一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法

技术领域

本发明属于生物催化合成技术领域，尤其涉及一种双酶系统催化合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物的方法。

背景技术

杂环化合物，特别是苯并噁唑类衍生物是荧光探针、耐热聚合物、生物活性天然产物和药物化合物的重要骨架。此外，苯并噁唑类化合物也被用作抗生素、抗抑郁剂、抗惊厥剂、抗癌剂、HIV逆转录酶抑制剂和抗糖尿病剂。由于这些特殊的性质，苯并噁唑类化合物的进一步功能化，如引入烷基或芳基，可能有利于其未来的制药应用。事实上，一些获得专利的生物活性苯并噁唑类衍生物，如salvianen,boxazomycins A和氟诺沙洛芬，都含有一个2-烷基和芳基苯并噁唑的部分作为关键功能

目前，有多种2-烷基和芳基苯并噁唑化合物的合成途径，其中传统方法合成2-烷基和芳基苯并噁唑的一般是采用2-氨基酚与醛/酮衍生物缩合，然后在苛刻条件下氧化环化。2019年，我们公开了首个血红蛋白催化酚亚胺氧化环化制备2-芳基和2-烷基苯并噁唑的例子，以叔丁基过氧化氢为氧化剂，乙酸为添加剂，乙酸乙酯为溶剂。在过去的几年里，有氧氧化反应已经成为获得相应苯并噁唑衍生物的一种新型的途径。到目前为止，许多过渡金属如Cu/Fe/Co/Mn和电催化已用于此目的。尽管取得了上述进展，开发一种无有害氧化剂，无有机溶剂且温和绿色催化合成2-烷基和芳基苯并噁唑的策略仍未实现且亟待解决。

酶催化由于其特殊的功能、适应性和可持续性而引起了相当大的兴趣。在工业生产中，多酶催化在许多有价值的材料/化学品的生产中扮演着重要的角色，因为它们促进了串联或级联反应。因此，多酶级联反应被认为是建立环境良性和可持续的化学过程的重要策略。虽然利用多酶级联反应制备新型化合物和天然产物已有许多尝试。但是，不管是化学催化还是生物催化，都依然存在技术瓶颈，且目前不管是酶的种类数量还是催化性能都不能满足目前2-烷基和芳基苯并噁唑绿色经济且高效的制备需求。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种尿素酶/人工金属酶(Co-VHb-Q53H/P54C)催化2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物的方法，旨在解决在2-取代苯并噁唑的构建中，不管是化学催化还是生物催化，都依然存在技术瓶颈，且目前不管是酶的种类数量还是催化性能都不能满足目前该类化合物绿色环保且高效的制备需求的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种双酶催化非天然氨基酸衍生物的方法，包括以下步骤：

步骤1：通过第53位、第54位定点突变技术改造VHb的基因，提升其催化性能；

步骤2：通过E.coli RP523菌株生物表达的方法，将VHb中原始血红素辅基替换为其他金属卟啉，进一步提升催化活力；

步骤3：将构建的卟啉替换VHb人工金属酶-尿素酶催化系统应用于催化级联反应合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物。

进一步的技术方案，在步骤1中，所述第53位及第54位定点突变以构建在PUC19质粒上的VHb基因为模板，原始VHb序列如SEQ ID NO.1所示，设计引物将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第53位谷氨酰胺突变为组氨酸，得到第53位单突变体，命名为VHb-Q53H；设计引物将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第54位脯氨酸突变为半胱氨酸，得到第54位单突变体，命名为VHb-P54C；设计引物将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第53位谷氨酰胺突变为组氨酸，第54位脯氨酸突变为半胱氨酸，得到双突变体，命名为VHb-Q53H/P54C。

进一步的技术方案，在步骤1中，构建一种E.coli BL21(DE3)基因工程菌，基因工程菌含有上述突变前后的表达载体。

进一步的技术方案，在步骤2中，所述E.coli RP523菌株生物表达卟啉替换的方法，通过基因工程菌的构建，能够表达上述突变前后表达载体；通过添加外源金属卟啉Co(ppIX)和Mn(ppIX)，对应表达出几种含有Co(ppIX)和Mn(ppIX)辅基的VHb人工金属酶，命名为Co-VHb-WT，Co-VHb-Q53H，Co-VHb-P54C，Co-VHb-Q53H/P54C，Mn-VHb-WT，Mn-VHb-Q53H，Mn-VHb-P54C，Mn-VHb-Q53H/P54C。

进一步的技术方案，步骤3中的催化级联反应合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑的方程式如下所示：

其中，R1，R2表示叔丁基；R3表示正丙基，异丙基，环己基，乙基，呋喃基，吡啶基，苯基，4-甲基苯基，4-甲氧基苯基，4-氯苯基，4-溴苯基，4-氰基苯基，3-甲基苯基，2-甲基苯基，2-氟苯基。

进一步的技术方案，反应的底物为邻苯二酚类化合物、醛类化合物以及尿素的混合物，其中，所述底物的浓度范围为0.1mmol-1mmol；邻苯二酚类化合物、醛类化合物、尿素的摩尔比为1：1：0.5～1：1：1，最优选为1：1：0.6。

进一步的技术方案，反应体系中尿素酶的加入量为200-400U，最优选为300U。所述人工金属酶加入量为0.01-0.1mol％，最佳用量为0.05mol％。所述双酶与底物一同加入至加有10％的促溶剂的水中，暴露于空气下在25℃-50℃反应2h-24h。

进一步的技术方案，反应的溶剂最优为加有10％二甲基亚砜作为促溶剂的水溶液。

进一步的技术方案，最优温度为25℃。

进一步的技术方案，反应时间为12小时。

本发明实施例提供的一种双酶催化合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物的方法，通过定点突变和卟啉替换技术，对于野生型的透明颤菌血红蛋白分子进行改造，获得了新型的人工金属酶ArVHbM，再让其与尿素酶构建成双酶系统通过串联反应将简单小分子原料一锅法绿色高效合成2-烷基/芳基取代苯并噁唑衍生物类化合物。同时，该发明中的生物催化系统相比于传统化学合成方法更加高效绿色。在水相中，较低的催化剂用量以及廉价易得的底物即可获得令人满意的收率，弥补了传统化学法的缺陷，同时使用空气作为氧化剂，更加经济且无任何的毒副作用，并且为蛋白在催化非天然反应的应用中开阔了新的应用前景。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1野生型VHb基因的构建

设计VHb的上下游引物，以野生型VHb(SEQ ID NO.1)为模板用PCR技术来扩增获得目的基因。

上游引物VHb-F：

CCCAAGCTTACAGGACGCTGGGGAAAGT

下游引物VHb-R：

CCGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGTTCAACCGCTTGAGCGTACAAATCT

PCR反应体系如下：

反应条件：95℃2min→(95℃15s→65℃15s→72℃90s)×30→72℃10min,；

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外检测仪下，切下目的条带按照胶回收试剂盒的操作说明回收目的片段。

建立双酶切体系

用限制性内切酶Hind III、EcoR I分别对载体PUC19质粒和VHb目的片段进行双酶切。质粒和VHb目的片段酶切体系分别如下：

/>

37℃酶切2h后通过琼脂糖凝胶电泳确认酶切产物大小，电泳完后在紫外检测仪下，分别切下目的条带，然后按照胶回收试剂盒的操作说明回收目的片段。

建立连接体系

将用相同限制性内切酶处理过的VHb、PUC19质粒进行连接反应，构建重组质粒VHb。连接体系如下：

16℃连接30min。

采用热激法将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，测序正确的单菌落，即为构建成功的PUC19-VHb。

实施例2 53位、54位、双位点组合定点突变的构建

设计53位、54位、双位点组合定点突变引物，利用PCR技术对野生型VHb的基因(基因序列如SEQ ID NO.1所示)进行定点突变。

以连接有VHb基因的重组质粒PUC19-VHb为模板，设计一对包含突变位点的互补正反向引物，进行PCR，得到突变质粒。

突变引物如下：

53位点上游引物

53-F：CCAAGAATCTTTGGAGCACCCTAAGGCTTTGGCGA

53位点下游引物

53-R：TCGCCAAAGCCTTAGGGTGCTCCAAAGATTCTTGG

54位点上游引物

54-F：AGAATCTTTGGAGCAGTGTAAGGCTTTGGCGATGA

54位点下游引物

54-R：TCATCGCCAAAGCCTTACAGTCCTCCAAAGATTCTTGG

双位点上游引物

53/54-F：CCAAGAATCTTTGGAGCACTGTAAGGCTTTGGCGA

双位点下游引物

53/54-R：TCGCCAAAGCCTTACAGTGCTCCAAAGATTCTTGG

PCR的反应体系如下：

PCR程序：

95℃2min→(95℃15s→55℃15s→72℃2min)×30→72℃10min。

PCR后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，电泳后在紫外检测器下确认目的条带无误。

将PCR扩增产物进行Dpn I酶消化，去除甲基化的模板DNA，体系如下：

37℃孵育2h。

用热激法将消化后的产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑单菌落测序，测序与预期相符即为构建成功的突变子。

实施例3RP523菌株卟啉替换方法

RP523卟啉合成缺陷菌在厌氧环境下，用TB培养基(每1L去离子水中添加11.8g酪蛋白水解物、23.6g酵母提取物、9.4g磷酸氢二钾、2.2g磷酸二氢钾、4ml甘油和0.2％w/v葡萄糖)复苏活化，CaCl

将Co(ppIX)或Mn(ppIX)溶解在二甲基亚砜(10mM)中。使用100mM NaOH和200mMNa

用上述载体质粒转化RP523感受态细胞。在厌氧条件下，使用含有氨苄西林(100μg/mL)抗生素的TB平板(每1L TB培养基添加15g琼脂)选择阳性转化子。从琼脂平板上挑取菌落并在含有氨苄西林TB培养基(14mL)的玻璃厌氧瓶中培养(37℃,180rpm)。培养物用氮气脱气15分钟以除去氧气，然后在37℃下培养12小时。

厌氧生长后，使用起始培养物接种1L含有氨苄西林的TB培养基。培养物用氮气脱气15分钟，然后在37℃下摇动培养(180rpm)。之后，向培养物中添加Co(ppIX)或Mn(ppIX)溶液，在厌氧环境中由其厌氧启动子诱导表达，25℃，110rpm培养30小时。

细胞培养物在5000rpm下离心收集，将菌体沉淀用50mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬，在冰上超声处理30分钟后，细胞裂解物以12000rpm在4℃下离心30分钟，去除细胞碎片，得粗酶液。

粗酶液的纯化采用Ni柱亲和层析。将粗酶液经0.22μm滤膜过滤。Ni柱首先用10mMPBS缓冲液进行平衡，平衡后开始上样，上样后用上样缓冲液(10mM PBS缓冲液，20mM咪唑)进行平衡，再用洗脱液(10mM PBS缓冲液，200mM咪唑)进行洗脱，收集有颜色的蛋白，即金属卟啉重组蛋白。收集的金属卟啉重组蛋白进行G-25脱盐柱脱盐，用NANO-Drop及SDS-PAGE检测目的蛋白，储存于4℃冰箱中备用。

实施例4纯蛋白的制备级反应

核磁数据多重性定义如下:s(单峰)；d(二重峰)；t(三重峰)；q(四重峰)；m(多重峰)；偶合常数J(赫兹)。

在2ml的溶剂(H

实施例5 2-苯基取代苯并噁唑的底物适用性扩展

按照实施例6的方法和步骤，在改变2的结构,保证1，3结构不变的情况下，可以合成出不同的2-苯基取代的苯并噁唑类化合物4。

在2ml的溶剂(H

4b:5,7-di-tert-butyl-2-(p-tolyl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体，产率为95％.

4c:5,7-di-tert-butyl-2-(4-methoxyphenyl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体，产率为92％.

4d:5,7-di-tert-butyl-2-(4-chlorophenyl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为89％.

4e:2-(4-bromophenyl)-5,7-di-tert-butylbenzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为87％.

4f:4-(5,7-di-tert-butylbenzo[d]oxazol-2-yl)benzonitrile,黄色油状液体，产率为82％.

4g:5,7-di-tert-butyl-2-(m-tolyl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为96％.

4h:5,7-di-tert-butyl-2-(o-tolyl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体，产率为94％.

4i：5,7-di-tert-butyl-2-(2-fluorophenyl)benzo[d]oxazole，黄色油状液体，产率为83％.

实施例6 2-芳基/烷基取代苯并噁唑的底物适用性扩展

按照实施例6的方法和步骤，在改变2的结构,保证1，3结构不变的情况下，可以合成出不同的2-芳基/烷基取代的苯并噁唑类化合物4。

在2ml的溶剂(H

4j:5,7-di-tert-butyl-2-(furan-2-yl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体，产率为91％.

4k:5,7-di-tert-butyl-2-(pyridin-2-yl)benzo[d]oxazole,黄色油状液体，产率为94％.

4l:5,7-di-tert-butyl-2-ethylbenzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为90％.

4m:5,7-di-tert-butyl-2-propylbenzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为93％.

4n:5,7-di-tert-butyl-2-isopropylbenzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为91％.

4o:5,7-di-tert-butyl-2-cyclohexylbenzo[d]oxazole,黄色油状液体,产率为88％.

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种双酶系统催化2-烷基、芳基苯并噁唑衍生物的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 458

<212> DNA

<213> Vitreoscilla

<400> 1

atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240

attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat gtcggtcaag 300

aattgttggg tgcgattaaa gaagtattgg gcgatgccgc aaccgatgac attttggacg 360

cgtggggcaa ggcttatggc gtgattgcag atgtgtttat tcaagtggaa gcagatttgt 420

acgctcaagc ggttgaacat catcatcatc atcattaa 458

<210> 2

<211> 3

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

<210> 3

<211> 3

<212> DNA

<213> Vitreoscilla beggiatoides

<400> 3