与美洲南瓜种子粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，具体涉及与美洲南瓜种子粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及应用。

背景技术

美洲南瓜(Cucurbita pepo，2n＝40)是葫芦科南瓜属的三大栽培种之一，具有重要的经济价值。南瓜籽中不但含有蛋白质和油脂，还含有丰富的矿物质、植物甾醇、类胡萝卜素等营养物质。据研究发现南瓜属物种的种子具有保健和药用的价值，具有降血脂、治疗良性前列腺增生症、降血压、抗炎镇痛等药用功能。近些年，南瓜籽及相关制品已经成深受消费者喜欢的安全代表食品之一。因此，研究和利用种子相关性状，有利于培养优质种质和加速南瓜属种业的发展。

南瓜属种子粒长是一种典型的数量性状，由多个基因共同调控，其遗传机理相对复杂。谭行之等利用印度南瓜纯系大粒材料‘0515-1’和小粒材料‘0460-1-1’为亲本，构建的193个F

本发明以美洲南瓜自交系‘379’为母本，美洲南瓜自交系‘296’为父本，配制杂交组合构建F2群体与F2：3群体，使用SSR标记构建美洲南瓜遗传连锁图谱，进行种子相关性状的QTL定位与分析，开发了一个稳定的新位点。本发明将为南瓜相关性状的改良及分子辅助育种提供依据，同时为控制南瓜种子性状的相关基因的分离与克隆奠定了基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与美洲南瓜种子粒长主效QTL紧密连锁的分子标记。

本发明目的之二在于提供一种上述分子标记在在美洲南瓜种子粒长遗传改良中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种美洲南瓜种子粒长性状/品种的判定方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种与美洲南瓜种子粒长主效QTL紧密连锁的分子标记，所述的分子标记位于南瓜的9号染色体上，扩增所述分子标记的引物对的上游引物和下游引物分别为：

Cpe-M131F：CTCTTCGCAGACATGTCCAA(SEQ ID NO.1所示)；

Cpe-M131R：CTCCATCTGCTTCGACTTCC(SEQ ID NO.2所示)。

本发明还提供了与美洲南瓜种子粒长紧密连锁的分子标记引物的应用。该标记可用于美洲南瓜种子粒长的分子标记辅助育种，用于美洲南瓜种子粒长遗传改良，通过提取美洲南瓜苗期的DNA，并检测是否存在本发明的标记，进而来筛选美洲南瓜品种种子粒长的性状。具体的可以使用上述的本发明的分子标记引物，所述检测可以是PCR扩增检测条带带型，也可以通过对PCR产物进行测序检测。即，利用该分子标记通过进一步的PCR扩增产物片段大小在出芽期或苗期即可判定南瓜品种种子粒长性状，从而加快育种进程。

本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来判定南瓜品种。具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

本发明还公开了一种美洲南瓜种子粒长性状/品种的判定方法，所述判定方法包括如下步骤：

(1)提取待测美洲南瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物对进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；

(3)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物为如SEQ ID NO.3所示的长度为247bp的特征条带，则该待测美洲南瓜种子较长，如果PCR扩增产物为如SEQ ID NO.4所示的长度为262bp的特征条带，则该待测美洲南瓜种子较短；如果PCR扩增产物既有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为247bp的特征条带，又有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为262bp的特征条带，则该待测美洲南瓜种子为中长型。

其中，PCR扩增的反应体系如下：PCR扩增体系为10uL，包括模板DNA 1uL，前后引物各0.5uL，Taq酶5uL，ddH2O 3uL。

PCR扩增程序：采用Touchdown PCR进行扩增；

/>

另外，包含上述引物对的试剂盒，可以用来鉴定南瓜材料种子长度性状，具体应用时，可以选择含有上述分子标记引物对的试剂做成试剂盒。再者，利用所述试剂盒可以用于鉴定或者辅助鉴定美洲南瓜种子的基因型。上述这些应用均可以按照常规的方法进行。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。

本发明的优点：

(1)本发明中与美洲南瓜种子粒长主效QTL紧密连锁的分子标记与美洲南瓜种子粒长主效QTL紧密连锁，可应用于种子粒长分子标记辅助育种，应用于美洲南瓜种子的种质资源筛选，应用于美洲南瓜种子的遗传改良。

(2)本发明的分子标记具有检测便捷、扩增产物稳定、特异性高的特点，可以快速、高通量地应用于美洲南瓜育种实践以及新品种的选育。

附图说明

图1为美洲南瓜遗传连锁图谱；

图2为双亲与F1的种子表型图；

图3为美洲南瓜种子粒长主效QTL定位图谱分析；

图4为分子标记Cpe-M131在亲本和群体中的验证图；

图中M表示DNAmarker，P1表示母本‘379’，P2表示父本‘296’，1-41表示不同的F2群体株系，基因型与母本相同读作“A”，基因型与父本相同读作“B”，基因型与F1相同读作“X”。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1与美洲南瓜种子粒长紧密连锁的分子标记开发

1.1实验材料与性状调查

以美洲南瓜自交系‘379’(引种编号：V05B0381)和美洲南瓜自交系‘296’(引种编号；V05B0372)两个材料为亲本，两份材料为河南农业大学瓜类课题组引种(国家农作物种质资源平台-蔬菜种质资源子平台，北京)，并经过多代(4-5代)的自交，性状遗传稳定。

田间实验于2019年3月到2021年7月份进行，采用常规的田间管理措施，种植210株F

1.2DNA提取与分子标记

采用CTAB法提取嫩叶的DNA，并利用亲本和F

1.3，遗传连锁图谱的构建与QTL定位

以F

QTL分析使用IciMapping V4.1进行，通过1000次重复置换测验，估算基因组范围内α＝0.05水平上的LOD阈值。以LOD＞2.5为可检测QTL位点存在的阈值，采用完备区间作图法，以1.0cM步行速度在全基因组内进行扫描。

1.4结果与分析

利用IciMapping V4.1软件的完备区间作图法，整合F

表1美洲南瓜种子粒长性状的QTL分析

用于扩增与主效QTL位点连锁的Cpe-M131标记的引物序列设计如下：

Cpe-M131F：CTCTTCGCAGACATGTCCAA；

Cpe-M131R：CTCCATCTGCTTCGACTTCC。

实施例2与美洲南瓜种子籽粒长度紧密连锁的分子标记在美洲南瓜育种中的应用

以拥有大粒种子美洲南瓜自交系‘379’为母本，以拥有小粒种子美洲南瓜自交系‘296’为父本。杂交获得F1代，F1代自交获得F

提取两亲本、F1与F2分离群体的DNA备用。

分别以提取样本的DNA为模板进行PCR扩增，以获得与美洲南瓜种子籽粒长度主效QTL位点F

Cpe-M131F：CTCTTCGCAGACATGTCCAA；

Cpe-M131R：CTCCATCTGCTTCGACTTCC；

PCR扩增的反应体系如下：PCR扩增体系为10uL，包括模板DNA 1uL，前后引物各0.5uL，Taq酶5uL，ddH

PCR扩增程序：采用Touchdown PCR进行扩增；

聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定PCR扩增结果：采用的引物为Cpe-M131F/SSR016913R时，当扩增出247bp的单一条带，则表示该株系的种子较长，当扩增出262bp的单一条带，则表示该株系的种子较短，当扩增出247bp和262bp的双条带时，则表示该株系的种子为中长型。

具体地：247bp条带的核苷酸组成为：ctcttcgcagacatgtccaactcctaggcggaagaagaagaagaagaagaagaagaagagcaacaacatgaacaaaaggtttagtgatgaacaaatcaggtcactggagtccatactatattcatcggattcaaagcttgattcgaggaagaaggtgcagctggcagccgagttgggactccaacctcgccagatttctgtatggtttcagaatagaagagcaagatggaagtcgaagcagatggag；

262bp条带的核苷酸组成为：ctcttcgcag acatgtccaactcctaggaggaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagagcaacaacatgaacaaaagaaggtttagtgatgaacaaatcaggtcactggagtccatattttattcatcggattcaaagcttgattcgaggaagaaggtgcagctggcagccgagttgggactccaacctcgccagatttctgtatggtttcagaatagaagagcaagatggaagtcgaagcagatggag。

结果，标记SSR016913分析的基因型与表型鉴定的结果一致。如图4所示，株系序号6、10、14、15、16、29、32、33、35、40表现母本基因型，种子表型鉴定为长粒种子。株系序号1、2、8、9、11、19、20、26、28表现为父本基因型，种子表型鉴定为短粒种子。株系序号3、4、5、7、12、13、17、18、21、22、23、24、25、27、30、31、34、36、37、38、39、41基因型表现为杂合型，种子表型鉴定为中长粒种子。由此可见，分子标记Cpe-M131可以快速筛选美洲南瓜长种子和短种子的材料，提高美洲南瓜种子相关性状的育种效率。通过对扩增的特征条带进行分析，就可判断出该材料的种子粒长性状。

综上所述，本发明筛选所得的分子标记可应用于美洲南瓜种子长度性状、基因型的辅助筛选，为美洲南瓜种子长度性状的分子标记辅助育种奠定了基础，加速美洲南瓜新品种的育种进程。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。