LRP1-β链短肽在治疗胰岛素抵抗和糖尿病中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及LRP1-β链短肽在治疗胰岛素抵抗和糖尿病中的应用。

背景技术

胰岛素是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素，可促进糖原生成，抑制糖原分解和肝糖异生，维持餐后血糖水平的稳定。长期过多摄入高碳水、高脂肪食物会导致胰岛素靶组织对其敏感性降低，出现“胰岛素抵抗”(insulin resistance,IR)和血糖水平异常升高。胰岛素抵抗是包括非酒精性脂肪性肝(NAFLD)、2型糖尿病等代谢性疾病发生的共同病理生理基础。当前临床2型糖尿病的治疗尚缺乏有效的手段。药物治疗包括控制高血糖、降血压、调节血脂和抗血小板治疗等，但都存在药物不良反应及耐受性问题，且长期疗效并不确定。非药物治疗包括控制体重和改善生活方式等，减重手术可改善肥胖伴糖尿病患者的血糖控制，但其长期有效性和安全性尚有待评估。

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科家族的成员之一，是一类无法自主复制、无包膜的二十面体微小病毒。在非致病的野生型AAV基础上进一步改造获得了重组腺相关病毒载体(rAAV)，具有安全性高、免疫原性低、宿主细胞范围广、扩散能力强、基因表达高效、体内表达时间长、血清型多样等特点。采用AAV基因组与不同的衣壳蛋白结合产生混合型病毒载体，具有不同的组织感染嗜亲性，从而表现出一定的器官靶向特异性，其中AAV8可靶向作用于肝脏。rAAV目前已被广泛应用于神经、代谢、基因治疗等研究领域，主要用于体内研究，被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。截止2022年4月，美国、欧盟、中国、日本已经批准超过16款基因和细胞治疗产品上市，其中Luxtunra、Zolgensma即为2款基于rAAV的基因治疗药物。在可预见的未来，随着rAAV载体和基因治疗的火热发展，越来越多基于AAV的基因疗法将会进入临床试验并获得广泛应用。

低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)属于低密度脂蛋白受体(LDLR)受体家族的I型跨膜蛋白，广泛表达于全身各处组织和细胞，是由一个515kDa的α链和一个85kDa的β链通过非共价键连接组成,α链主要与胞外配体相结合，β链则介导细胞内吞作用和胞内信号传导。LRP1参与许多病理生理过程包括脂代谢、保护血管及血脑屏障完整性、细胞分化过程等。

现有技术并没有将LRP1-β链应用于改善胰岛素抵抗和糖尿病的相关报道，而目前常用的糖尿病治疗药物或治疗措施存在适用局限性、疗效不佳及副作用，进一步研究糖尿病的发病机制并寻找新的药物治疗靶点对指导临床糖尿病的诊治、治疗及预后有重要意义。

发明内容

发明人构建了肝脏特异性过表达小鼠野生型LRP1-β链短肽的AAV8-LRP1-β腺相关病毒，研究了肝脏过表达LRP1-β链短肽对高脂诱导的胰岛素抵抗模型小鼠以及db/db糖尿病模型小鼠糖代谢的影响，进一步证实了LRP1-β链短肽通过明显抑制肝脏糖异生改善糖尿病小鼠的糖代谢紊乱。基于此，本发明提供了如下技术方案：

LRP1-β链短肽或者LRP1-β链短肽促进剂在制备预防和/或治疗胰岛素抵抗或糖尿病的药物中的应用。

在上述的应用技术方案中，所述胰岛素抵抗为肝胰岛素抵抗，所述糖尿病为2型糖尿病。

在上述的应用技术方案中，所述LRP1-β链短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在上述的应用技术方案中，所述LRP1-β链短肽促进剂为特异性过表达LRP1-β链短肽的病毒过表达载体。

在上述的应用技术方案中，所述LRP1-β链短肽促进剂为腺相关病毒(AAV)载体。

在上述的应用技术方案中，所述腺相关病毒载体是靶向肝脏过表达LRP1-β链短肽的重组腺相关病毒，

优选所述AAV载体是AAV8，所述AAV载体是重组AAV(rAAV)载体。

在上述的应用技术方案中，所述重组腺相关病毒载体是将如SEQ ID NO.5所示的信号肽编码序列和如SEQ ID NO.6所示的LRP1-β链短肽的编码基因序列插入AAV8病毒中得到。其中，信号肽起到在LRP1-β链短肽过表达的时候引导这个短肽定位到细胞膜上的作用。

优选地，所述重组腺相关病毒载体是将如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列插入AAV8病毒中得到。

在上述的应用技术方案中，LRP1-β链短肽通过抑制FoxO1/G6PC轴下调肝细胞糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)表达，从而降低肝糖异生和改善胰岛素抵抗和/或糖尿病患者的糖代谢。

在上述的应用技术方案中，LRP1-β链短肽阻断棕榈酸对肝细胞胰岛素信号转导的抑制作用，LRP1-β链短肽逆转棕榈酸对肝细胞糖异生相关基因上游核转录因子FoxO1磷酸化和乙酰化的抑制作用，LRP1-β链短肽抑制棕榈酸对G6PC表达的上调作用。

本发明构建了靶向肝脏的rAAV8-LRP1-β链短肽腺相关病毒，研究了肝脏过表达LRP1-β链短肽对高脂诱导的胰岛素抵抗模型小鼠以及db/db糖尿病模型小鼠糖代谢的影响，经实验证实了：

1.肝脏过表达LRP1-β链短肽改善高脂诱导胰岛素抵抗小鼠的糖代谢。

2.肝脏过表达LRP1-β链短肽改善db/db糖尿病小鼠的糖代谢。

3.肝脏过表达LRP1-β链短肽增强高脂诱导胰岛素抵抗小鼠和db/db小鼠肝脏胰岛素信号转导。

4.过表达LRP1-β链短肽阻断棕榈酸对肝细胞胰岛素信号转导的抑制作用。

5.过表达LRP1-β链短肽逆转棕榈酸对肝细胞糖异生相关基因上游核转录因子FoxO1磷酸化和乙酰化的抑制作用。

6.过表达LRP1-β链短肽抑制棕榈酸对肝细胞糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)

表达的上调作用。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现肝脏过表达LRP1-β链短肽可用于治疗高脂诱导的肝胰岛素抵抗和2型糖尿病，为胰岛素抵抗和2型糖尿病的治疗提供了新的靶点和治疗策略。本发明验证了LRP1-β链短肽通过抑制FoxO1/G6PC轴下调G6PC表达，从而降低肝糖异生和改善高脂诱导肝胰岛素抵抗小鼠及db/db糖尿病小鼠的糖代谢，能在短期内快速降低小鼠血糖水平，改善小鼠糖代谢使其恢复正常，并没有发现明显的不良反应或副作用。将LRP1-β链短肽应用在胰岛素抵抗和糖尿病治疗上，具有显著的优势：首先，LRP1-β链短肽来自于生物体自身蛋白，与生物体自身蛋白片段结构和免疫原性具有一致性，减少了生理排异反应和过敏反应出现的可能，具有很好的容受性；其次LRP1-β链短肽的肝脏过表达未见明显异常的副作用；第三，LRP1-β链短肽的肝脏过表达作用维持持久，效果良好。

本发明通过开发靶向肝脏过表达LRP1-β链短肽的腺相关病毒，并从糖尿病模型小鼠证实其对胰岛素抵抗和糖尿病具有明显的改善作用，据此可以利用分子生物学手段提高LRP1-β链短肽在肝脏细胞内的表达量，或通过基因工程制备LRP1-β链短肽再用于制备与人类2型糖尿病相关疾病的治疗药物。本发明研究对于推动临床糖尿病的防治进展、改善糖尿病患者预后及减轻社会卫生压力具有重要意义。

附图说明

图1是pAAV-TBG-MCS-3xFLAG质粒图谱。

图2是重组质粒pAAV-TBG-mLRP1b-3xFLAG-WPRE图谱。

图3pAAV-TBG-mLRP1-b-3xFLAG-WPRE质粒酶切(A)和测序鉴定(B)结果图。

图4是两组AAV注射高脂喂养小鼠禁食6小时(A)和18小时(B)血糖浓度比较。

图5是两组AAV注射高脂喂养小鼠葡萄糖耐量(A)和曲线下面积(B)比较。

图6是两组AAV注射高脂喂养小鼠胰岛素敏感性试验(A)和曲线下面积比较(B)。

图7是两组AAV注射高脂喂养小鼠丙酮酸耐量试验(A)和曲线下面积比较(B)。

图8是两组AAV注射高脂喂养小鼠长时程禁食血糖浓度(A)和曲线下面积(B)比较。

图9是两组AAV注射高脂喂养小鼠肝脏胰岛素信号比较。

图10是两组AAV注射高脂喂养小鼠肝脏FoxO1、G6PC和PCK1蛋白表达水平比较。

图11是两组AAV注射高脂喂养小鼠肝脏(A)和主要脏器组织(B)LRP1-β链短肽表达水平检测。

图12是两组AAV注射db/db小鼠禁食6小时(A)和18小时(B)血糖水平比较。

图13是两组AAV注射db/db小鼠葡萄糖耐量试验(A)和曲线下面积(B)比较。

图14是两组AAV注射db/db小鼠胰岛素敏感性试验(A)和曲线下面积(B)比较。

图15是两组AAV注射db/db小鼠丙酮酸耐量试验(A)和曲线下面积(B)比较。

图16是两组AAV注射db/db小鼠肝脏胰岛素信号比较。

图17是两组AAV注射db/db小鼠肝脏FoxO1、G6PC和PCK1表达水平比较。

图18是重组质粒pcDNA3.1(+)-hLRP1-β-3xFlag图谱。

图19是重组质粒pcDNA3.1(+)-hLRP1-β-3xFlag测序结果。

图20是人LRP1-β链短肽-Flag融合蛋白在MIHA细胞中的表达实验结果。

图21是过表达人LRP1-β链短肽逆转棕榈酸对MIHA细胞胰岛素信号的抑制实验结果。

图22是过表达人LRP1-β链短肽逆转棕榈酸对FoxO1乙酰化和磷酸化水平的下调实验结果。

图23是过表达人LRP1-β链短肽阻断棕榈酸对MIHA肝细胞G6PC表达的上调作用实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂，如无特别说明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。

主要试剂来源：

NheI、BamHI、MluI和EcoRI限制性内切酶由New EnglandBiolabs公司提供。

rAAV2/8-mLRP1-β链短肽腺相关病毒和rAAV2/8-GFP对照腺相关病毒均由和元生物技术(上海)股份有限公司制备。该腺相关病毒包装采用pAAV-TBG-MCS-3x FLAG表达载体作为穿梭质粒，含有肝实质细胞特异性TBG启动子和3xFlag标签，负责编码需要表达的目的基因以及两个末端反向重复序列ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作用(其质粒图谱如图1所示)；辅助质粒pAAV-RC质粒携带编码病毒衣壳蛋白及参与病毒复制的基因，pHelper质粒携带AAV复制所需要的腺病毒基因。

pcDNA3.1(+)-3×Flag质粒(#182494)由addgene公司提供。

低脂饲料(D12102C)和高脂饲料(D12492)均购自Research Diets公司。

实施例中用到的抗体来源信息如下：

实施例中所有数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示，采用Graphpad Prism8.0软件作图并进行统计学分析，两组之间组间差异采用独立样本t检验，多组之间差异采用双因素方差分析进行检验，以P值<0.05认为差异具有统计学意义(*，P<0.05；**，P<0.01)。

实施例1、AAV8腺相关病毒制备

制备过表达小鼠LRP1-β链短肽的rAAV2/8-mLRP1-β腺相关病毒，同时制备rAAV2/8-GFP作为对照腺相关病毒备用。

(1)合成目的基因片段

首先合成含有从5’端到3’端依次排列的NheI酶切位点、Kozak序列、信号肽编码序列、多位点接头、小鼠LRP1-β链短肽cDNA编码序列及BamHI酶切位点的基因片段，合成的基因片段序列如下(SEQ ID NO.1)所示：

在上述的SEQ ID NO.1序列中，5’和3’端的加粗字体的碱基是酶切位点，靠近5’端的加粗斜体字母的是信号肽编码序列(SEQ ID NO.2，其5’端带有起始密码子atg)，下划线部分是小鼠LRP1-β链短肽cDNA编码序列。

本实施例中选取的用于合成的SEQ ID NO.1序列中的小鼠LRP1-β链短肽cDNA编码序列是小鼠LRP1-β链的部分胞外片段+跨膜段+胞内段，选取的这段序列的核苷酸序列对应的是PubMed基因编号NM_008512.2：13047-14096这一段序列，其编码的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.3所示。

(2)目的基因片段双酶切

采用NheI和BamHI内切酶对合成的基因片段进行双酶切，酶切反应体系为：DNA 2μg、10×Buffer 5μl、NheI 1μl、BamHI 1μl、补ddH

(3)线性化表达载体的制备

采用NheI和BamHI内切酶对pAAV-TBG-MCS-3x FLAG表达载体进行酶切，酶切反应体系为如下：质粒2μg、10×Buffer 5μl、NheI 1μl、BamHI 1μl、补ddH

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，采用胶回收试剂盒(TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNAExtraction KitVer.3.0)对目的载体条带进行胶回收。

(4)载体连接

将小鼠LRP1-β链短肽cDNA片段构建入线性化表达载体中。将步骤(2)得到的小鼠LRP1-β链片段cDNA片段和将步骤(3)得到的线性化载体以摩尔比3:1加到离心管中进行连接反应，反应体系如下：

混匀后在16℃连接过夜，得到重组质粒pAAV-TBG-mLRP1-β-3xFLAG-WPRE(质粒图谱如图2所示)，取10μl反应液体转化到感受态细胞中。

(5)感受态细胞转化

1)从-80℃冰箱取出感受态大肠杆菌(DH-5α)，置冰上5-8min自然融化；

2)缓慢旋转加入上述反应液体1μl(浓度>10ng/μl)，冰上放置30min-1h；

3)42℃水浴中热激90s，再立即转移到冰上冷遇1-2min；

4)在超净工作台内加入700μl无抗生素的LB培养基，放入37℃、220rpm恒温振荡器培养40-60min，室温5000rpm离心1min；

5)于超净工作台内弃掉上清670μl,剩下70-100μl使用涂布棒均匀涂在含氨苄青霉素的LB固体培养板上，倒置平板于37℃孵箱培养过夜(14h)；

6)挑取单克隆菌斑加入4ml含氨苄青霉素的LB培养基于37℃孵箱振荡培养

12-14h，取少许菌液送测序公司进行测序验证；

7)余下菌液采用质粒小提试剂盒提取质粒；

8)提取的质粒采用BamHI/MluI双酶切和凝胶电泳进行鉴定，结果如图3A所示：

图上标记1为未酶切的质粒电泳图，图上标记2为BamHI/MluI双酶切质粒后产物电泳图，可见酶切产物为4148bp和1854bp两个片段。质粒经测序鉴定序列无误(图3B)。

(6)腺相关病毒包装

1)将构建好的病毒载体pHelper和pAAV-RC质粒采用试剂盒进行大量抽提。

2)AAV-293细胞培养和转染

a)从液氮罐中取出AAV-293细胞冻存管，复苏并培养传代；

b)接种AAV-293细胞于10cm皿，48h后用于转染，转染时汇合度达到70-80％；

c)转染前1h取出细胞培养板更换培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基；

d)将待转染的病毒载体质粒32μg(pHelper:pAAV-RC:穿梭质粒＝1:1:1)

溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl,轻轻混匀，静置5min；

e)将Obio转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀静置5min；

f)将Obio转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和Obio转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体；

g)取出细胞皿，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中；

h)6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

3)病毒收获及纯化

a)转染60h后将细胞刮下并收集到离心管；

b)1500g 4℃离心5min。将细胞沉淀重悬在7ml的10mM Tris-HCl缓冲液中；

c)取细胞裂解液在干冰/乙醇浴，37℃水浴中反复冻融8次；

d)使用10mM Tris-HCl将裂解液定容到21ml；

e)超声仪超声7min；加入2ml DNase I(3mg/ml)37℃孵育30min；再次超声7min；

f)加入2.5ml 10％脱氧胆酸钠，2.1ml 0.25％胰酶-EDTA，混合均匀后37℃孵育30min，冰上放置20min；

g)加入16.9g CsCl。混合均匀后37℃孵育20min。中间摇动，直到CsCl完全溶解；

h)4℃3000g离心30min，将细胞裂解液转移到超速离心管(约5ml/tube)；

i)4℃53,000rpm离心30h，使用自制的针头收集病毒层；

j)4℃透析，12-16h换透析液，每次使用4L缓冲液。

至此，得到rAAV2/8-mLRP1-β和rAAV2/8-GFP腺相关病毒。

实施例2、HFD小鼠实验

选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠20只，采用高脂(HFD)饲养16周诱导胰岛素抵抗模型。随机分为AAV8-对照组和AAV8-β链短肽两组，每组10只，小鼠按照2×10

注射病毒后0、4、6周，采取鼠尾取血和血糖仪方法检测小鼠禁食6h血糖水平；于注射病毒后0、3、5周检测禁食18h血糖水平。结果如图4所示，注射病毒前，两组小鼠禁食6h和18h的血糖水平没有差异。图4A显示注射病毒4周和6周后小鼠禁食6h血糖水平，AAV8-β链短肽组明显低于AAV8-对照组(*P<0.05,**P<0.01与对照组相比)；图4B所示，注射病毒3周和5周后小鼠禁食18h血糖水平，AAV8-β链短肽组同样明显低于AAV8-对照组(*P<0.05,**P<0.01与对照组相比)。

小鼠注射病毒后6周，比较两组小鼠葡萄糖耐量。经过夜禁食后按照1g葡萄糖/kg体重的剂量经腹腔注射葡萄糖溶液，注射后0、30、60、90、120min采取鼠尾取血和血糖仪方法检测小鼠血糖水平。结果如图5所示：图5A所示为两组小鼠葡萄糖耐量试验比较，可见注射0、30、60、90、120min后，AAV8-β链短肽组小鼠血糖值均明显低于AAV8-对照组小鼠(*P<0.05，**P<0.01与同一时间点AAV8-对照组相比)；图5B比较两组小鼠葡萄糖耐量曲线下面积，AAV8-β链短肽组小鼠明显低于AAV8-对照组(**P<0.01)。结果表明肝脏过表达LRP1的β链短肽后，HFD喂养小鼠的葡萄糖耐量得到明显改善。

小鼠注射病毒后7周，比较两组小鼠的胰岛素敏感性。小鼠禁食5小时后按照0.75IU/kg体重的剂量经腹腔注射胰岛素，注射后0、30、60、90、120min采取鼠尾取血和血糖仪方法检测小鼠血糖水平，以0时间点血糖值为100％，其它时间点血糖值与之相比得到葡萄糖相对浓度值。结果如图6所示：图6A所示为两组小鼠胰岛素敏感性比较，可见注射胰岛素后30、60、90、120minAAV8-β链短肽组小鼠血糖值均明显低于AAV8-对照组小鼠(**P<0.01与同一时间点AAV8-对照组相比)；图6B比较两组小鼠胰岛素敏感性曲线下面积，AAV8-β链短肽组小鼠明显低于AAV8-对照组(两组相比，**P<0.01)。结果表明肝脏过表达LRP1的β链短肽后，小鼠胰岛素敏感性明显增强。

小鼠注射病毒后8周，比较两组小鼠的丙酮酸耐量。小鼠经过夜禁食后按照1g丙酮酸钠/kg体重的剂量经腹腔注射丙酮酸钠溶液，注射后0、30、60、90、120min采取鼠尾取血和血糖仪方法检测小鼠血糖水平。结果如图7所示：图7A显示注射0、30、60、90、120min后，AAV8-β链短肽组小鼠血糖值均明显低于AAV8-对照组小鼠(*P<0.05，**P<0.01与同一时间点AAV8-对照组相比)；图7B比较两组小鼠丙酮酸耐量曲线下面积，AAV8-β链短肽组小鼠明显低于AAV8-对照组(两组相比，**P<0.01)。上述结果表明，肝脏过表达LRP1的β链短肽后小鼠丙酮酸耐量明显提高，肝脏糖异生水平受到抑制。

小鼠注射病毒后9周经过夜禁食后再给与HFD自由进食2h后，分别于0、6、16、24、40、48h的时间点采取鼠尾取血和血糖仪方法检测血糖值，比较两组小鼠长时程禁食血糖水平下降趋势。图8所示为两组小鼠长时程禁食血糖水平比较，可见在所有观测时间点，AAV8-β链短肽组小鼠血糖值均明显低于AAV8-对照组小鼠。在禁食后24h，AAV8-对照组小鼠可以观测到糖异生增强引起的血糖曲线上升峰，而AAV8-β链短肽组小鼠血糖值持续下降，血糖曲线未见上升峰(*P<0.05，**P<0.01与同一时间点AAV8-对照组相比)。上述结果表明，肝脏过表达LRP1的β链短肽后，HFD饲养小鼠肝脏糖异生水平受到持续抑制，从而使其长时间维持较低血糖水平。

小鼠注射病毒后10周，过夜禁食后在麻醉状态下每组小鼠随机选取5只注射生理盐水，另外5只按照1IU/kg体重注射胰岛素，30min后处死小鼠，取肝脏组织提取总蛋白，检测胰岛素信号转导。免疫印迹实验(WB)方法比较两组禁食小鼠肝脏糖异生关键酶G6PC和PCK1的表达，以及糖异生基因的调控因子FoxO1总蛋白、磷酸化FoxO1及乙酰化FoxO1水平。图9显示，在胰岛素刺激条件下小鼠肝脏组织磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平比较，AAV8-β链短肽组均明显高于AAV8-对照组。该结果表明，肝脏过表达LRP1的β链短肽后，增强小鼠肝脏胰岛素信号传递。

图10显示，在禁食情况下，与AAV8-对照组小鼠肝脏组织相比，尽管AAV8-β链短肽组小鼠肝脏组织FoxO1的总蛋白表达水平不变，但是磷酸化FoxO1和乙酰化FoxO1的水平均出现明显增高。此外，尽管PCK1蛋白水平两组一致，但是AAV8-β链短肽组肝糖异生反应的另一关键酶G6PC水平明显增高。这些结果表明，肝脏过表达LRP1的β链短肽后，肝细胞FoxO1的磷酸化和乙酰化修饰水平增强，促进FoxO1从肝细胞核向胞浆转移，转录活性降低，导致下游G6PC的表达下调，从而降低肝糖异生水平，促进HFD喂养小鼠血糖水平降低。

实验结束后麻醉状态下处死小鼠，立即提取肝脏组织匀浆，采取WB方法和anti-Flag抗体检测Flag标记的LRP1-β链短肽在肝脏组织(图11A)和主要脏器组织(图11B)中的表达。结果显示，LRP1-β链短肽-Flag融合蛋白在AAV8-β链短肽组小鼠的肝脏组织中高水平表达，而心脏、肾脏、脑、白色脂肪、肌肉组织中仅有微量表达，脑组织中无表达。AAV8-对照组小鼠所有组织未见LRP1-β链短肽表达，证实本实验采取的腺相关病毒具有肝脏靶向特异性，且注射后LRP1-β链短肽能保持长时间的稳定高水平表达。

实施例3、db/db小鼠实验

选取6周龄雄性db/db小鼠(2型糖尿病小鼠模型)12只，随机分为AAV8-对照组和AAV8-LRP1β链短肽两组，每组6只。小鼠按照2x10

注射病毒后4周，比较两组db/db小鼠的葡萄糖耐量。小鼠经过夜禁食后按照1g葡萄糖/kg体重的剂量经腹腔注射葡萄糖溶液，注射后0、30、60、90、120min采取鼠尾取血和血糖仪方法检测小鼠血糖水平。图13Α所示与AAV8-对照组相比，AAV8-β链短肽组在0、90、120min时间点血糖水平明显降低(*P<0.05与同一时间点AAV8-对照组相比)；图13B所示与AAV8-对照组相比，AAV8-β链短肽组葡萄糖耐量曲线下面积明显降低(*P<0.05)。这一结果表明，肝脏过表达β链短肽能改善db/db小鼠的葡萄糖耐量。

注射病毒后5周比较两组小鼠的胰岛素敏感性。小鼠禁食5h后按照1IU/kg体重剂量经腹腔注射胰岛素，注射后0、30、60、90、120min采取鼠尾取血和血糖仪方法检测血糖水平，以0时间点血糖值为100％，其它时间点血糖值与之相比得到血糖浓度相对值。图14Α所示与AAV8-对照组相比，AAV8-β链短肽组db/db小鼠在30、60、90、120min时间点血糖降低显著(*P<0.05，**P<0.01与同一时间点AAV8-对照组相比)；图14B所示与AAV8-对照组相比，AAV8-β链短肽组胰岛素敏感性实验曲线下面积明显降低(**P<0.01)。这一结果表明，肝脏过表达β链短肽能明显增强db/db小鼠的胰岛素敏感性。

注射病毒后6周比较两组小鼠的丙酮酸耐量。小鼠经过夜禁食后按照1g丙酮酸钠/kg体重剂量经腹腔注射丙酮酸钠溶液，注射后0、30、60、90、120min采取鼠尾取血和血糖仪方法检测血糖水平。图15Α显示，AAV8-β链短肽组db/db小鼠在所有时间点血糖值均明显低于AAV8-对照组db/db小鼠(*P<0.05，**P<0.01与同一时间点AAV8-对照组相比)；图15B显示，与AAV8-对照组相比，AAV8-β链短肽组丙酮酸耐量曲线下面积明显降低(**P<0.01)。结果表明肝脏过表达β链短肽能明显增强db/db小鼠的丙酮酸耐量。

注射病毒后7周，过夜禁食后每组小鼠随机选取3只注射生理盐水，另外3只按照1IU/kg体重注射胰岛素，30min后处死小鼠提取肝脏组织总蛋白，采用WB方法检测胰岛素信号转导。图16显示，在胰岛素刺激条件下，AAV8-β链短肽组小鼠肝脏组织磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平均明显高于AAV8-对照组小鼠肝脏组织。该结果表明，肝脏过表达LRP1的β链短肽后，同样明显增强db/db小鼠的肝脏胰岛素信号传递。

图17显示，在禁食情况下，AAV8-β链短肽组肝脏组织乙酰化FoxO1的水平明显高于AAV8-对照组，而G6PC表达则明显低于AAV8-对照组，但两组小鼠肝脏组织磷酸化FoxO1、FoxO1和PCK1表达水平没有差异。上述结果表明，肝脏过表达β链短肽能增强db/db小鼠肝脏组织FoxO1乙酰化，从而降低FoxO1的转录活性和G6PC的表达，抑制肝糖异生和降低血糖水平，改善db/db小鼠的糖代谢。

实施例4、构建过表达人LRP1-β链短肽的pcDNA-hLRP1-β链短肽-3xFlag质粒

由上海Sangon Biotech生工生物公司合成含有从5’端到3’端依次排列的BamHI酶切位点、Kozak序列、信号肽编码序列、多位点接头、人LRP1-β链短肽cDNA编码序列及EcoRI酶切位点的基因片段，合成的基因片段序列如下(SEQ ID NO.4)所示：

在上述的SEQ ID NO.4序列中，5’和3’端的加粗字体的碱基是酶切位点，靠近5’端的加粗斜体字母的是信号肽编码序列(SEQ ID NO.5，其5’端带有起始密码子atg)，下划线部分是人LRP1-β链短肽cDNA编码序列。

本实施例中选取的用于合成的SEQ ID NO.4序列中的人LRP1-β链短肽cDNA编码序列是人LRP1-β链的部分胞外片段+跨膜段+胞内段，选取的这段序列的核苷酸序列对应的是PubMed基因编号NM_002332.3：13065-14114这一段序列，其编码的氨基酸序列如序列SEQID NO.6所示。

以pcDNA3.1(+)-3×Flag质粒为载体，将上述合成的基因片段经BamHI和EcoRI双酶切后，利用BamHI和EcoRI酶切位点插入载体中构建pcDNA3.1(+)-hLRP1-β-3xFlag质粒(质粒图谱如图18所示)。实验步骤也分为目的基因片段双酶切、线性化表达载体的制备、载体连接、感受态细胞转化、小提质粒，具体方法步骤参见实施例1中pAAV-TBG-mLRP1-β-3×FLAG-WPRE质粒的构建。重组质粒经测序鉴定确认序列无误后用于后续实验，测序结果如图19所示：显示测序鉴定无误。

将人正常肝细胞系MIHA细胞传代至12孔板，待细胞密度生长至70-80％后换液，分别采用250μM棕榈酸或0.5％BSA处理，同时棕榈酸处理组细胞分别转染pcDNA3.1(+)-hLRP1-β-3xFlag质粒或空载质粒48h。每组细胞用100nM胰岛素处理5min后收获细胞。采用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液获取细胞总蛋白，用WB技术检测人LRP1-β链短肽-Flag融合蛋白、磷酸化Akt、Akt、磷酸化GSK3β和GSK3β水平，β-actin作为内参对照。同时检测没有胰岛素处理情况下磷酸化FoxO1、乙酰化FoxO1、FoxO1、G6PC和PCK1蛋白的表达水平。图20显示，MIHA细胞转染pcDNA3.1(+)-hLRP1-β-3xFlag质粒后，采用anti-Flag抗体能检测到人LRP1-β链短肽-Flag融合蛋白高表达，而未转染或空载质粒转染的MIHA细胞则没有检测到表达。

图21A表明棕榈酸处理明显降低胰岛素刺激条件下MIHA细胞的磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平，导致胰岛素抵抗的形成。ΜΙHΑ细胞过表达人LRP1-β链多肽能明显逆转棕榈酸对胰岛素作用下磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平的下调作用，增强胰岛素信号转导；图21B显示是图21Α所示实验重复三次所得结果进行统计学分析。

图22显示，棕榈酸处理虽然不影响MIHA细胞核转录因子FoxO1的总蛋白水平，但明显降低FoxO1的磷酸化和乙酰化水平；ΜΙHΑ细胞过表达LRP1-β链短肽能明显逆转棕榈酸对FoxO1的磷酸化和乙酰化的抑制作用。

图23显示，棕榈酸处理明显升高MIHA细胞的G6PC表达水平，但不影响PCK1的表达；MIHΑ细胞过表达人LRP1-β链短肽能明显逆转棕榈酸对G6PC表达的上调作用，但不影响PCK1的表达。

本发明通过细胞实验验证了饱和脂肪酸棕榈酸处理模拟高脂环境，诱导人肝细胞系MIHA细胞形成胰岛素抵抗，可见胰岛素刺激作用下Αkt和GSK3β磷酸化水平显著性降低，进一步引起下游核转录因子FoxO1磷酸化和乙酰化水平降低，导致肝细胞核中FoxO1蓄积并持续激活下游糖异生关键酶G6PC的基因转录，增强肝糖异生作用。过表达LRP1-β链短肽能逆转棕榈酸对胰岛素信号的抑制，增强Αkt和GSK3β的磷酸化，上调FoxO1的磷酸化和乙酰化水平，减少FoxO1在肝细胞核中的蓄积并下调G6PC的基因转录，从而降低肝糖异生水平。

大量实验证据表明肝脏组织中G6PC高表达和异常激活导致肝糖生成持续增加是诱发肝胰岛素抵抗及全身胰岛素抵抗的重要原因。我们在两种糖尿病小鼠模型都证实，LRP1-β链短肽过表达能激活小鼠肝脏组织胰岛素信号，促进FoxO1的磷酸化和乙酰化，抑制G6PC的表达，减少肝糖异生作用，降低血糖水平，从而改善高脂诱导肝胰岛素抵抗小鼠及db/db糖尿病小鼠的糖代谢。