一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及到一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用。

背景技术

生物柴油是一种可代替石化柴油的可再生清洁能源，具有良好的燃烧特性，较高的安全性和发动机低温启动性能，受到广泛关注。相比于传统的化学法制备生物柴油，生物酶法是一种绿色、可持续的生产方式，具有反应条件温和、对原料要求低、后处理简单、催化剂无毒等优点。但酶催化剂普遍存在制备成本高、催化效率低、稳定性差等问题，极大地限制了其工业化应用。

为了克服这些障碍，本发明中提出了酵母表面展示脂肪酶的方案。巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表面展示技术基本原理是以细胞表面的蛋白作为锚定蛋白，通过分子生物学技术，将锚定蛋白的基因序列与外源蛋白基因序列融合后导入毕赤酵母基因组中，信号肽引导分泌表达，使得融合蛋白与细胞表面会以非共价或共价作用结合，从而实现外源蛋白与锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在酵母细胞的表面。脂肪酶被展示于毕赤酵母表面后可保持其相对独立的蛋白结构和功能，并可以通过回收宿主细胞实现脂肪酶的获取，使得表达、纯化、固定化于一体，可以直接应用于酶催化反应，从而省去分泌蛋白提取纯化和固定化的繁琐工艺流程，节约成本。因此，构建脂肪酶的表面展示菌株进行生物柴油的制备具有很大的实际意义。

虽然表面展示具有诸多优点，但仍存在使用稳定性差的问题，因此如何提高表面展示脂肪酶这一全细胞催化剂的稳定性仍是一个急需解决的问题，对酵母表面进行创新性的修饰无论对科研还是对实际应用都有巨大意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案一种表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其包括如下步骤：使用锚定蛋白进行脂肪酶的表面展示，所述脂肪酶位于锚定蛋白的C端，确定锚定完成后制得表面展示脂肪酶的毕赤酵母重组菌。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：锚定蛋白为Aga2。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：锚定蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：锚定蛋白将脂肪酶与毕赤酵母相连。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：毕赤酵母为KM71H，菌株保藏号：CCTCC M2023046。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：毕赤酵母表达载体为pPICZαA载体。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：甜菜碱与表面展示脂肪酶的毕赤酵母共同孵育，从而制得甜菜碱修饰毕赤酵母表面展示脂肪酶。

作为本发明所述的一种优选方案，其中：甜菜碱修饰脂肪酶表面展示毕赤酵母全细胞催化剂，应用于催化制备生物柴油。

本发明有益效果：

本发明提供了一种毕赤酵母表面展示脂肪酶TLL的方法以及得到的特定重组菌D-TLL，重组菌D-TLL的在实际中酶活能够达到2274.7U/g干细胞，为目前报道的脂肪酶TLL表面展示体系中的最高水平；经甜菜碱修饰后，所获得的全细胞催化剂D-TLL-betaine用于催化制备生物柴油，具有催化效率高，反应时间短，反应条件温和，高效，绿色安全等优点。使工程菌的工业价值得到进一步提高，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为连接肽对表面展示脂肪酶TLL的影响；

图2为锚定蛋白及融合方式对表面展示脂肪酶TLL的影响；

图3为修饰物对全细胞催化剂重复使用次数的影响；

图4为甜菜碱修饰的全细胞催化剂D-TLL-betaine的傅里叶红外光谱图；

图5为D-TLL和D-TLL-betaine在油水界面的现象；

图6为D-TLL和D-TLL-betaine的热稳定性；

图7为D-TLL和D-TLL-betaine的甲醇耐受性；

图8为D-TLL和D-TLL-betaine在催化制备生物柴油过程中的重复使用次数；

图9为全细胞催化剂催化制备生物柴油的反应条件优化的数据图；

图10为本发明实施例5中全细胞催化剂D-TLL-betaine催化不同种类的油脂原料制备生物柴油得率数据图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

本实施例主要目的是筛选连接肽和锚定蛋白，以构建最优的脂肪酶TLL的毕赤酵母表面展示体系：

1、连接肽的筛选

脂肪酶基因tll合成后插入到载体pPICZαA的酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ之间；锚定蛋白基因Sed1合成后插入到酶切位点KpnⅠ和XbaⅠ之间；在酶切位点KpnⅠ后插入免疫荧光标签6×His-tag，获得表达载体AMT-Sed1；长度为108bp的连接肽SEG和长度为45bp的连接肽(G

用SacⅠ线性化上述表达载体，酶切体系：43.5μL质粒，5μL 10×Q.cut buffer，1.5μL Q.cut SacⅠ，37℃保温30min。按照Axygen的PCR清洁试剂盒使用说明回收线性化载体。取10μg线性化载体加入80μL上述制备的酵母感受态细胞中，转入预冷的电转杯中，冰置5min。2000V，5ms电击一次，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液，30℃孵育1h。取400μL转化液涂布YPDS平板(含100μg/mL Zeocin抗性)，30℃培养2-3天。挑取饱满、形态较好的单菌落进行菌落PCR，扩增出相应条带的重组菌初步断定为阳性转化子。

将阳性转化子接种于2mL YPD摇管，30℃，250rpm培养16-20h后接入25mL BMGY培养基，培养至OD

测定重组菌株水解酶活力。以10μL 20mmol/L对硝基苯月桂酸酯(p-NPL)为底物，加入180μL 50mmol/L PBS缓冲液(pH为7.5)，在40℃下保温5min后，加入10μL重组菌悬液，准确反应5min，加入600μL终浓度为1mol/L的Na

如图1所示，含有连接肽SEG的重组菌株的酶活为39.5U/g细胞干重，含有连接肽(G

2、锚定蛋白的筛选

锚定蛋白基因Aga2、GCW61合成后分别插入到表达载体AMT-Sed1的6×His-tag和酶切位点XbaⅠ之间，以替换锚定蛋白Sed1，获得N端融合的表达载体AMT-Aga2和AMT-GCW61。将锚定蛋白基因Aga2插入到载体pPICZαA的酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ之间；将脂肪酶基因tll插入到酶切位点KpnⅠ和XbaⅠ之间；将6×His-tag插入到酶切位点KpnⅠ和脂肪酶基因tll之间，获得C端融合的表达载体AMAga2-T。锚定蛋白基因GCW61的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。上述表达载体的合成由上海生工生物有限公司完成。

用SacⅠ线性化上述表达载体，转化毕赤酵母KM71H，挑取阳性转化子进行扩大培养，在BMMY培养基中诱导表达96h，离心收集菌体，洗涤3次后测定其水解酶活。如图2所示，含有锚定蛋白GCW61的重组菌株的酶活为82.3U/g细胞干重，脂肪酶与锚定蛋白Aga2进行N端融合的重组菌株的酶活为1865.4U/g细胞干重，脂肪酶与锚定蛋白Aga2进行C端融合的重组菌株的酶活为2274.7U/g细胞干重。因此在构建TLL的表面展示体系时，选择锚定蛋白Aga2，以C端融合的方式与脂肪酶TLL相连。

最终得到的表面展示脂肪酶TLL的的重组毕赤酵母工程菌，命名为D-TLL，菌种保藏号：CCTCC M 2023046。

实施例2

本实施例构建了甜菜碱修饰的表面展示TLL的重组毕赤酵母工程菌D-TLL-betaine：

1、将实施例1中构建的重组毕赤酵母菌D-TLL接种于2mL YPD摇管，30℃，250rpm培养16-20h后接入25mL BMGY培养基，培养至OD

2、将重组毕赤酵母细胞D-TLL悬液分别与20mg/mL的戊二醛、京尼平、甜菜碱、蔗糖、葡萄糖水溶液等体积混合，于10℃旋转孵育16h。10000rpm离心5min，收集修饰后的重组毕赤酵母细胞，用蒸馏水洗涤3次，重悬并保存于蒸馏水中；

3、采用傅里叶红外光谱对修饰后的全细胞催化剂进行表征，以甜菜碱修饰为例，如图4所示，修饰后的全细胞催化剂中出现了强烈的三甲基吸收峰，因此可以确定甜菜碱成功修饰于全细胞催化剂上。

4、将修饰后的全细胞催化剂应用于催化制备生物柴油，在重复使用4次后，戊二醛修饰的全细胞催化剂的催化活力为原始酶活的51.4％，京尼平修饰后为61.6％，甜菜碱修饰后为90.2％，蔗糖修饰后为57.4％，葡萄糖修饰后为59.5％(图3)。由此可见，甜菜碱修饰的全细胞催化剂的稳定性最高，因此选择以甜菜碱修饰表面展示TLL的毕赤酵母重组菌D-TLL，获得的修饰后的全细胞催化剂命名为D-TLL-betaine。

实施例3

本实施例主要目的是测定重组毕赤酵母工程菌D-TLL和D-TLL-betaine的酶学性质：

1、D-TLL和D-TLL-betaine的疏水性

以微生物从水相进入烃相的能力为基础，对D-TLL和D-TLL-betaine的疏水性进行了评价。如图5所示，D-TLL和D-TLL-betaine具有的不同界面现象，甜菜碱修饰的细胞在正己烷层和细胞悬液之间有明显的气泡，说明其具有更高的疏水性。

2、D-TLL和D-TLL-betaine的热稳定性

在65℃下分别预孵育D-TLL和D-TLL-betaine全细胞120min，每30min取样测定酶活。未经过处理的全细胞酶活力定义为100％。如图6所示，在前30min内，D-TLL和D-TLL-betaine的酶活性均迅速下降。然后，D-TLL-betaine的酶活性在30min至60min之间趋于平稳，120min后仍保持其初始活性的54.8％，而D-TLL仅保持其初始活性的45％。

3、D-TLL和D-TLL-betaine的甲醇耐受性

将D-TLL和D-TLL-betaine全细胞分别在40％(v/v)甲醇中孵育7小时，每1h取样测定酶活，分析其甲醇耐受性。如图7所示，D-TLL-betaine的酶活性衰减曲线与D-TLL一致。D-TLL-betaine培养4h后，相对酶活性始终比D-TLL高10％，孵育7h后，D-TLL-betaine酶活性为初始酶活性的50.9％，D-TLL的相对酶活性则下降至41.6％。

通过测定甜菜碱修饰前后的全细胞催化剂的酶学性质，发现甜菜碱修饰提高了全细胞催化剂的疏水性、热稳定性、甲醇耐受性，这些性质有利于提高全细胞催化剂在催化制备生物柴油过程中的稳定性。

实施例4

本实施例公开了一种全细胞催化剂催化制备生物柴油的工艺：

为了充分利用所构建的全细胞催化剂D-TLL-betaine，根据其性质设计了反应过程，以期提高反应效率。

1、于25mL茄形瓶中加入3g麻风树籽油，适当D-TLL-betaine菌体，一次性加入一定量甲醇，置于水浴摇床中，180rpm反应24h。其中，分别测试了脂肪酶添加量(30-120U/g)、含水量(10-50wt％)、醇油比(3:1-7:1)和温度(30-45℃)对生物柴油得率的影响。

2、生物柴油得率采用气相色谱(GC，Aglilent 7890A)分析，配备DB-WAX毛细管柱，FID检测器。以10mg/mL的十七烷酸甲酯为内标物。

对于不同的环境因素对生物柴油得率的影响进行验证和优选，设置如下：

对于含水量进行优选：设置温度为40℃，加酶量为30U/g，分3次(间隔12h)流加甲醇，醇油摩尔比为4:1，含水量依次为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％进行实验，得到的生物柴油得率如表1和图9所示。

对于脂肪酶添加量进行优选：设置含水量为20％，分3次(间隔12h)流加甲醇，醇油摩尔比为4:1，反应温度为40℃，脂肪酶添加量分别设置为30U/g、50U/g、70U/g、90U/g、120U/g、进行实验，得到的生物柴油得率如表1和图9所示。

对于温度进行优选：设置含水量为20％，加酶量为70U/g，分3次(间隔12h)流加甲醇，醇油摩尔比为4:1，温度依次为30℃、35℃、40℃、45℃，得到的生物柴油得率如表1和图9所示。

对于醇油摩尔比进行优选：设置含水量为20％，加酶量为70U/g，温度为40℃，一次性加入醇油比依次为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1，得到的生物柴油得率如表1和图9所示。

表1反应条件对生物柴油得率的影响

注：对含水量、加酶量、反应温度进行优选时，表1中生物柴油得率为反应72h后测得。在对醇油比进行优选时，表1中生物柴油得率为反应24h后测得。

由表1和图9可得，单自变量实验表明的优选自变量为脂肪酶添加量为70U/g，含水量为20wt％，一次性添加醇油摩尔比为6:1的甲醇，反应温度为40℃。

当脂肪酶添加量为70U/g，含水量为20wt％，一次性添加醇油摩尔比为6:1的甲醇，反应温度为40℃时生物柴油的得率最高，反应12h，生物柴油得率达到92.6％。反应条件优化后，在较短的反应时间内获得了较高的生物柴油得率。

3、对D-TLL-betaine进行重复使用次数的测定，进行如下操作：

(1)将反应结束后的反应体系转移到离心管中，12000rpm离心5min，上层油相用于生物柴油得率分析，取出菌体；

(2)用蒸馏水洗涤菌体3次，加入到新鲜反应体系中，在最优条件下反应12h；

(3)重复上述操作，测定每次反应生物柴油得率，以第一次反应为100％。结果如图8所示，4次重复使用后，D-TLL-betaine保持90.2％的催化活力；8次重复使用后，仍存在61.6％的酶活力。

实施例5

本实施例公开了以不同来源的油脂为原料，实施例2中制得的甜菜碱修饰的全细胞催化剂D-TLL-betaine在催化制备生物柴油中的效果：

1、于3个25mL茄形瓶中加入3g油脂原料，分别为光皮树油，菜籽油，废弃油脂。

2、按照以下反应条件：向油脂原料中按照如下用量添加脂肪酶：脂肪酶添加量为70U/g，含水量为20wt％，然后一次性添加醇油摩尔比为6:1的甲醇，甲醇加入后设定反应温度为40℃，进行反应，反应12h后取样进行生物柴油得率的测定。

3、生物柴油得率采用气相色谱(GC，Aglilent 7890A)分析，配备DB-WAX毛细管柱，FID检测器。以10mg/mL的十七烷酸甲酯为内标物。如图10所示，在分别以光皮树油、菜籽油、废弃油脂为原料时，生物柴油得率分别为90.44％、87.46％、78.42％，说明所构建的甜菜碱修饰的全细胞催化剂D-TLL-betaine可以应用于多种油脂原料，具有普适性。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。