一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

在机体预防或对抗病毒感染时，B细胞需要得到足够强烈的病毒抗原刺激才能引发有效的体液免疫保护机体。常规的病毒疫苗如灭活/减毒疫苗、蛋白亚蛋白疫苗、基因(DNA/RNA)疫苗是通过添加佐剂、提高抗原蛋白纯度或者通过在体持续不断表达抗原蛋白的方式来增强抗原刺激效果。而新一代的仿病毒结构纳米颗粒(virus like particle,VLP)疫苗则是通过在纳米颗粒表面展示抗原蛋白以形成多次重复的抗原表位的方式，使B细胞受体识别抗原时形成簇集而放大抗原信号，从而增强抗原刺激效果。由于VLP疫苗不含病毒遗传物质，故其相比于传统灭活/减毒疫苗安全性更高，相比于基因疫苗也能避免潜在的基因安全隐患、降低副作用；而其对病毒抗原蛋白重复、高密度的展示相比于常规重组蛋白疫苗的免疫刺激效力更强。故VLP疫苗被认为是继灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗之后的第七代疫苗技术，尤其在应对当前新冠疫情(COVID-19)方面具有独特的优势。

当前VLP疫苗的制备大多是基于融合蛋白技术，即通过将抗原蛋白基因片段与具有组装能力的蛋白基因片段进行连接、表达出具有自组装能力的抗原蛋白，最终通过自组装得到仿病毒颗粒。这种技术已经取得很大的成功，当前上市的融合蛋白VLP疫苗包括HPV疫苗、HBV疫苗、以及针对新冠病毒的NVX-CoV2373疫苗。但当前基于融合蛋白技术的VLP疫苗面临的最大问题是研发成本高、产量低，部分原因是由于融合蛋白设计难度大、表达效率较低、且最终组装的成功率也存在随机性。

而以合成材料为载体制备VLP疫苗是另外一种极具潜力的技术，即通过合成材料预先进行自组装得到纳米颗粒载体，再将抗原蛋白通过物理吸附或

者化学键接的方式修饰到纳米载体表面，最终得到表面展示重复抗原序列的纳米颗粒疫苗。这种基于合成材料的技术的优势在于通过合成材料组装得到的纳米载体产量高、性质稳定可控，且无需对抗原蛋白进行基因水平的编辑改造、而是通过统一的物理吸附/化学修饰手段即可将抗原蛋白修饰到纳米载体表面上。但目前这项技术尚未成熟，对载体材料和蛋白修饰方法的优选没有统一的结论。对于已知的基于合成材料载体的VLP疫苗，存在着载体材料成本过高或者蛋白修饰方法效率较低、不可控的问题。如现有技术提出使用的脂质体载体或使用氧化石墨烯载体，载体材料本身成本较高、安全性差，难以推广普及。

而当前提出的蛋白修饰方法中，物理吸附方法虽然操作较简单，但修饰效率不可控，且颗粒疫苗进入体内后还有脱吸附导致刺激效力下降的风险。而通过抗原蛋白上的组氨酸标签与脂质双分子层内的钴形成配位键实现键接的方式虽然效率较高，但是为载体的构建增加了难度。对载体或抗原蛋白进行简单的化学改性，通过抗原蛋白上巯基或氨基与载体上马来酰亚胺基团或者羧基的反应进行键接是更普遍的修饰方式，如使用EDC/NHS活化脂质体表面羧基而与抗原蛋白的氨基直接反应键接，使用TCEP还原抗原蛋白上的二硫键，通过暴露的巯基与载体上的马来酰亚胺基团反应键接。这种基于抗原蛋白自身氨基或者二硫键进行反应的键接方式虽然简单且能保证稳定的共价结合，但是蛋白自身伯胺与空间位阻较大的纳米载体表面反应活性较低、而二硫键还原出来的巯基数量较少，这些问题都导致这种蛋白修饰方法的键接效率偏低，可控性差，无法真正突出VLP疫苗的优势并且难以大规模推广应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用，能够克服当前重组蛋白疫苗制备效率低，以及以合成材料为载体的VLP疫苗的可控性差、抗原蛋白修饰效率低的问题。

本发明提供了一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗，包括：

内核，所述内核为纳米粒子，所述纳米粒子由生物可降解聚合物自组装得到，或在自组装过程中负载免疫激动剂分子；

外壳，所述外壳为修饰在内核表面的抗原蛋白，所述抗原蛋白为经过胺反应改性剂处理后的产物。

优选的，所述生物可降解聚合物选自聚酯类化合物；

所述外壳通过共价化学反应键接到纳米粒子表面。

优选的，所述纳米粒子选自化合物和/或化合物与聚乙二醇的嵌段共聚物；

所述化合物选自聚乳酸及其衍生物、聚(乳酸-乙醇酸)及其衍生物、聚己内酯及其衍生物中的至少一种。

优选的，所述抗原蛋白选自蛋白和/或含有蛋白功能片段的多肽序列；

所述蛋白选自病毒的刺突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白、肿瘤细胞的整合膜蛋白、外周膜蛋白、锚定膜蛋白或其部分组成结构中的至少一种。

优选的，所述胺反应改性剂选自2-亚氨基硫杂环戊烷及其衍生物、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰巯基乙酸酯及其衍生物、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰巯基丙酸酯及其衍生物中的至少一种。

优选的，所述纳米粒子具有与胺反应改性剂发生反应的功能基团；

所述功能基团选自碳碳双键、碳碳三键、异氰酸酯、环氧基团、马来酰亚胺基团中的至少一种。

本发明提供了一种上述技术方案所述的仿病毒结构纳米颗粒疫苗的制备方法，包括：

将抗原蛋白与纳米粒子进行共孵育，得到仿病毒结构纳米颗粒疫苗。

优选的，所述纳米粒子的制备方法包括：

将生物可降解聚合物组装成纳米粒子；

所述组装的方法选自纳米沉淀法或乳化溶剂挥发法。

优选的，所述抗原蛋白的制备方法包括：

将胺反应改性剂和蛋白共孵育，得到抗原蛋白。

本发明提供了一种疫苗药物，包括：

上述技术方案所述的仿病毒结构纳米颗粒疫苗；

免疫佐剂。

本发明提供的仿病毒结构纳米颗粒疫苗的载体材料成本低，产量高，且组装得到的纳米颗粒载体结构稳定，可控性好，有利于规模化生产；所采取的蛋白修饰方法效率高，能由此反应得到具有高表面抗原键接量的VLP疫苗。本发明得到的VLP疫苗具有较强的淋巴结回流和滞留能力，能高效刺激淋巴结产生生发中心，并引发较高的特异性抗体滴度水平，经本发明VLP疫苗刺激产生的血清能实现较强的病毒中和能力。

附图说明

图1为实施例2制备得到的外消旋型MalPEG

图2为实施例3制备得到的外消旋型MalPEG

图3为实施例11使用的均匀分布条件下的斐波那契球体点阵模型；

图4为实施例12中使用能量过滤低温透射电镜观察的各个价数OVA纳米颗粒疫苗的形态，标尺为50nm；

图5为实施例13中不同价数的外消旋型OVA/BSA纳米颗粒疫苗的淋巴结回流效果图及离体荧光定量数据图；

图6为实施例14中，具有优选价数为200价的外消旋型OVA纳米颗粒疫苗不同时间下在淋巴结内部的滞留效果图，标尺为2μm；

图7为实施例15中，具有优选价数为200价的外消旋型OVA纳米颗粒疫苗不同时间下刺激淋巴结产生生发中心的效果图，标尺为2μm。绿色为使用AF594标记的B220

图8为实施例16中，不同价数以及不同抗原蛋白的外消旋型纳米颗粒疫苗体内刺激产生特异性抗体滴度的效果；

图9为实施例17中，具有优选价数为400的D/L型RBD纳米颗粒疫苗体内刺激产生特异性抗体滴度的效果；

图10为实施例18中，具有优选价数为400且载体内搭载R848的外消旋型RBD纳米颗粒疫苗体内刺激产生特异性抗体滴度的效果；

图11为实施例19中，具有优选价数为400的外消旋型新冠病毒RBD抗原蛋白纳米颗粒疫苗与铝佐剂联用后进行皮下刺激并表征的特异性抗体滴度结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗，包括：

内核，所述内核为纳米粒子，所述纳米粒子选自生物可降解聚合物；

外壳，所述外壳为修饰在内核表面的抗原蛋白，所述抗原蛋白为经过胺反应改性剂处理后的产物。

在本发明中，所述纳米粒子的流体动力学粒径优选为30～300nm，更优选为50～250nm，更优选为100～200nm，最优选为150nm。

在本发明中，所述纳米粒子中优选还包括共担载的免疫刺激剂；所述免疫刺激剂优选为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、雷西莫特(R848)、脂多糖(LPS)、单磷酰脂A(MPLA)中的至少一种。

在本发明中，所述生物可降解聚合物优选选自A和/或B；所述A选自聚酯类化合物，更优选选自聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚己内酯等聚酯类化合物中的至少一种或其衍生物中的至少一种；所述B选自A与聚乙二醇的嵌段共聚物。在本发明中，所述聚乳酸的旋光性优选为外消旋型、D型或L型。

在本发明中，所述聚酯类化合物(或其衍生物)的重均分子量优选为10～50kDa，更优选为20～40kDa，最优选为30kDa；所述聚乙二醇的重均分子量优选为1～10kDa，更优选为2～8kDa，最优选为3～6kDa。

在本发明中，所述生物可降解聚合物中优选含有与胺反应性改性剂发生反应的功能基团；所述功能基团优选选自碳碳双键、碳碳三键、异氰酸酯、环氧基团、马来酰亚胺基团中的至少一种。

在本发明中，所述生物可降解聚合物优选为马来酰亚胺聚乙二醇与聚乳酸的嵌段共聚物，这种聚乙二醇与聚乳酸的嵌段共聚物成本较低，材料生物相容性好，且能在水相中组装成稳定的具有亲疏水结构的纳米胶束，嵌段共聚物材料载体成分更单一，结构更稳定。

在本发明中，所述抗原蛋白优选选自C、D、E和F中的一种或几种；所述C选自病毒的刺突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白中的至少一种或其部分组成结构中的至少一种；所述D选自C的蛋白部分功能片段的多肽序列中的至少一种；所述E选自肿瘤细胞的整合膜蛋白、外周膜蛋白、锚定膜蛋白中的至少一种或其部分组成结构中的至少一种；所述F选自E的蛋白部分功能片段的多肽序列中的至少一种。

在本发明中，所述抗原蛋白优选为新冠病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白上的受体结合区域(receptor binding domain,RBD)部分的蛋白、尼帕病毒的粘附(G)蛋白、三阴性乳腺癌细胞的膜表面蛋白TROP2中的一种或几种。

在本发明中，所述胺反应性改性剂优选选自2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut’sReagent)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰巯基乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰巯基丙酸酯(SATP)等中的至少一种或其衍生物中的至少一种，更优选为2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut’s Reagent)。

在本发明中，伯胺是蛋白结构上最多的反应端基位点，本发明中的胺反应性改性剂不仅能将伯胺改性为反应活性更高的功能基团，还能在一个蛋白分子上修饰出多个活性反应位点。相比于直接与蛋白原有的伯胺基团反应实现键接的方法或通过TCEP还原蛋白二硫键引出较少数目巯基参与反应实现键接的方法，本发明使用胺反应性改性剂活化蛋白的方法能实现更高的键接效率。

在本发明中，所述仿病毒结构纳米颗粒疫苗具有核壳结构，内核由合成材料组装得到的纳米粒子形成，外壳由修饰在纳米粒子表面的抗原蛋白形成，内核的材料成分为生物可降解聚合物，外壳的抗原蛋白经胺反应性改性剂处理后通过与内核聚合物的共价化学反应键接到纳米粒子表面。

本发明提供了一种上述技术方案所述的仿病毒结构纳米颗粒疫苗的制备方法，包括：

抗原蛋白与纳米粒子进行共孵育，得到仿病毒结构纳米颗粒疫苗。

在本发明中，所述纳米粒子的制备方法优选包括：

将生物可降解聚合物组装成纳米粒子；

所述组装的方法选自纳米沉淀法或乳化溶剂挥发法。

在本发明中，所述生物可降解聚合物优选为马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物；所述马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的制备方法优选包括：

在催化剂的作用下，将Mal-PEG5k-OH(马来酰亚胺聚乙二醇羟基)和丙交酯单体在溶剂中进行反应，得到马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物。

在本发明中，所述催化剂优选为辛酸亚锡。

在本发明中，所述丙交酯单体优选选自无水外消旋丙交酯单体、无水D型丙交酯单体或无水L型丙交酯单体。

在本发明中，所述无水外消旋丙交酯单体的制备方法优选包括：

将D型丙交酯和L型丙交酯混合后在溶剂中溶解，室温静置重结晶，抽去上层溶剂，再重复重结晶，最后抽干溶剂，得到无水外消旋丙交酯单体。

在本发明中，所述D型丙交酯和L型丙交酯的质量比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：1；所述溶剂优选为乙酸乙酯，更优选为无水乙酸乙酯；所述溶解的温度优选为80～100℃，更优选为85～95℃，最优选为90℃；所述溶解优选进行搅拌；所述重复结晶优选为2次。

在本发明中，所述无水D型丙交酯单体的制备方法优选包括：

将D型丙交酯在溶剂中溶解，室温静置重结晶，抽去上层溶剂，再重复重结晶，最后抽干溶剂，得到无水D型丙交酯单体。

在本发明中，所述溶剂的成分，溶解的温度以及重结晶的次数与上述技术方案所述制备无水外消旋丙交酯单体过程中一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述无水L型丙交酯单体的制备方法与上述技术方案所述无水D型丙交酯单体的制备方法一致，区别在于，将D型丙交酯替换为L型丙交酯。

在本发明中，所述制备马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的溶剂优选为甲苯，更优选为无水甲苯。

在本发明中，所述丙交酯单体、Mal-PEG5k-OH和催化剂的质量比优选为(80～100)：(12～15)：(0.2～0.5)，更优选为90：13：0.3。

在本发明中，所述反应的温度优选为100～120℃，更优选为105～115℃，最优选为110℃；所述反应的时间优选为20～30小时，更优选为24小时。

在本发明中，所述反应结束后优选还包括：

将得到的反应产物进行沉降、抽滤、复溶、重复沉降、干燥，得到马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物。

在本发明中，所述沉降的试剂优选为乙醚，更优选为无水乙醚；所述沉降的试剂的体积优选为反应产物体积的8～12倍，更优选为10倍；所述复溶的试剂优选为二氯甲烷；所述重复沉降的次数优选为2次；所述干燥优选为真空干燥，所述干燥优选为干燥过夜。

在本发明中，所述组装的方法优选包括：

将所述生物可降解聚合物溶解在有机相中，然后逐滴加入到水相中，再进行透析，得到纳米粒子(纳米胶束溶液)。

在本发明中，所述有机相优选选自丙酮和/或二氧六环，所述丙交酯单体为无水外消旋丙交酯单体时，所述有机相优选为丙酮；所述丙交酯单体为无水D型丙交酯单体或无水L型丙交酯单体时，所述有机相优选为二氧六环和丙酮，优选先溶解于二氧六环中，再逐滴加入到丙酮中；所述水相优选为去离子水；所述透析优选在透析袋中进行，所述透析袋的截留分子量优选为30～40kDa，更优选为35kDa；优选采用水，更优选为去离子水进行透析。

在本发明中，所述组装的过程中优选还包括在有机相中加入免疫刺激剂，使纳米粒子担载免疫刺激剂，如在组装过程中的丙酮中加入免疫刺激剂；所述生物可降解聚合物和免疫刺激剂的质量比优选为(80～100)：(5～10)，更优选为90：(6～8)。

在本发明中，所述抗原蛋白的制备方法优选包括：

将胺反应改性剂和蛋白共孵育，得到抗原蛋白(功能化改性的抗原蛋白)。

在本发明中，所述胺反应改性剂和蛋白的摩尔比优选为(2～20)：1，更优选为(5～10)：1，最优选为5：1；所述蛋白的种类与上述技术方案所述抗原蛋白的种类一致，在此不再赘述。

在本发明中，优选将所述蛋白溶解于PB(磷酸盐水溶液)中，所述PB的pH值优选为8～8.5。

在本发明中，所述共孵育的温度优选为室温，更优选为20～30℃，更优选为25℃；所述共孵育的时间优选为0.8～1.2小时，更优选为1小时。

在本发明中，所述共孵育完成后优选还包括：

将得到的产物进行超滤脱盐后浓缩。

在本发明中，所述超滤脱盐优选采用超滤离心管，所述超滤离心管的截留分子量优选为8～12kDa，更优选为10kDa。

在本发明中，所述纳米粒子和抗原蛋白的质量比优选为(80～100mg)：(150～500μg)，更优选为90mg：(200～400μg)；将纯化后的疫苗溶液中抗原蛋白的总个数与纳米颗粒的总个数的比值定义为平均价数，所述仿病毒结构纳米颗粒疫苗的平均价数优选为300～500。

在本发明中，优选将抗原蛋白滴加到纳米粒子中，涡旋，孵育过夜，得到仿病毒结构纳米颗粒疫苗。

在本发明中，所述抗原蛋白优选为抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白溶液的浓度优选为0.5～2mg/ml，更优选为1～1.5mg/ml；所述纳米粒子优选为纳米粒子溶液，所述纳米粒子溶液的浓度优选为20～50mg/ml，更优选为30～40mg/ml；所述涡旋的时间优选为10～20s，更优选为15s；所述孵育的温度优选为2～6℃，更优选为4℃；所述孵育的时间优选为过夜，更优选为6～12h。

本发明提供了一种疫苗药物，包括：

上述技术方案所述的仿病毒结构纳米颗粒疫苗；

免疫佐剂。

在本发明中，所述免疫佐剂优选选自铝佐剂、寡核苷酸(CpG·ODN)、角鲨烯、皂苷中的至少一种。

本发明对所述免疫佐剂的用量没有特殊的要求，可以按照不同的免疫佐剂的说明书进行添加，如铝佐剂可按照每针疫苗中铝佐剂体积比占50％～25％添加的；其它佐剂可按照每针疫苗中佐剂含量为2～10μg添加的。

本发明提供的仿病毒结构纳米颗粒疫苗可以单独使用，也可以与免疫佐剂进行联合应用。

在本发明中，所述疫苗药物的制备方法优选包括：

将所述仿病毒结构纳米颗粒疫苗和免疫佐剂进行共混。

在本发明中，优选将所述免疫佐剂在涡旋中滴加到仿病毒结构纳米颗粒疫苗中；所述仿病毒结构纳米颗粒疫苗优选为仿病毒结构纳米颗粒疫苗溶液；所述仿病毒结构纳米颗粒疫苗溶液的蛋白浓度优选为0.1～0.5mg/ml。

本发明提供了一种预测抗原蛋白在具有粒径分布的球形纳米粒子表面的单层平均饱和键接个数的方法，使用了表面均匀分布条件下的斐波那契球体点阵模型公式，包括以下步骤：

使用动态光散射法测试纳米粒子的水合粒径R的数量分布柱状图；

对于粒径数量分布柱状图的每个粒径区间d

将特定抗原蛋白的水合直径d代入关系方程D

本发明提供了一种计算仿病毒结构纳米颗粒疫苗的抗原蛋白实际平均价数的方法，包括以下步骤：

仿病毒结构纳米颗粒疫苗初步孵育完毕后，使用100kda MWCO的超滤管对其进行超滤纯化以除去未反应的游离抗原蛋白，并将疫苗溶液定容至体积v；

使用BCA定量试剂盒测定稳定修饰在纳米颗粒上的抗原蛋白的质量m

使用NanoSight仪器测试疫苗溶液的纳米颗粒个数浓度C

使用公式II

本发明提供的仿病毒结构纳米颗粒疫苗的载体材料成本低，产量高，且组装得到的纳米颗粒载体结构稳定，有利于规模化生产；所采取的蛋白修饰方法效率高，能由此反应得到具有高表面抗原键接量的VLP疫苗。通过优选得到的VLP疫苗具有较强的淋巴结回流和滞留能力，能高效刺激淋巴结产生生发中心，并引发较高的特异性抗体滴度水平，经本发明VLP疫苗刺激产生的血清能实现较强的病毒中和能力。

本发明提供了一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗、其制备方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明涉及一种仿病毒结构纳米颗粒疫苗、其制备方法及应用，仿病毒结构纳米颗粒疫苗由生物可降解聚合物材料和抗原蛋白组成，先将聚合物材料组装成纳米载体，再将经胺反应性改性剂改性的抗原蛋白与纳米载体进行共孵育得到疫苗。本发明具体实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1丙交酯单体的重结晶

将15g D型丙交酯与15g L型丙交酯混合，加入30ml无水乙酸乙酯，升温至90℃，搅拌，使固体完全溶解。室温静置，重结晶，抽去上层溶剂，再重复重结晶步骤两次，最后抽干溶剂，得到无水外消旋丙交酯单体；

将30g D型丙交酯加入30ml无水乙酸乙酯中，升温至90℃，搅拌，使固体完全溶解。室温静置，重结晶，抽去上层溶剂，再重复重结晶步骤两次，最后抽干溶剂，得到无水D型丙交酯单体；

将30g L型丙交酯加入30ml无水乙酸乙酯中，升温至90℃，搅拌，使固体完全溶解。室温静置，重结晶，抽去上层溶剂，再重复重结晶步骤两次，最后抽干溶剂，得到无水L型丙交酯单体。

实施例2马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(MalPEG

将100mg Mal-PEG5k-OH与1.1g丙交酯单体(外消旋型/D型/L型)混合，依次加入1.5mg辛酸亚锡和3.5ml无水甲苯，搅拌，升温至110℃，继续反应24小时。

将反应结束的聚合物溶液使用10倍体积的无水乙醚进行沉降，抽滤得到聚合物固体，再使用二氯甲烷复溶，再重复沉降步骤两次，最后使用真空干燥器干燥过夜，得到MalPEG

使用核磁共振氢谱表征对实施例2制备的聚合产物进行分析，图1为得到的MalPEG

实施例3外消旋型聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米胶束的制备

将35mg外消旋型MalPEG

实施例4D/L型聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米胶束的制备

将35mg D/L型MalPEG

实施例5搭载R848的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物纳米胶束的制备

按照实施例3或实施例4的组装方法制备纳米胶束溶液，与实施例3或实施例4的区别在于，在丙酮相中加入3mg R848并充分溶解。

实施例6模型抗原OVA蛋白的改性及纯化

将180μg的模型抗原OVA蛋白(M＝44kDa)溶解于100μL PB(pH＝8.0～8.5)中，再加入2.7μg的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Traut’s Reagent,M＝137.63Da)，室温孵育1小时，再使用截留分子量为10kDa的超滤离心管对蛋白溶液进行超滤脱盐，最终浓缩定容至100μL，得到改性活化的模型抗原OVA蛋白溶液。

实施例7模型抗原BSA蛋白的改性及纯化

将180μg的模型抗原BSA蛋白(M＝66kDa)溶解于100μL PB(pH＝8.0～8.5)中，再加入1.8μg的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Traut’s Reagent,M＝137.63Da)，室温孵育1小时，再使用截留分子量为10kDa的超滤离心管对蛋白溶液进行超滤脱盐，最终浓缩定容至100μL，得到改性活化的模型抗原BSA蛋白溶液。

实施例8新冠病毒RBD抗原蛋白的改性及纯化

将180μg的新冠病毒RBD抗原蛋白(M＝25kDa)溶解于100μL PB(pH＝8.0～8.5)中，再加入5μg的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Traut’s Reagent,M＝137.63Da)，室温孵育1小时，再使用截留分子量为10kDa的超滤离心管对蛋白溶液进行超滤脱盐，最终浓缩定容至100μL，得到改性活化的新冠病毒RBD抗原蛋白溶液。

实施例9尼帕病毒粘附G蛋白的改性及活化

将180μg的尼帕病毒G蛋白(M＝60kDa)溶解于100μL PB(pH＝8.0～8.5)中，再加入2μg的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Traut’s Reagent,M＝137.63Da)，室温孵育1小时，再使用截留分子量为10kDa的超滤离心管对蛋白溶液进行超滤脱盐，最终浓缩定容至100μL，即得到改性活化的尼帕病毒G蛋白溶液。

实施例10三阴性乳腺癌细胞的TROP2膜表面蛋白的改性及活化

将180μg的TROP2蛋白(M＝40kDa)溶解于100μLPB(pH＝8.0～8.5)中，再加入3μg的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Traut’s Reagent,M＝137.63Da)，室温孵育1小时，再使用截留分子量为10kDa的超滤离心管对蛋白溶液进行超滤脱盐，最终浓缩定容至100μL，得到改性活化的三阴性乳腺癌细胞的TROP2膜表面蛋白溶液。

实施例11针对模型抗原OVA蛋白的纳米颗粒疫苗表面抗原饱和价数的计算

通过实施例3、4或5的方法测定所制备MalPEG

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表1

同理可以计算出模型抗原BSA蛋白的单层平均饱和键接个数约为340个；新冠病毒RBD蛋白的单层平均饱和键接个数约为980个；尼帕病毒粘附G蛋白的单层平均饱和键接个数约为390个；三阴性乳腺癌细胞的TROP2膜表面蛋白的单层平均饱和键接个数约为610个。

抗原蛋白在纳米颗粒表面的饱和价数与抗原蛋白自身尺寸、纳米颗粒数量粒径分布直接相关。

实施例12不同价数的仿病毒结构纳米颗粒疫苗的制备、纯化及表征

将实施例3、4或5制备的纳米颗粒溶液使用超滤浓缩的方法浓缩至35mg/ml。

将实施例6至10中任一制备的改性活化后的抗原蛋白溶液定容至100μL。

将16.7μL(30μg)的OVA蛋白溶液，在涡旋中分别滴加入2/1/0.5/0.25mL(70/35/17.5/8.75mg)纳米粒子溶液中，再继续涡旋15s，于4℃中孵育过夜，以制备设定平均价数为50/100/200/400价的OVA纳米颗粒疫苗。

使用100kDa的超滤管对孵育后的疫苗溶液进行超滤纯化，最终定容至100μL，使用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后各疫苗溶液的OVA蛋白浓度；使用NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪测定纯化后各疫苗溶液的纳米颗粒个数浓度；最后使用公式II计算各疫苗溶液的实际键接平均价数。

II

结果显示，各个价数疫苗的蛋白键接效率都在80％以上，说明本发明中的蛋白活化/键接方法的高效率。

再使用能量过滤低温透射电镜观察各个价数纳米颗粒疫苗的形态，如图4所示，可以明显看出纳米颗粒表面修饰的蛋白颗粒，且随着设定键接价数的提高，蛋白颗粒的数量也会增多，验证不同价数的OVA纳米颗粒疫苗的成功制备。

同理，可以制备出不同价数的模型抗原蛋白BSA纳米颗粒疫苗(设定价数为50/100/200/400，即将30μg的BSA蛋白溶液滴加入47/23.5/11.8/5.9mg纳米粒子溶液中)；不同价数的新冠病毒RBD蛋白纳米颗粒疫苗(设定价数为100/200/400/800，即将30μg的BSA蛋白溶液滴加入60/30/15/7.5mg纳米粒子溶液中)；不同价数的尼帕病毒G蛋白纳米颗粒疫苗(设定价数为50/100/200/400，即将30μg的G蛋白溶液滴加入50/25/12.5/6.3mg纳米粒子溶液中)。

实施例13不同价数的OVA/BSA纳米颗粒疫苗进行淋巴结回流实验并表征

使用经花青素荧光染料Cy5偶联标记的OVA/BSA蛋白，按实施例12所述制备不同价数的外消旋型OVA/BSA纳米颗粒疫苗溶液并纯化、定量，最终定容至蛋白浓度为100μg/mL。将150μL不同价数的OVA/BSA疫苗溶液(还包括一组游离的OVA/BSA-Cy5蛋白溶液)经尾根部皮下注射至C57BL/6小鼠中，在24h后将小鼠断颈处死，取出腹股沟淋巴结进行离体荧光成像，分析Cy5荧光强度。

如图5所示，与游离的抗原蛋白相比，纳米颗粒疫苗的淋巴结回流能力得到显著的提升；而不同价数的纳米颗粒疫苗回流效果也有差异，OVA和BSA纳米颗粒疫苗具有最佳回流效果的价数分别为200价和100价，这与不同抗原蛋白本身的尺寸差异有关，与公式III计算数据对照可推测，抗原蛋白在纳米颗粒疫苗表面的覆盖率在20％至25％间具有最佳的淋巴结回流效果，其中，r为抗原蛋白的流体动力学半径。

实施例14优选价数的OVA纳米颗粒疫苗进行不同时间点淋巴结滞留实验并表征

使用经花青素荧光染料Cy5偶联标记的OVA蛋白，按实施例12所述制备设定价数为200价的外消旋型OVA纳米颗粒疫苗溶液并纯化、定量，最终定容至蛋白浓度为100μg/mL。将150μL的疫苗溶液(还包括一组游离的OVA/BSA-Cy5蛋白溶液和一组与铝佐剂混合的OVA/BSA-Cy5蛋白溶液(疫苗溶液与铝佐剂体积比为3:1))经尾根部皮下注射至不同时间分组的C57BL/6小鼠中，分别在4h/2days/7days/14days处死不同分组的小鼠，取出淋巴结制备冷冻切片，并对切片进行免疫荧光染色(DAPI染细胞核，蓝色；Cy5-OVA，红色)，最后用激光共聚焦显微镜对切片进行成像分析。

如图6所示，游离的OVA蛋白在皮下注射4小时后能显著回流至淋巴结，但是到第二天就迅速消失了；与铝佐剂联合组也只能在淋巴结内滞留到第二天左右；而纳米颗粒疫苗在淋巴结中能保持滞留至14天，其中在第二天达到峰值。这说明，本发明制备优化价数后的纳米颗粒疫苗具有在淋巴结内长时间滞留、持续刺激的能力。

实施例15优选价数的OVA纳米颗粒疫苗进行不同时间点淋巴结生发中心激活实验并表征

按实施例12所述制备设定价数为200价的外消旋型OVA纳米颗粒疫苗溶液并纯化、定量，最终定容至蛋白浓度为100μg/mL。将150μL的疫苗溶液(还包括一组游离的OVA/BSA蛋白溶液和一组与铝佐剂混合的OVA/BSA蛋白溶液(疫苗溶液与铝佐剂体积比为3:1))经尾根部皮下注射至不同时间分组的C57BL/6小鼠中，分别在7days/14days处死不同分组的小鼠，取出淋巴结制备冷冻切片，并对切片进行免疫荧光染色(αB220-AF594，绿色；αGL7-AF488，红色)，最后用激光共聚焦显微镜对切片进行成像分析。

如图7所示，游离的抗原蛋白到第二周也只能激活微弱的生发中心；与铝佐剂联合组在第一周无法激活生发中心，到第二周能激活显著的生发中心；而纳米颗粒疫苗组在第一周就能激活生发中心，到第二周生发中心更显著，是铝佐剂组的1.5倍强度。说明本发明制备的优化价数后的纳米颗粒疫苗具有高效激活淋巴结内B细胞生发中心的能力，而这对于激活B细胞体液免疫至关重要。

实施例16不同价数的仿病毒结构纳米颗粒疫苗进行皮下刺激并表征特异性抗体滴度

按实施例12所述制备不同价数的OVA/BSA/RBD外消旋型纳米颗粒疫苗溶液并纯化、定量，最终定容至蛋白浓度为100/200/80μg/mL。将150μL的疫苗溶液(还包括一组游离的OVA/BSA/RBD蛋白溶液和一组与纳米颗粒物理混合的OVA/BSA蛋白溶液)经尾根部皮下注射至不同分组的C57BL/6小鼠中，并在第21天给予第二针刺激，在第10/20/30/40天对小鼠进行眶上静脉取血，离心收集血清样本。

使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中的特异特异性抗体滴度，主要步骤为：

在酶标板中铺100μL浓度为10μg/mL的OVA/BSA/RBD抗原蛋白溶液，过夜吸附。对血清先进行2

如图8所示，相比于游离抗原，纳米颗粒疫苗能显著提升特异性抗体滴度。而OVA与BSA纳米颗粒疫苗中，具有最高抗体滴度水平的疫苗对应价数分别是200价和100价，这与实施例13不同价数纳米颗粒疫苗的淋巴结回流效果规律是一致的，这说明抗体刺激效果与淋巴结回流效果的直接联系。而OVA与BSA纳米颗粒疫苗中的物理混合组表现出于游离抗原蛋白组相似的抗体滴度，说明物理混合吸附的方法效果较差，也进一步说明本发明制备的通过化学键接制备纳米颗粒疫苗的必要性。而RBD纳米颗粒疫苗中，具有最高抗体滴度水平的疫苗对应的价数是400价，与游离RBD蛋白相比特异性抗体滴度能提升25倍以上，说明本发明提供的纳米颗粒疫苗制备方法能制备具有高刺激活性的新冠病毒纳米颗粒疫苗。

实施例17优选价数的RBD纳米颗粒疫苗进行皮下刺激并表征特异性抗体滴度

使用实施例4制备的D/L型MalPEG

如图9所示，D型的RBD纳米颗粒疫苗表现出比外消旋型或L型疫苗更强的特异性抗体滴度刺激水平(总IgG特异性抗体滴度比外消旋型高约2倍)，而进一步测试IgG抗体亚型发现，D型的RBD纳米颗粒疫苗能激活更多比例的IgG2亚型抗体，对于提升抗体质量、降低疫苗副作用具有重要意义。这些结果说明本发明所制备的纳米颗粒疫苗能通过优化内核材料分子设计，进一步提升疫苗免疫刺激质量。

实施例18优选价数的且载体内搭载R848的RBD纳米颗粒疫苗进行皮下刺激并表征特异性抗体滴度

使用实施例5制备的搭载R848的外消旋型MalPEG

如图10所示，优选价数的纳米颗粒疫苗在使用搭载R848的纳米内核后，能引发比空载纳米颗粒疫苗高2～4倍的特异性抗体滴度；且其能激活更高比例的循环CD4 T细胞的活化(IFN-γ阳性)。说明本发明所制备的纳米颗粒疫苗同时具备内核可搭载免疫刺激剂以进一步提升疫苗活性的优势，具有极大的开发潜力。

实施例19优选价数的仿病毒结构纳米颗粒疫苗与铝佐剂联用后进行皮下刺激并表征特异性抗体滴度

按实施例12所述制备设定价数为400价的外消旋型新冠病毒RBD纳米颗粒疫苗溶液并纯化、定量，最终定容至蛋白浓度为110μg/mL。将铝佐剂在涡旋中滴加到游离抗原蛋白/纳米颗粒疫苗溶液中(铝佐剂与疫苗溶液体积比为1:3)，制备与铝佐剂联用的疫苗。将150μL的疫苗溶液经尾根部皮下注射至不同分组的C57BL/6小鼠中，并在第21天给予第二针刺激，在第10/20/30/40天对小鼠进行眶上静脉取血，离心收集血清样本，使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中的特异特异性抗体滴度。

如图11所示，优选价数的纳米颗粒疫苗即使不与铝佐剂联用，也能在第一针后就刺激产生显著的特异性抗体滴度，并在第二针后产生比与铝佐剂联用的RBD蛋白组高两倍的抗体滴度，说明本发明所制备的新冠病毒纳米颗粒疫苗比商业化常用的铝佐剂-蛋白亚单位疫苗效果更强；而纳米颗粒疫苗与铝佐剂联用后，能产生更显著的特异性抗体滴度水平，说明本发明所制备的纳米颗粒疫苗与铝佐剂搭配具有协同增效的效果；结果显示与铝佐剂联用后，蛋白低剂量的纳米颗粒疫苗也能产生比高剂量铝佐剂-蛋白亚单位组更高的抗体滴度水平，说明本发明所制备的纳米颗粒疫苗能显著提高抗原蛋白的利用率。

本发明提供的仿病毒结构纳米颗粒疫苗的载体材料成本低，产量高，且组装得到的纳米颗粒载体结构稳定，有利于规模化生产；所采取的蛋白修饰方法效率高，能由此反应得到具有高表面抗原键接量的VLP疫苗。通过优选得到的VLP疫苗具有较强的淋巴结回流和滞留能力，能高效刺激淋巴结产生生发中心，并引发较高的特异性抗体滴度水平，经本发明VLP疫苗刺激产生的血清能实现较强的病毒中和能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。