聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

光动力治疗是近年来新兴的肿瘤治疗方法。光敏剂是光动力治疗的关键要素，光敏剂吸收特定波长光照后在氧分子的参与下发生光敏氧化，产生单线态氧或活性氧，进而氧化破坏肿瘤细胞中的生物大分子，抑制肿瘤细胞增殖。

二氢卟吩e6是一种性能优越的光敏剂，具有高的单线态氧产生效率，被广泛开发用于光动力治疗。由于二氢卟吩e6具有疏水性，在溶液中容易聚集，在实际应用中面临困难。研究人员发展了多种纳米载药系统用于改善二氢卟吩e6的水溶性、提升光动力治疗效果，如脂质体、白蛋白纳米颗粒等。但是如何增强二氢卟吩e6的细胞摄取效率仍是目前所面临的技术难点。

鱼精蛋白是一种碱性蛋白，主要在鱼类(如蛙鱼、蹲鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在。鱼精蛋白为阳离子蛋白，对细胞膜具有较高的亲和性，因此可以将鱼精蛋白作为药物载体，用于提高药物的细胞摄取效率。但是鱼精蛋白难溶于有机溶剂，将鱼精蛋白与疏水性药物偶联面临技术挑战。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物，其具有比游离二氢卟吩e6更高的细胞摄取效率和更强的肿瘤细胞光动力杀伤作用。该偶联物由甲氧基聚乙二醇醛基和硫酸鱼精蛋白先通过席夫碱反应制备得到聚乙二醇化鱼精蛋白，然后再与二氢卟吩e6缩合制备得到。

本发明的另一目的是提供聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的制备方法，按照下述步骤进行：

(1)聚乙二醇化鱼精蛋白的制备

以甲氧基聚乙二醇醛基和硫酸鱼精蛋白为原料，在磷酸盐缓冲液(6.7mM,pH 7.4)中，氮气保护下室温搅拌反应24～48小时，然后于超纯水中透析3天，冷冻干燥得聚乙二醇化鱼精蛋白。

其中，甲氧基聚乙二醇醛基和硫酸鱼精蛋白摩尔比为1～1.2:1，甲氧基聚乙二醇醛基分子量为1000～20000。

(2)聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的制备

以聚乙二醇化鱼精蛋白和二氢卟吩e6为原料，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为缩合剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，在有机溶剂中、氮气保护条件下加热至50℃反应12～24小时，然后冷却至室温，加入至透析袋中，于超纯水中透析三天，冷冻干燥即可得到聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物。

其中，甲氧基聚乙二醇化鱼精蛋白、二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶摩尔比为1:1:4～8:0.5～1，有机溶剂为二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。

本发明的第三个目的是提供聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物在肿瘤光动力治疗方向的应用。

本发明的优点在于：

本发明首先将鱼精蛋白聚乙二醇化，提高了蛋白在有机溶剂中的溶解性，为偶联二氢卟吩e6提供了有利条件；

本发明提供的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物具有良好的水溶性和高于游离二氢卟吩e6的肿瘤细胞摄取量，对肿瘤细胞的光动力杀伤作用强于游离二氢卟吩e6。

附图说明：

图1为本发明实施例1制备的聚乙二醇化鱼精蛋白的核磁共振氢谱图。

图2为本发明实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的核磁共振氢谱图。

图3为本发明实施例1和实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白和聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1聚乙二醇化鱼精蛋白的制备

在50mL圆底烧瓶中加入30mL磷酸盐缓冲液(6.7mM，pH 7.4)，加入磁子搅拌，加入硫酸鱼精蛋白(500mg，0.1mmol)和甲氧基聚乙二醇醛基(分子量2000,200mg,0.1mmol)搅拌溶解，氮气保护下室温搅拌反应48小时，然后于超纯水中透析3天(截留分子量3500)，冷冻干燥得聚乙二醇化鱼精蛋白白色粉末状固体，产率89％。

通过核磁共振氢谱和红外光谱对所合成聚乙二醇化鱼精蛋白进行了表征。如图1所示，聚乙二醇化鱼精蛋白的核磁共振氢谱中同时出现了聚乙二醇(b)和鱼精蛋白(a)的特征峰，红外光谱(图3)同时出现了聚乙二醇的C-O-C伸缩振动峰(1113cm

实施例2聚乙二醇化鱼精蛋白的制备

在50mL圆底烧瓶中加入30mL磷酸盐缓冲液(6.7mM,pH 7.4)，加入磁子搅拌，加入硫酸鱼精蛋白(500mg，0.1mmol)和甲氧基聚乙二醇醛基(分子量5000,600mg,0.1mmol)搅拌溶解，氮气保护下室温搅拌反应24小时，然后于超纯水中透析3天(截留分子量3500)，冷冻干燥得聚乙二醇化鱼精蛋白白色粉末状固体，产率85％。

实施例3聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的制备

在50mL圆底烧瓶中加入5mL二甲基亚砜，加入实施例1制备的聚乙二醇化鱼精蛋白(70mg,0.01mmol)、二氢卟吩e6(6mg,0.01mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(15mg,0.08mmol)和4-二甲氨基吡啶(1mg,0.01mmol)，氮气保护下加热至50℃搅拌反应24小时，然后冷却至室温，加入至透析袋中，于超纯水中透析三天(截留分子量3500)，冷冻干燥得聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物墨绿色粉末状固体，产率92％。

通过核磁共振氢谱和红外光谱对所合成聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物进行了表征。如图2所示，聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的核磁共振氢谱中同时出现了聚乙二醇(b)、二氢卟吩e6(c)和鱼精蛋白(a)的特征峰，与聚乙二醇化鱼精蛋白相比，聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物红外光谱中在1567cm

通过紫外分光光度法测定二氢卟吩e6的载药量，载药量计算为二氢卟吩e6占聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的质量百分比，测得二氢卟吩e6载药量为7.3％。

实施例4：聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的制备

在50mL圆底烧瓶中加入5mL二甲基亚砜，加入实施例2制备的聚乙二醇化鱼精蛋白(100mg,0.01mmol)、二氢卟吩e6(6mg,0.01mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12mg,0.06mmol)和4-二甲氨基吡啶(1mg,0.01mmol)，氮气保护下加热至50℃搅拌反应18小时，然后冷却至室温，加入至透析袋中，于超纯水中透析三天(截留分子量3500)，冷冻干燥得聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物墨绿色粉末状固体，产率87％。通过紫外分光光度法测得二氢卟吩e6载药量为4.8％。

实施例5：体外光动力效应

试验溶液配制：分别配制1mM游离二氢卟吩e6的二甲基亚砜溶液和1mM实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物水溶液，配制100μg/mL1,3-二苯基异苯并呋喃的二甲基亚砜溶液，然后以上述配置的1mM化合物溶液和100μg/mL 1,3-二苯基异苯并呋喃二甲基亚砜溶液为母液，以水为稀释液，配置同时含有20μM化合物和20μg/mL 1,3-二苯基异苯并呋喃的试验液。

体外光动力效应评价：分别取上述配制的含有不同化合物的试验液200μL，加入96孔板，每个化合物试验液取12份，用50mW/cm

如表1所示，激光照射下，聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物和游离二氢卟吩e6试验液在405nm处的吸光度随着激光照射时间的增加而降低，表明聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物和游离二氢卟吩e6在激光照射下产生单线态氧量具有时间依赖性。聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物试验液在405nm处的吸光度降低的与游离二氢卟吩e6试验液相当，表明激光照射下，聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物具有与游离二氢卟吩e6类似的单线态氧产生效率。

表1、各化合物试验液在50mW/cm

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实施例6：肿瘤细胞摄取

试验溶液配制：以实施例5配制的1mM游离二氢卟吩e6的二甲基亚砜溶液和1mM实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物水溶液为母液，以1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素&链霉素)为稀释液，分别配制含有40μM各化合物的试验液。

细胞摄取评价：将4T1细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成上述配制的40μM各化合物试验液(n＝3)，，于细胞培养箱中37℃条件下培养4小时，然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4,6.7mM)洗涤细胞三次，加入胰酶消化细胞，然后离心分离细胞，计数，加入0.5mL1％曲拉通X-100溶液裂解细胞过夜，然后离心10分钟(10000转/分钟)，取200μL上清通过荧光分光光度法测量二氢卟吩e6的细胞摄取量。

如表2所示，在与4T1细胞孵育4小时，实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物的细胞摄取量高于游离二氢卟吩e6的细胞摄取量。

表2、孵育4小时4T1细胞摄取量

实施例7：光动力杀伤肿瘤细胞作用

试验溶液配制：以实施例5配制的1mM游离二氢卟吩e6的二甲基亚砜溶液和1mM实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物水溶液为母液，以1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素&链霉素)为稀释液，分别配制0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM和8μM各化合物的试验液。

配置5mg/mL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)磷酸盐缓冲液(pH 7.4，6.7mM)，过0.22μm滤膜，得MTT溶液。

光动力杀伤作用评价：将4T1细胞以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成上述配制的不同浓度各化合物试验液(n＝4)，于细胞培养箱中37℃条件下培养12小时，然后用50mW/cm

如表3所示，在不加激光照射条件下，实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物和游离二氢卟吩e6(0.25～8μM)处理后，4T1细胞的存活率均高于90％，表明实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物和游离二氢卟吩e6的生物相容性良好。

表3、各化合物在不加激光照射条件下的细胞存活率

如表4所示，在50mW/cm

表4、各化合物在50mW/cm

以上4T1细胞光动力杀伤作用评价结果表明，实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物具有比游离二氢卟吩e6更高的光动力杀伤作用。

实施例8：细胞活性氧水平测定

试验溶液配制：以实施例5配制的1mM游离二氢卟吩e6的二甲基亚砜溶液和1mM实施例3制备的聚乙二醇化鱼精蛋白-二氢卟吩e6偶联物水溶液为母液，以1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素&链霉素)为稀释液，分别配制含有20μM各化合物的试验液。

配置1mg/mL 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)的二甲基亚砜溶液，然后以无血清DMEM培养基为稀释液，配置10μg/mL DCFH-DA试验液。

4T1细胞活性氧水平测定：将4T1细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成上述配制的20μM各化合物试验液(n＝3)，于细胞培养箱中37℃条件下培养4小时，然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(pH7.4,6.7mM)洗涤细胞三次，加入10μg/mL DCFH-DA试验液，孵育20分钟，然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4,6.7mM)洗涤细胞三次，用50mW/cm

表5、在50mW/cm

如表5所示，在50mW/cm