一种鞭式节丛孢液体发酵产生厚垣孢子的方法及其应用

技术领域

本发明属于动植物寄生线虫病生物防治用真菌培养技术领域，具体涉及一种鞭式节丛孢（

背景技术

寄生线虫每年给农业生产和畜牧业造成重大损失。生物防治是防控寄生线虫的有效手段之一。捕食线虫真菌作为植物寄生线虫的天敌，是线虫生物防治的重要资源。目前由捕食线虫真菌开发的线虫生防制剂主要是由菌丝及分生孢子制成，存在不稳定、货架期短的问题。真菌厚垣孢子抗逆性强，内含丰富的内源营养，容易在土壤中定殖，由厚垣孢子制成的生防制剂具有耐储藏、稳定性高、货架期长等优点，可以弥补现有线虫生防制剂的不足。

鞭式节丛孢（

目前仅有一篇关于该菌液体培养产生厚垣孢子的文献（常凡凡，黄海岩，蔺国珍，刘新宇，赵天宇，李凤迪，蔡葵蒸，食线虫性真菌

该文献中公开了：以

发明内容

本发明为了解决目前还没有一种捕食线虫真菌液体培养大量产生厚垣孢子的培养基，因而无法满足工业化生产要求等问题，提供了一种鞭式节丛孢液体发酵产生厚垣孢子的方法及其应用。

本发明由如下技术方案实现的，一种鞭式节丛孢液体发酵产生厚垣孢子的方法，所述鞭式节丛孢（

所述鞭式节丛孢（

进一步的，液体发酵培养基为：10g/L葡萄糖、3g/L NaNO

具体方法为：

（1）活化菌种：鞭式节丛孢（

（2）制备液体种子：收集步骤（1）所得活化菌种的菌丝，将其接种于PDB培养基中，28℃、180 rpm恒温摇床培养2-3天得到液体种子；

（3）发酵产生厚垣孢子：以液体发酵培养基的体积为计算基准，步骤（2）所制备的液体种子按体积比为10%-30％的接种量接入液体发酵培养基中，于28℃、80-150 rpm的恒温摇床中培养72-96h得到富集厚垣孢子的发酵液。

步骤（1）中将长满菌丝的鞭式节丛孢（

步骤（2）中活化的菌丝接种于PDB培养基中。

进一步的，步骤（3）中液体种子按体积比为15％的接种量接入液体发酵培养基中。

本发明还提供了所述方法获得的鞭式节丛孢厚垣孢子在动植物寄生线虫防治中的应用。

本发明中，鞭式节丛孢（

本发明所述方法可以显著缩短鞭式节丛孢（

本发明所述菌株：鞭式节丛孢（

附图说明

图1为鞭式节丛孢（

图2为实施例1中鞭式节丛孢（

图3为实施例2中鞭式节丛孢（

图4为实施例3中鞭式节丛孢（

图5为实施例4中鞭式节丛孢（

图6为实施例5中鞭式节丛孢（

实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：菌种活化及培养：用打孔器（直径8mm）在长满鞭式节丛孢（

种子制备：用灭菌的解剖刀刮取培养基表面的菌丝，收集10mg菌丝（湿重），将其接种在250mL的锥形瓶中（含有100mL的PDB培养基），于28℃、180 rpm的恒温摇床中培养3天得到液体种子。

液体发酵培养基I配方：蔗糖（10g/L）、NaNO

厚垣孢子制备：将种子按10%(v/v)的接种量接入250mL的锥形瓶中（含有100mL的液体发酵培养基I），于28℃、80rpm的恒温摇床中培养72h，使用血球计数板统计厚垣孢子数量。厚垣孢子的扫描电镜图如图1所示，光学显微镜图如图2所示，结果显示，该条件下产生的厚垣孢子的数量可以达到8.11×10

实施例2：菌种活化及培养方法同实施例1所述方法。

种子制备：用灭菌的解剖刀刮取培养基表面的菌丝，收集50mg菌丝（湿重），将其接种在250mL的锥形瓶中（含有100mL的PDB培养基），于28℃、180 rpm的恒温摇床中培养96h得到液体种子。

液体发酵培养基II配方：葡萄糖（10g/L）、NaNO

厚垣孢子制备：将种子按15%(v/v)的接种量接入250mL的锥形瓶中（含有100mL的液体发酵培养基II），其余方法同实施例1所述方法，厚垣孢子的光学显微镜图如图3所示，结果显示，该条件下产生的厚垣孢子的数量可以达到9.51×10

实施例3：菌种活化及培养方法同实施例1所述方法。

种子制备：用灭菌的解剖刀刮取培养基表面的菌丝，收集100mg菌丝（湿重），将其接种在250mL的锥形瓶中（含有100mL的PDB培养基），于28℃、180rpm的恒温摇床中培养96h得到液体种子。

液体发酵培养基III配方：蔗糖（30g/L）、NaNO

厚垣孢子制备：将种子按20%(v/v)的接种量接入250mL的锥形瓶中（含有100mL的液体发酵培养基III），其余方法同实施例1所述方法，厚垣孢子的光学显微镜图如图4所示，结果显示，该条件下产生的厚垣孢子的数量可以达到8.82×10

实施例4：菌种活化及培养方法同实施例1所述方法。

种子制备：用灭菌的解剖刀刮取培养基表面的菌丝，收集100mg菌丝（湿重），将其接种在250mL的锥形瓶中（含有100mL的PDB培养基），于28℃、180 rpm的恒温摇床中培养72h得到种子。

液体发酵培养基IV配方：葡萄糖（30g/L）、NaNO

厚垣孢子制备中采用的培养基为液体发酵培养基IV，其余方法同实施例1所述方法。厚垣孢子的光学显微镜图如图5所示，结果显示，该条件下产生的厚垣孢子的数量可以达到8.41×10

实施例1-4中诱导培养基中碳源与氮源以及接种量、与厚垣孢子数量见表1。

表1

结合表1，显然，当碳源为蔗糖时，碳源、氮源含量以及接种量均提高，发酵液中厚垣孢子数量增加不显著。而将碳源替换为葡萄糖后，低含量碳源下，氮源含量提高，接种量提高至15%v/v，发酵液中厚垣孢子数达到最高。结合降低生产成本，选择10g/L葡萄糖作为液体发酵培养基的碳源、3g/L NaNO

本发明从种子接种到富集到大量厚垣孢子的发酵液，仅需要3天，显著缩短鞭式节丛孢（

实施例5：将发酵的厚垣孢子离心浓缩，用灭菌的可溶性淀粉为吸附载体，与厚垣孢子充分混合，经真空冷冻干燥后研磨，获得厚垣孢子粉剂，将其分别在4℃和25℃下储存，每月定期取样，用稀释涂布法在WA培养基上测定其萌发率及对南方根结线虫（

结果显示，在4℃和25℃下储存到第4个月厚垣孢子的萌发率仅下降约2%（图6A），并且保持着对南方根结线虫（

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。