一种皂素的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种皂素的制备方法。

背景技术

薯蓣皂素，被称为“药用黄金”，其作为甾体类药物的前体，可通过多种修饰方法，使其成为新型的甾体药物。现阶段皂素生产还都采用酸水解的工艺，这种工艺存在污染大、生态破坏严重等问题。因此，找到一种绿色、高效的薯蓣皂素生产方法来代替传统酸解法对于皂素生产具有重要意义。

鉴于酸水解法对环境的污染较严重，研究者们对薯蓣皂苷元提取过程进行了大量研究和改进，先后发展出了微生物发酵提取法、加压双相酸水解法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法、超声辅助提取法等。而上述方法都是在直接酸解法的基础上，进一步优化淀粉、纤维素的去除，或者是细胞壁的破碎。仍没有解决强酸水解的步骤，依然会造成环境的污染。

近年来，有学者提出了生物转化的方法生产皂素，生物转化包括两部分，一个是微生物转化法，另一个是酶转化法。即利用微生物，或生物酶等，对植物中的皂苷进行一系列的作用或修饰，将其转化为皂素的过程。这种方法对环境友好，无污染，条件温和且工艺简单。但是在菌株发酵的转化过程中，可能为多种酶的相互作用，反应过程复杂。同时，从酶转化法的角度切入，存在酶的纯化难度大，作用方式不明确等问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在开发一种反应过程简单，对环境友好，无污染，高效、低成本的皂素生产方法。

为达到这一目的，本发明人筛选出一株具有自主知识产权的盾叶薯蓣内生黄曲霉菌SY

基于上述研究，本发明进一步优化了利用SY

PDA培养基成分为：马铃薯100～300g/L、葡萄糖10～30g/L，琼脂粉10-30g/L，溶剂为蒸馏水。

种子培养基的组成成分为：蔗糖4.48g/L、牛肉膏1.04g/L、薯蓣根茎粉末7.06g/L、K

发酵培养基的组成成分为：酵母浸粉14.24g/L、蔗糖18.81g/L、生黄豆粉9.27g/L、MgSO4 1.0g/L、K

S1.菌种活化培养

采用菌饼法活化菌种，即用打孔器在制备好的PDA平板中心位置打孔后，挑取保藏菌落中长势均匀的平板也进行打孔后，将菌块倒置于另一PDA平板中。使用无菌保鲜膜对接好菌的平板进行封口后，将其倒置于33℃的恒温培养箱中进行活化培养。

S2.种子液培养

按照种子培养基的配方，配制好种子液，调节pH至6.0～7.0后，将其分装到250mL的锥形瓶中，每瓶装100mL培养基。先使用无菌水冲洗活化好的SY

S3.摇瓶发酵培养

按照发酵培养基的配方，配制好发酵液，调节pH至6.0～7.0后，将其分装到250mL的锥形瓶中，每瓶装100mL培养基。取培养24h的种子液，以3～5％的接种量，使用移液枪在无菌操作台中将种子液接入发酵培养基中。将发酵液放置于33℃，120rmp/min的恒温摇床里振荡培养5d后，得到SY

S4.皂素提取分离

取上述SY

S5.薯蓣皂素浓度测定

将薯蓣皂素粗品制成样品后，将样品注入色谱仪中后，机器开始运行得到色谱图，每个样品重复三次。对照标准曲线，计算得到皂素含量。

本发明在氮源的添加过程中发现氮源种类的不同，对菌种发酵后的皂素产量有不同的影响。在对添加的氮源对比筛选后发现，酵母浸粉和生黄豆粉的效果最好，其添加后的皂素产量分别为12.38mg/L和14.40mg/L。根据传统的氮源分类，酵母浸粉为速效氮源，有利于菌体的生长，生黄豆粉为迟效氮源，有利于代谢产物的生成且营养价值高。基于本发明的目的是提高皂素的产量，因此在发酵培养基的制备中选择了这两种氮源相结合的方式，共同为菌体生长提供作用，加速皂素的合成。

进一步地，本发明在培养基中所用诱导物为薯蓣根茎粉末，粉末中除含有薯蓣皂苷外，还有大量的纤维素和淀粉。基于此，根茎粉末一方面可以作为菌种的碳源使用，另一方面为菌种的发酵提供前体物质，第三方面该粉末可诱导菌株发酵产生酵素。本发明通过筛选最适的粉末添加量，提高单位发酵液体积的皂素产量，进而解决了发酵过程中耗水量大的问题，此外，还减少了有机溶剂的使用量。

通过上述技术方案，结合实施例本发明所提供的SY

1)本发明所提供的皂素的生产方法去掉了强酸水解的步骤，大大减少了对环境的污染，制备过程绿色，无污染。

2)本发明所提供的生产方法在内生菌SY

3)本发明对SY

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

图1是本发明皂素产量试验值和预测值的线性关系。

图2是本发明响应面图和等高线图，其中(a)为蔗糖浓度和酵母浸粉浓度的等高线图；(b)为蔗糖浓度和酵母浸粉浓度的响应面图；(c)为蔗糖浓度和生黄豆粉浓度的等高线图；(d)为蔗糖浓度和生黄豆粉浓度的响应面图；(e)为酵母浸粉浓度和生黄豆粉浓度的等高线图；(f)为酵母浸粉浓度和生黄豆粉浓度的响应面图。

图3是本发明不同样品的薄层色谱图，其中0为薯蓣皂素标准品；1为原始样品；2为优化后的样品。

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。

实施例1

本实施例对SY

1.Plackett-Burman设计

本试验采用单因素试验法，对影响菌株发酵过程的9个因素(碳源种类、氮源种类、诱导物浓度、无机盐倍数、表面活性剂种类、种子液接种量、发酵时间、发酵温度、初始pH)进行了初步优化，确定好各个因素的最佳水平，优化因素如表1所示。

表1，单因素试验设计表

本试验比较分析了可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖和糊精5种常用碳源对SY

本试验比较分析了酵母浸粉、蛋白胨、生黄豆粉、牛肉膏、玉米浆5种常用氮源对SY

本试验对比分析了薯蓣根茎粉末添加量分别为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L时对SY

本试验对比分析了无机盐添加量为基础培养基的0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍时对SY

本试验比较了吐温-80、甘油、二甲基亚砜以及聚乙二醇6000这4种表面活性剂对SY

本试验对比了种子液接种量为3％、5％、8％、10％、13％时对SY

本试验对比了初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0时对SY

本试验对比了发酵温度为25℃，28℃，30℃，33℃，35℃时SY

本试验对比了发酵时间为3d、4d、5d、6d、7d时对SY

根据上述单因素实验结果，选取蔗糖浓度、酵母浸粉浓度、生黄豆粉浓度、诱导物浓度、无机盐浓度、接种量、发酵温度、发酵时间这8个对皂素产量影响大的因素，和3个虚拟对照，各因素对应的编码及水平如表2所示，再依据单因素的最佳值，确定各个因素的水平，其中高水平用“1”表示，低水平用“-1”表示，设计内容见表3。待试验完成后，用Design-Expert 8.0.6对结果拟合分析，选取3个影响最大的因素，进行下一步优化。

并根据其设计进行发酵，测定各组试验的皂素产量(响应值R1)，实验结果见表3。

表2，P-B试验因素及水平

表3，P-B试验设计及试验结果

用设计软件对上述试验结果进行分析，进行一阶模型拟合，得到根据编码因素的最终方程如公式(1)所示：

R1＝23.58+4.98A+2.04B+4.31D+0.1353E+0.044G+0.975H+0.193K-0.815L   (1)

公式1中各因素符号分别代表的因素如表2所示。

由公式1可知：蔗糖浓度、酵母浸粉浓度、生黄豆粉浓度、诱导物浓度、接种量、温度、发酵时间均为正效应，无机盐倍数为负效应。该模型的方差分析，如表4所示。

表4，方差分析

由表4可知，该模型的P值为0.3314＞0.05，因此该模型不典型，不能用该模型直接预测优化后的数据，需要将影响较小的因素去除。由公式1可知，A(蔗糖浓度)、D(生黄豆粉浓度)和B(酵母浸粉浓度)这三个因素影响最大，因此，后续将对这三个因素进一步优化，其余因素则选取单因素优化时的最佳值，即诱导物浓度：15g/L，接种量：5％，温度：33℃，发酵时间：5d，无机盐浓度为基础培养基的2倍。

对影响因素最大的三个主要因素进行一阶模型拟合，得到根据编码因素的最终方程如公式(2)所示：

R1＝23.58+4.98A+2.04B+2.31D   公式(2)

该模型的方差分析，如表5所示。

表5，主要因素方差分析

由表5可知，修改后的模型P值＝0.0034<0.05，因此该模型典型，可用于预测各个因素的条件，之后将以此模型为基础，进一步进行优化。

2.最陡爬坡试验

通过上述Plackett-Burman实验确定了影响皂素产量的主要因素，通过对主要因素进行最陡爬坡实验，缩小取值区间。该试验设计如表6所示，其余因素按照单因素试验的最优结果，保持不变。根据所设计的试验进行发酵，测定各组的皂素产量，结果见表6。

表6，最陡爬坡试验设计和结果

由表6可知，第3组试验的皂素产量远高于其他组合，为39.04mg/L，第3组的培养基配比为：蔗糖19g/L，酵母浸粉14g/L，生黄豆粉9g/L。因此，发酵培养基的最佳配比在此区域附近，后续将以此为基础进行响应面优化。

3.响应面优化

在Design-Expert 8.0.6软件中填入最陡爬坡试验得到的三个显著因素，分别输入最高值和最低值，将其转换为编码制，并对试验设计的结果进行二次回归分析。其余因素为单因素实验的最优值，根据所设计的组别进行试验，对该模型进行方差分析，结果见表7。

表7，方差分析

由表7可知，该模型的P值＜0.0001，因此模型典型，且查询得该模型R

附图2为蔗糖浓度(A)、酵母浸粉浓度(B)和生黄豆粉浓度(C)三个因素，相互作用的等高线图、响应面图。由图可知，在这三个因素的试验范围内，响应值均存在最大值。利用Design-Expert8.0.6软件分析，模型预测的最佳条件为蔗糖18.81g/L，酵母浸粉14.24g/L，生黄豆粉9.27g/L，该条件下皂素产量的预测值为39.742mg/L。

实施例2

本实施例对优化前后SY

根据实施例1中单因素和多因素的实验优化后，得到优化后的培养基配方为：蔗糖18.81g/L，酵母浸粉14.24g/L，生黄豆粉9.27g/L，薯蓣根茎粉末15g/L，K

表8，培养基对比实验结果

由表8可知，优化后薯蓣皂素产量与预测值39.47mg/L较吻合，并且优化后的平均皂素产量为基础培养基皂素产量的3.49倍，优化效果明显。由图3可知，优化后的样品较优化前的样品皂素斑点大，即皂素产量大，可见优化后的培养基对皂素产量提高效果明显。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。