羊肚菌源降血糖肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及羊肚菌源降血糖肽及其应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus)是一种因胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低引起的蛋白质、脂肪和电解质等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病已成为一个全球性的公共卫生问题。目前，临床使用的药物(如波糖、列醇和列汀类)能有效地控制糖尿病患者的血糖水平，但同时也会引起一系列副作用(如胃肠道疾病和腹泻等)，因此，寻找安全、毒副作用小的天然活性成分来防治糖尿病已成为近年来食品科学和医学领域的研究热点。

生物活性肽具有结构简单、安全性好、易吸收、无免疫反应性等优点，不仅具有良好的营养和功能特性，而且具有抗氧化、降血压、降血糖等多种健康益处，在功能性食品和医药领域均展现出良好的应用前景。目前，已从不同原料蛋白水解物中分离和制备了数百种降血糖肽，食源性降血糖肽被认为是防治糖尿病的一种更健康的潜在替代方案。

但是，目前还没有关于羊肚菌源降血糖肽的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供羊肚菌源降血糖肽及其应用，本发明的羊肚菌源降血糖肽具有良好的降血糖活性。

本发明提供了羊肚菌源降血糖肽，包括三肽和/或四肽；所述三肽的氨基酸序列为PTW，所述四肽的氨基酸序列为MPTW。

本发明还提供了上述方案所述羊肚菌源降血糖肽在制备降血糖的产品中的应用。

优选的，所述羊肚菌源降血糖肽能通过与蛋白酶类糖尿病防治靶点相结合发挥降血糖作用。

优选的，所述蛋白酶类糖尿病防治靶点包括二肽基肽酶IV、蛋白酪氨酸磷酸酶1B和α-淀粉酶中的一种或几种。

本发明还提供了一种降血糖的产品，所述产品包括上述方案所述的羊肚菌源降血糖肽。

优选的，所述产品包括食品、保健品或者药品。

优选的，所述药品的剂型包括口服制剂。

本发明还提供了上述方案所述的羊肚菌源降血糖肽在制备酶抑制剂中的应用；所述酶包括二肽基肽酶IV、蛋白酪氨酸磷酸酶1B和α-淀粉酶中的一种或几种。

本发明提供了羊肚菌源降血糖肽，包括三肽和/或四肽；所述三肽的氨基酸序列为PTW，所述四肽的氨基酸序列为MPTW。本发明的羊肚菌源降血糖肽分子量均小于1000、疏水性强，含有Pro和Trp。分子对接结果表明：PTW和/或MPTW能与蛋白酶类糖尿病防治靶点二肽基肽酶IV(DPP-4)、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)和α-淀粉酶活性中心的关键氨基酸残基以氢键和疏水作用相结合发挥降血糖作用。PTW对DPP4、PTP1B和α-淀粉酶抑制作用的IC50分别为16.08±1.11mM、5.89±0.21mM和18.75±0.43mM；MPTW对DPP4、PTP1B和α-淀粉酶抑制作用的IC50分别为6.34±0.03mM、3.06±0.12mM和14.59±0.17mM。本发明的降血糖肽属于天然产物，无溶血性和致敏性，有较好的药代动力学特性。本发明对食源降血糖肽的开发具有一定指导意义。

附图说明

图1为PTW的质谱图；

图2为MPTW的质谱图；

图3为MPTW和DPP-4相互作用的2D图；

图4为MPTW和PTP1B相互作用的2D图；

图5为MPTW和α-淀粉酶相互作用的2D图；

图6为MPTW和DPP-4相互作用的3D图；

图7为MPTW和PTP1B相互作用的3D图；

图8为MPTW和α-淀粉酶相互作用的3D图；

图9为PTW和DPP-4相互作用的2D图；

图10为PTW和PTP1B相互作用的2D图；

图11为PTW和α-淀粉酶相互作用的2D图；

图12为PTW和DPP-4相互作用的3D图；

图13为PTW和PTP1B相互作用的3D图；

图14为PTW和α-淀粉酶相互作用的3D图；

图6～图8和图12～图14中的酶受体用彩虹色的cartoon形式表示，肽配体用黄色的surface形式表示；图3～图5以及图9～图11中绿色的虚线代表氢键，

具体实施方式

本发明提供了羊肚菌源降血糖肽，包括三肽和/或四肽；所述三肽的氨基酸序列为PTW，所述四肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为MPTW。

在本发明中，PTW和MPTW的分子量均小于1000，溶解性较差，疏水性较强，净电荷为零，等电点偏酸；均无溶血性和致敏性，基本无聚集性和免疫原性。此外，降血糖肽PTW和MPTW具有不同的口服生物利用度，均易被肠道吸收，均能不同程度地透过Caco-2细胞和血脑屏障；对细胞色素P450诱导率均小于0.10，抑制率均小于0.40，且均具有较低的人体清除率，提示其有较强的代谢稳定性；2种肽基本无Ames毒性和Hek293细胞毒性。PTW和MPTW具有良好的药代动力学特性。

在本发明中，PTW和MPTW优选的由固相合成得到。在本发明具体实施过程中，PTW和MPTW由上海Synpeptide生物科技公司进行固相合成得到。

本发明还提供了上述方案所述羊肚菌源降血糖肽在制备降血糖的产品中的应用。

在本发明中，所述羊肚菌源降血糖肽能通过与蛋白酶类糖尿病防治靶点相结合发挥降血糖作用。

在本发明中，所述蛋白酶类糖尿病防治靶点优选的包括DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶中的一种或几种。

本发明还提供了一种降血糖的产品，所述产品包括上述方案所述的羊肚菌源降血糖肽。

在本发明中，所述产品优选的包括食品、保健品或者药品。

在本发明中，所述药品的剂型优选的包括口服制剂。

本发明还提供了上述方案所述的羊肚菌源降血糖肽在制备酶抑制剂中的应用；所述酶包括DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶中的一种或几种。

在本发明中，MPTW与DPP-4的Glu205、His740和Arg125以氢键结合，与Asn545、Asn562、Tyr(48,547,631,662,752)、Trp(563,627,629)及Ser630以疏水作用相结合；与PTP1B的Glu200以氢键结合，与Leu192、Asn193、Phe(196,280)、Lys197、Arg199、Gly277和Glu276以疏水作用结合；与α-淀粉酶的Thr163、Asp197以氢键结合，与Trp(58,59)、Tyr62、Gln63、Arg195、Glu233、Phe256、Asn298、His(299,305)和Asp(300,356)以疏水作用相结合。

PTW与DPP-4的Arg125、Glu206和Tyr662以氢键结合，与Glu205、Tyr(547,631,666)、Trp(629,659)、Val(656,711)及Ser630以疏水作用相结合；与PTP1B的Glu115、Trp179、Arg221和Gln262以氢键结合，与Tyr46、Lys120、Gly183、Val184、Ala217、Thr263、Asp265和Gln266以疏水作用结合；与α-淀粉酶的Tyr62和Asp300以氢键结合，与Trp(58,59)、Gln63、Thr163、Leu165、Arg195、Asp197、Glu233、His(101,299,305)和Asp356以疏水作用相结合。

在本发明中，PTW对DPP4、PTP1B和α-淀粉酶抑制作用的IC50分别为16.08±1.11mM、5.89±0.21mM和18.75±0.43mM；MPTW对DPP4、PTP1B和α-淀粉酶抑制作用的IC50分别为6.34±0.03mM、3.06±0.12mM和14.59±0.17mM。PTW和MPTW对DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶均具有良好的抑制作用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1本发明的羊肚菌源降血糖肽筛选过程及其理化性质

从UniProt KB蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)中下载到154种羊肚菌主要结构蛋白序列。利用BIOPEPUWM数据库中CALCULATIONS模块(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/)对这些白序列进行优选。具体为：将下载的154种羊肚菌蛋白质序列分别粘入BIOPEPUWM数据库的CALCULATIONS模块，并进行分析运算，综合ΣA值(降血糖肽的出现频率；设定占比70％)及ΣB值(潜在的降血糖活性；设定占比30％)，初步筛选得到得分较高的20种羊肚菌蛋白作为实验研究材料。

通过BIOPEPUWM数据库中“ENZYME(S)ACTION”模块，对初步筛选的20种羊肚菌蛋白进行虚拟酶解。综合ΣAE值(降血糖肽释放频率；占比50％)及ΣW值(降血糖肽相对释放频率；占比50％)，优选出得分最高的40S ribosomal protein S9蛋白，作为制备羊肚菌源降血糖肽的原料蛋白(表1)。

表1羊肚菌蛋白的优选及虚拟酶解结果

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使用PeptideRanker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)评价所得肽段具有生物活性的潜力。将PeptideRanker得分大于0.5的肽段用iDPPIV-SC M(http://camt.pythonanywhere.com/iDPPIV-SCM)进行第二轮筛选；结合新颖性检测，筛选到iDPPIV-SCM得分较高且未被报道的2种羊肚菌源降血糖肽PTW和MPTW(表2)。PTW和MPTW对应的质谱图分别如图1和图2所示。

表2虚拟筛选得到的2种羊肚菌源降血糖肽

利用Innovagen(http://www.innovagen.com)预测降血糖肽的分子量、等电点以及在溶解性；Pepdraw(http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw/)预测净电荷和疏水性；Allergylab(https://sortaller.gzhmu.edu.cn/)预测致敏性；HemoPI(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/hemopi/design.php)预测溶血性；ChemAGG(https://admet.scbdd.com/ChemAGG/index/)预测聚集性；IEDB(http://tools.iedb.org/immunogenicity/)预测免疫原性。本发明的2种羊肚菌源降血糖肽的理化性质预测结果见表3。

表3羊肚菌源降血糖肽的理化性质

由表3可以看出，本发明的羊肚菌源降血糖肽PTW和MPTW的分子量均小于1000，溶解性较差，疏水性较强，净电荷为零，等电点偏酸；均无溶血性和致敏性，基本无聚集性和免疫原性，本发明的羊肚菌源降血糖肽具有良好的理化性质和安全性。

实施例2羊肚菌源降血糖肽的药代动力学

本发明的降血糖肽的药代动力学性质通过iDrug(https://drug.ai.tencent.com/console/cn/admet)工具进行预测，结果如表4所示。可以看出，降血糖肽PTW和MPTW具有不同的口服生物利用度，均易被肠道吸收，均能不同程度地透过Caco-2细胞和血脑屏障；对细胞色素P450诱导率均小于0.10，抑制率均小于0.40，且均具有较低的人体清除率，提示其有较强的代谢稳定性；2种肽基本无Ames毒性和Hek293细胞毒性。综上，本发明的羊肚菌源降血糖肽具有良好的药代动力学特性。

表4降血糖肽的药代动力学性质预测结果

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注：溶解度系数是该物质的热力学水溶性值，用Log(S,mol/L)表示；Caco-2细胞透过性是CACO-2渗透率值(10

实施例3羊肚菌源降血糖肽的分子对接

分子对接是研究多肽与靶蛋白受体相互作用的有力手段。使用HPEPDOCK工具(http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)以降血糖肽为配体，与可能的蛋白酶类糖尿病防治靶点(DPP-4、PTP1B及α-淀粉酶)进行对接研究，对接得分如表5所示。由表5可知，MPTW与3种酶受体的对接得分最高，PTW也有相对较高的对接得分。

表5羊肚菌源降血糖肽与DPP4、PTP1B和α-淀粉酶的分子对接结果

MPTW与3种酶受体的分子对接结果参见图3～图8，其中图3、4、5分别显示MPTW与DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶对接的2D相互作用图，图6、7、8分别为MPTW与DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶对接的3D相互作用图，图3～图8表明，MPTW与DPP-4的Glu205、His740和Arg125以氢键结合，与Asn545、Asn562、Tyr(48,547,631,662,752)、Trp(563,627,629)及Ser630以疏水作用相结合；与PTP1B的Glu200以氢键结合，与Leu192、Asn193、Phe(196,280)、Lys197、Arg199、Gly277和Glu276以疏水作用结合；与α-淀粉酶的Thr163、Asp197以氢键结合，与Trp(58,59)、Tyr62、Gln63、Arg195、Glu233、Phe256、Asn298、His(299,305)和Asp(300,356)以疏水作用相结合。

PTW与3种酶受体的分子对接结果参见图9～图14，其中图9、10、11分别为PTW与DPP-4PTP1B和α-淀粉酶对接的2D相互作用图，图12、13、14分别为PTW与DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶对接的3D相互作用图，图9～图14表明，PTW与DPP-4的Arg125、Glu206和Tyr662以氢键结合，与Glu205、Tyr(547,631,666)、Trp(629,659)、Val(656,711)及Ser630以疏水作用相结合；与PTP1B的Glu115、Trp179、Arg221和Gln262以氢键结合，与Tyr46、Lys120、Gly183、Val184、Ala217、Thr263、Asp265和Gln266以疏水作用结合；与α-淀粉酶的Tyr62和Asp300以氢键结合，与Trp(58,59)、Gln63、Thr163、Leu165、Arg195、Asp197、Glu233、His(101,299,305)和Asp356以疏水作用相结合。

本发明羊肚菌源降血糖肽能够与DPP-4的Glu(205,206)、Tyr(547,631,662,666)、Ser630、Val656、Trp659、Val711和His740相结合，而这些均是该酶活性口袋中的关键氨基酸残基

实施例4羊肚菌源降血糖肽的降血糖活性

采用体外化学实验模型法

表6 PTW和MPTW对DPP-4、PTP1B和α-淀粉酶抑制作用的IC50值

注：羊肚菌源降血糖肽的IC50单位为mM，阳性对照维格列汀的IC50单位为nM，正钒酸钠和阿卡波糖的IC50单位为μM。

参考文献：

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尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。