一种ROMP聚合反应交联的透明质酸材料及制备与应用

技术领域

本发明属于软组织填充技术领域，具体涉及一种ROMP聚合反应交联的透明质酸材料及制备与应用。

背景技术

透明质酸，是人体中广泛存在的一种多糖，其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种生理功能，如润滑关节，调节血管管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进伤口愈合等。透明质酸具有非常好的锁水作用。人类皮肤中含有大量的透明质酸，用于改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、富有弹性。但随着年龄的增长，皮肤中的透明质酸含量会逐渐降低，导致皮肤褶皱，萎缩，此时需注射透明质酸以起到填充美容的作用。由于天然提取的透明质酸注射于人体时，降解非常迅速，一般将透明质酸交联后注射于皮下，以延长降解时间。

目前，透明质酸的交联方法主要有两种：物理交联法和化学交联法，其中常用的交联方法为化学交联法。化学交联法是将交联剂与透明质酸在溶液中混合均匀，保温进行交联反应，常用的交联剂有以下几种：丁二醇缩水甘油醚，聚乙二醇缩水甘油醚，二乙烯基砜等，但是交联剂都是有机试剂，有很强的毒性和致癌性，且交联后的空间网状结构对未反应的交联剂具有包裹作用，去除难度较大。为解决上述问题，也有专利报道开发新的交联剂，例如中国专利文献CN109096483A提供一种分枝型多元甘醇环氧衍生物交联剂，具有下式I所示结构。中国专利文献CN107880282A提供一种水溶性的多元甘醇环氧衍生物交联剂具有下式II所示结构，但是上述交联剂制备方法复杂，成本较高

目前，已有的透明质酸化学交联的方法都有一定的缺陷，比如大量交联剂难以去除，反应效率难以控制、稳定性不够强等等。因此，开发新的交联方法制备透明质酸凝胶具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种ROMP聚合反应交联的透明质酸材料及制备与应用。本发明利用ROMP聚合反应对透明质酸进行交联，相对于目前透明质酸凝胶交联剂交联的方法，具有更低的交联剂残留量，更好的生物相容性和降解安全性的特性。本发明制备的交联透明质酸材料，溶解于水或盐溶液中可制备得到具有生物相容性、安全性以及一定力学性能的水凝胶，具有与人体相适应的pH和渗透压，可以用于制备软组织填充剂。

术语说明：

室温：具有本领域公知含义，指25±5℃。

本发明的技术方案如下：

一种ROMP聚合反应交联的透明质酸材料的制备方法，包括步骤如下：

（1）将透明质酸加入碱性溶液中，之后加入环氧丁烯，进行反应，得到反应液I；

（2）将步骤（1）所得反应液I的pH调至3-5，之后加入环烯烃溶液和Grubbs催化剂，进行ROMP聚合反应，得到交联透明质酸反应液II；

（3）将步骤（2）所得交联透明质酸反应液II的pH调至6-8，加入乙醇进行沉淀，经过滤、洗涤、干燥，得到ROMP聚合反应交联的透明质酸材料。

根据本发明优选的，步骤（1）中所述透明质酸的分子量为10-3000kDa，进一步优选为100-2500kDa。

根据本发明优选的，步骤（1）中所述碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或碳酸钠溶液；所述碱性溶液的质量分数为0.5-2%；所述碱性溶液的体积与透明质酸的质量之比为20-100mL:1g。

根据本发明优选的，步骤（1）中所述环氧丁烯与透明质酸的质量比为0.02-0.2:1，进一步优选为0.05-0.1:1。

根据本发明优选的，步骤（1）中所述反应的时间为4-16h；所述反应的温度为室温。

根据本发明优选的，步骤（2）中，使用HCl溶液调节反应液I的pH至3-5，所述HCl溶液的浓度为10-200mmol/L。

根据本发明优选的，步骤（2）中所述环烯烃为环辛四烯、环戊二烯或环己二烯；所述环烯烃与透明质酸的质量比为0.01-0.5:1，进一步优选为0.1-0.2:1。

根据本发明优选的，步骤（2）中所述环烯烃溶液是将环烯烃溶于四氢呋喃中得到的，所述环烯烃溶液的浓度为0.01-0.05g/mL。

根据本发明优选的，步骤（2）中所述Grubbs催化剂为Grubbs二代催化剂、Grubbs三代催化剂、Hoveyda-Grubbs一代催化剂或Hoveyda-Grubbs二代催化剂；所述Grubbs催化剂的加入质量为透明质酸质量的0.1-1‰。

根据本发明优选的，步骤（2）中所述ROMP聚合反应的温度为20-60℃，所述ROMP聚合反应的时间为0.5-6h。

根据本发明优选的，步骤（3）中，使用碱溶液调节交联透明质酸反应液II的pH调至6-8；所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述碱溶液的质量分数为0.5-1.5%。

根据本发明优选的，步骤（3）中所述乙醇的加入体积与交联透明质酸反应液II的体积之比为2-10:1；所述沉淀的时间为2-24h。

根据本发明优选的，步骤（3）中所述洗涤为用乙醇洗涤3-5次；所述干燥为在30-60℃下干燥4-24h。

本发明还提供了一种ROMP聚合反应交联的透明质酸材料，采用上述制备方法制备得到。

本发明还提供了一种交联透明质酸钠水凝胶，该交联透明质酸钠水凝胶是将上述ROMP聚合反应交联的透明质酸材料加入水或盐溶液中，溶胀得到的；优选的，所述水或盐溶液的体积与ROMP聚合反应交联的透明质酸材料的质量之比30-100mL:1g；所述盐溶液为PBS缓冲液；所述溶胀的时间为2-4h。本发明的水凝胶具有生物相容性、安全性以及一定力学性能，具有与人体相适应的pH和渗透压。

根据本发明，上述交联透明质酸钠水凝胶在制备软组织注射填充剂中的应用。本发明所得注射填充剂以ROMP聚合反应交联的透明质酸为主要成分，具有与人体相适用的pH和渗透压，通过高压灭菌，可注射于面部、手部、颈部等需要填充的部位。

本发明的技术特点及有益效果如下：

1、本发明将ROMP反应应用于交联透明质酸材料的制备，制备的交联透明质酸材料溶解于水或者盐溶液中制备的水凝胶，相较于目前研究的透明质酸水凝胶，具有更好的生物相容性和降解安全性，制得的交联透明质酸水凝胶可以用于制备软组织填充剂。

2、本发明利用ROMP聚合反应对透明质酸进行交联，相对于目前透明质酸交联剂交联的方法，通过醇沉的方式得到固体的交联透明质酸钠材料，利于保存及运输，具有更低的交联剂残留量，更好的生物相容性和降解安全性的特性。

3、本发明所涉及的交联透明质酸水凝胶的制备方法可以通过控制透明质酸的分子量和环烯烃的用量，从而调整交联透明质酸水凝胶的溶胀度和降解速率等性能

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行说明，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。

实施例1

一种交联透明质酸钠水凝胶的制备方法，包括步骤如下：

（1）称取分子量为1000KDa的透明质酸2g，加入100mL质量分数为1%的NaOH水溶液中，再加入环氧丁烯0.1g搅拌均匀，室温下反应6小时，使透明质酸钠分子上增加C=C键，得到反应液I；

（2）将0.2g环辛四烯用10mL THF溶解，得到环辛四烯溶液；

（3）将步骤（1）得到的反应液I用浓度为0.01mol/L的HCl水溶液调节pH至4，然后加入步骤（2）制得的环辛四烯溶液，再加入1mg Grubbs三代催化剂，在40℃下反应2小时，得到交联透明质酸反应液II；

（4）使用质量分数为1%的氢氧化钠水溶液将步骤（3）的交联透明质酸反应液II调节pH至7，加600mL乙醇沉淀6h，得到交联透明质酸钠粗品；

（5）过滤，收集交联透明质酸粗品，用乙醇洗涤3次，在40℃下干燥8h，得交联透明质酸钠材料，即为ROMP聚合反应交联的透明质酸材料；

（6）将步骤（5）制得的交联透明质酸钠材料2g加入100mL PBS溶液中，溶胀3h，制成交联透明质酸钠水凝胶。

实施例2 交联透明质酸钠水凝胶的制备

采用分子量为2000kDa的透明质酸，其余条件同实施例1。

实施例3 交联透明质酸钠水凝胶的制备

步骤（2）环辛四烯的加入量为0.4g，其余条件同实施例1。

对比例1

如实施例1所述，所不同的是步骤（3）中调节pH至7，得到的反应液II无法在步骤（4）中醇沉得到交联透明质酸钠粗品。

试验例1：溶胀度实验分析

为了对本发明中交联透明质酸钠水凝胶的溶胀性能进行评价，使用电子天平对干燥后的凝胶进行称重记录M1，然后将凝胶置于生理盐水中在在37℃条件下进行溶胀试验，分别在0.5h后用滤纸吸干多余水分，称重记录为M2，通过（M2-M1）/M1计算溶胀度。

表1 各实施例溶胀度结果

由表1数据可知，以不同分子量的透明质酸钠为底物，得到的凝胶溶胀度各不同；以相同分子量的透明质酸钠为底物，交联剂用量不同，最后得到的凝胶溶胀度也不同。从而得出，凝胶溶胀度与透明质酸钠分子量和交联剂用量相关，可以通过控制透明质酸分子量和交联剂用量得到具有目标溶胀度的交联透明质酸钠水凝胶。

试验例2：细胞毒性实验

分别对实施例1-3制备的交联透明质酸钠凝胶进行细胞毒试验，试验方法如下：

分别称取1.0g样品置于30mL细胞培养液（10%NBCS，1%PS的DMEM）中，37℃条件下，60rpm震荡浸提24h制备浸提液，将浸提液离心取上清作为待测液。使用小鼠成纤维细胞L929，试验采用传代48-72h生长旺盛的细胞，制备细胞悬液（浓度为1×10

设置阴性对照、阳性对照和介质对照。阳性对照组为10%DMSO溶液，现配现用；阴性对照组为聚乙烯，按照每6cm

表2 各实施例细胞毒性结果

试验例3：兔耳皮肤填充试验

为了对本发明中交联透明质酸钠水凝胶的填充维持效果，选择在家兔耳背部皮肤进行皮内注射填充，观察皮肤隆起状态的维持时间。选择健康新西兰家兔3只，1只做空白对照不注射，另2只进行皮肤填充试验。在试验家兔的耳部选择5个注射部位，分别注射0.1mL生理盐水以及实施例1、实施例2、实施例3制备的交联透明质酸钠水凝胶。兔耳皮肤在注射后观察24周，记录填充部位皮肤维持隆起状态的时间。

表3各实施例皮肤填充维持时间

兔耳皮内注射交联透明质酸钠水凝胶后，生理盐水组和实施例组在注射部位会出现局部轻微发红现象，能在3-7天内恢复。实验结束后，与空白对照组相比，实验组的家兔血常规正常，心、肝、脾、肺、肾等主要脏器未见明显异常。

与生理盐水组相比，实施例的交联透明质酸钠水凝胶的填充维持时间可达到10-16周左右，通过控制透明质酸的分子量和和环烯烃的用量可以得到维持时间不同的交联透明质酸钠水凝胶。