积雪草3号提取物。

优选的，上述积雪草3号提取物的制备方法，具体步骤如下：

(1)积雪草干燥全草打粉后用十倍量体积分数70％乙醇溶液加热回流提取3次，每次3h，合并提取液；

(2)提取液减压浓缩得到粗提物浸膏，以水分散后经D101大孔树脂柱色谱，得到水层和95％乙醇层；

(3)将得到的95％乙醇层干法上样，经过开放硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/二氯甲烷-甲醇-水(100∶0→20∶1→10∶1→5∶1→10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→0∶100)进行梯度洗脱，共得到40个组分Fr.1～Fr.40；

(4)Fr.34经MCI柱色谱，以甲醇-水(0∶100→100∶0)梯度洗脱得到20个组分Fr.34.1～Fr.34.20；

(5)Fr.34.9经高效液相色谱(26％乙腈-水，t

上述积雪草3号提取物在制备提高HaCaT细胞活性的产品中的应用。

上述积雪草3号提取物在制备抗皮肤光老化及氧化损伤产品中的应用。

优选的，上述积雪草3号提取物的应用，所述产品为抗皮肤光老化及氧化损伤药物或化妆品。

本发明的有益效果是：

上述积雪草3号提取物可显著提高HaCaT细胞活性，并且对由UVB引起的HaCaT细胞氧化损伤具有保护作用，可有效对抗皮肤光老化及氧化损伤，为积雪草及其活性成分在抗皮肤衰老领域的研究提供重要依据。

附图说明

图1是YCA-3的主要HMBC、

图2是YCA-3的

图3是YCA-3的

图4是YCA-3的DEPT(150MHz,C

图5是YCA-3的HSQC谱图；

图6是YCA-3的HMBC谱图；

图7是YCA-3的

图8是YCA-3的TOCSY谱图；

图9是YCA-3的NOESY谱图；

图10是YCA-3的UPLC-Q-TOF-MS谱图；

图11是不同浓度YCA-1、YCA-2、YCA-3对HaCaT细胞活性的影响

图12是不同浓度YCA-1、YCA-2、YCA-3对UVB损伤的HaCaT细胞活力的影响

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图13不同浓度YCA-1、YCA-2、YCA-3对UVB损伤的HaCaT细胞LDH释放量的影响

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

下述实施例中使用的实验仪器、材料与试剂如下：

1.实验仪器

2.实验材料

3.实验试剂

采用的积雪草于2019年10月购买于河北安国药材市场(批号为YCA20191006)，为伞形科积雪草属植物积雪草Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草。

实施例1

分离提取积雪草干燥全草获得YCA-3：2α,3β,6β,23-四羟基-齐墩果烷-13-烯-28-酸-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2α,3β,6β,

23-tetrahydroxyolean-13-en-28-oic acid

O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosyl ester)

分离流程：

积雪草干燥全草(10kg)，打粉后用十倍量体积分数70％乙醇溶液加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压浓缩得到粗提物浸膏，以适量的水分散后经D101大孔树脂柱色谱，得到水层400g，95％乙醇层641g。将得到的95％乙醇层干法上样，经过开放硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/二氯甲烷-甲醇-水(100∶0→20∶1→10∶1→5∶1→10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→0∶100)进行梯度洗脱，共得到40个组分(Fr.1～Fr.40)。Fr.34(40g)经MCI柱色谱，干法上样，以甲醇-水(0∶100→100∶0)梯度洗脱得到20个组分(Fr.34.1～Fr.34.20)，Fr.34.9经高效液相色谱(26％乙腈-水，t

对所得化合物YCA-3进行结构解析：

白色粉末，溶于甲醇。

1

13

1

HMBC谱(图6)中，H-1(2.52,1.49)与C-2(69.6)相关，H-3(4.35,4.18)与C-2(69.6)相关，H-5(1.95)与C-3(78.7)，表明2位和3位分别连有一个羟基；H-5(1.95)和H-7(1.91)与C-6(68.2)相关，表明6位连有一个羟基；H-23(4.38,4.06)与C-3(78.7),C-4(44.8)和C-5(48.9)相关，表明23位连有一个羟基；H-12(1.83)、H-15(1.12,2.22)、H-16(1.52,2.22)、H-19(2.54,2.22)与C-13(139.2)、C-18(128.6)相关，表明13和18位存在双键；H-18(1.30)与C-28(178.6)相关，H-16(1.52)、H-22(1.38)与C-28(176.3)相关，表明17位连有羰基；H-1'(6.28)与C-28(176.3)相关，H-1”(4.97)与C-6'(69.8)相关，H-1”'(5.84)与C-4”(79.0)相关，推测三糖链连接在母核的28位以及糖的连接顺序。综合以上信息，推测出该化合物的平面结构(图1a)。

在NOESY谱(图9)中H-23(4.06)、Me-27(1.06)与H-6(5.07)相关，H-23、Me-27为α构型，说明H-6为α构型，则6-OH为β构型(图1b)。

糖的绝对构型：皂苷经酸水解、L-半胱氨酸甲酯盐酸盐和邻甲苯基异硫氰酸甲酯衍生化实验后鉴定为D-葡萄糖和L-鼠李糖。

综上所述，该化合物的结构鉴定为2α,3β,6β,23-四羟基-齐墩果烷-13-烯-28-酸-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，经Scifinder检索未发现相关报道，为一个新的三萜类化合物。

表1YCA-3

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参考化合物：积雪草皂苷A实施例2

实施例1中积雪草提取物对UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

下述实验中，积雪草提取物YCA-1、YCA-2的获得方法如下：

YCA-1：积雪草干燥全草10kg，打粉后用十倍量体积分数70％乙醇溶液加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压浓缩得到粗提物浸膏，以适量的水分散后经D101大孔树脂柱色谱，得到水层400g，95％乙醇层641g。将得到的95％乙醇层干法上样，经过开放硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/二氯甲烷-甲醇-水(100∶0→20∶1→10∶1→5∶1→10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→0∶100)进行梯度洗脱，共得到40个组分(Fr.1～Fr.40)。Fr.17(11.3g)经MCI柱色谱，以甲醇-水(0∶100→100∶0)梯度洗脱得到20个组分(Fr.17.1～Fr.17.20)，Fr.17.12(7.4g)经高效液相色谱(75％甲醇-水，t

YCA-2：积雪草干燥全草10kg，打粉后用十倍量体积分数70％乙醇溶液加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压浓缩得到粗提物浸膏，以适量的水分散后经D101大孔树脂柱色谱，得到水层400g，95％乙醇层641g。将得到的95％乙醇层干法上样，经过开放硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇/二氯甲烷-甲醇-水(100∶0→20∶1→10∶1→5∶1→10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→0∶100)进行梯度洗脱，共得到40个组分(Fr.1～Fr.40)。Fr.17(11.3g)经MCI柱色谱，以甲醇-水(0∶100→100∶0)梯度洗脱得到20个组分(Fr.17.1～Fr.17.20)，Fr.17.17(286mg)经高效液相色谱(39％乙腈-水，t

1实验材料

积雪草中提取成分(YCA-1、YCA-2、YCA-3)、MEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清FBS(以色列Biolnd公司)、0.25％胰酶+0.02％EDTA(美国Gibco公司)、青霉素-链霉素(PS)(美国Gibco公司)、PBS磷酸缓冲液(美国Gibco公司)、DMSO(美国Sigma公司)、CCK-8试剂盒(日本Dojindo Lab公司)、LDH试剂盒(日本Dojindo Lab公司)、HaCaT细胞。

2实验方法

2.1溶液的配制

(1)MEM完全培养液的配制：取适量MEM基础培养基，加入10％FBS，1％PS，混匀即得，于4℃保存备用；

(2)积雪草提取物的配制：精密称取1.01mgYCA-1、1.84mgYCA-2、1.95mgYCA-3于200μL离心管中，YCA-1、YCA-2、YCA-3管中加入20μLDMSO使其完全溶解，得100mM的母液，于4℃保存备用。用DMEM完全培养基逐级稀释的方式配制其1，10，100μM的样品溶液；

(3)1×CCK-8工作液的配制：根据检测需要将10×CCK-8溶液用PBS溶液稀释10倍，混匀即得。

2.2HaCaT细胞培养

当细胞密度达70～80％时，进行正常的传代培养。传代时倾倒培养瓶中的培养液，加入1mLPBS清洗两次，加入0.25％胰酶(含0.02％EDTA)1.5mL放置于孵箱5min进行消化，镜下观察，待细胞均消化成球状，加入适量MEM完全培养液终止消化，轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，收集细胞，将细胞悬液吸至离心管中，4℃、1000rpm低速离心3min。弃去上清，加入MEM完全培养液，轻轻吹打细胞沉淀，使其分散成均匀的细胞悬液。将细胞悬液加到培养瓶中，镜下观察细胞分散程度，放入培养箱中培养，定期观察细胞状态，待长到80％左右传代及种板。

取洁净的血球计数板一块，用酒精棉球擦拭干净计数板和盖玻片，把盖玻片放在计数板上，将细胞悬液吹匀，用10μL的枪吸取细胞悬液并从计数板中间打入，切勿产生气泡。静置片刻，使细胞沉降到计数板上。将血球计数板放置于显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到计数区，再转换高倍镜观察并进行计数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

计数公式＝细胞数/mL＝四大格的细胞数/4×10000。

将HaCaT细胞以1×10

2.3积雪草中提取物对HaCaT细胞毒性的影响

取对数生长期的HaCaT细胞，以1×10

2.4积雪草中提取物对UVB损伤的HaCaT细胞活力的影响

取对数生长期HaCaT细胞，按1×10

3统计学处理

所有数据采用SPSS 26.0统计分析软件进行处理，以均数±标准差

4结果

4.1积雪草中提取物对HaCaT细胞毒性的影响

如表2、图11所示，1，10，100μM的YCA-1、YCA-2、YCA-3组HaCaT细胞活力与正常对照组相比无显著性差异，是对HaCaT细胞的安全浓度，100μM的YCA-3可显著提高HaCaT细胞活性，选取1，10，100μM的YCA-1、YCA-2、YCA-3进行后续实验。

表2不同浓度YCA-1、YCA-2、YCA-3对HaCaT细胞活性的影响

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4.2积雪草中提取物对UVB损伤的HaCaT细胞活力的影响

如表3，图12所示，与Control组相比，UVB照射后细胞活力降低约40％，表明细胞光老化模型构建成功。给予1，10，100μM的YCA-1、YCA-2、YCA-3后，与UVB组相比，1，10，100μM的YCA-3组细胞活力均显著提高。

表3不同浓度YCA-1、YCA-2、YCA-3对UVB损伤的HaCaT细胞活力的影响

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4.3积雪草和中提取物对UVB损伤的HaCaT细胞LDH释放量的影响

如表4、图13所示，与Control组相比，UVB照射后细胞LDH释放量显著提高。给予1、10、100μM的YCA-1、YCA-2、YCA-3后，与UVB组相比，10、100μM的YCA-3组细胞LDH释放量显著下降。

表4不同浓度YCA-1、YCA-2、YCA-3对UVB损伤的HaCaT细胞LDH释放量的影响

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以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。