同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及食源性致病菌分子检测技术领域，特别是涉及一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用。

背景技术

随着经济发展和人民生活水平的大幅提高，家庭的膳食结构得到普遍改善，对各类加工食品的消费量呈明显上升趋势。根据《中国奶业质量报告2017》中数据显示：2011-2016年，全国乳制品消费量为从2480.5万吨增至3204.7万吨，年平均增长87.1万吨。伴随而来的，由食品引起的食源性致病菌危害性事件也在逐年增加，食品安全已经引起了人们和社会的普遍关注。

产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌是食品中常见的食源性致病菌。产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli)是一类可产生志贺毒素的大肠埃希氏菌,可引起包括出血性腹泻、溶血性尿毒征、肾衰竭在内的严重疾病甚至死亡,曾在世界范围内引起多起食物中毒事件。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，是一种重要的食源性致病菌，在自然界分布广。蔬菜、乳制品、海产品、肉类和禽类等食品都已被证实是单核细胞增生李斯特氏菌的传播载体。该菌的易感人群主要是孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷者感染人体后可引起李斯特氏菌病，其症状表现为脑膜炎、败血症和流产等，致死率高达20％～50％。因此，单核细胞增生李斯特氏菌是世界卫生组织(WHO)食品安全工作计划中重点检测的四大食源性致病菌之一。沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。该菌以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。其中细菌性食物中毒中70％～80％是由沙门氏菌引起的。

目前，针对上述食源性致病菌，目前的检测方法主要是以国家标准和行业标准为依据，该类标准主要是传统的培养以及生化鉴定方法，需要经过富集培养、选择性分离、形态特征观察、生化反应和血清学鉴定等过程，步骤繁琐，耗时长，特异性差、灵敏度低等缺点，且无法对人工难以培养的致病菌进行检测，难以满足现代规模化生产对检测速度的要求，不能较好的起到有效的监控和预防作用。因此，开发快速检测食源性致病菌的技术已近迫在眉睫。

近年来，随着科技的进步，免疫法和分子生物学检测技术被普遍应用到食源性致病菌的检测领域。免疫法主要包括酶联免疫吸附技术(ELISA)、酶联荧光技术、免疫胶体金技术和免疫磁珠技术等。分子检测技术主要包括常规PCR、多重PCR技术，环介导恒温扩增技术(LAMP)以及荧光定量PCR。但这些技术多少都存在一定的缺点，对食源性致病菌的快速准确检测造成了一定的影响。例如，酶联免疫吸附技术虽然特异性强，反应灵敏度高，操作简单，但由于制备单克隆抗体的高成本，使用ELISA测试各种食物样品的成本相对较高；普通PCR能够做到对致病菌的快速检测，但灵敏度低且不能对致病菌进行定量；多重PCR可以在同一个体系中检测多个目标菌，但多组引物之间的组合易相互干扰，对引物的要求也比较高；染料法荧光定量PCR虽然可对致病菌进行定量检测，但由于引物和探针设计限制，使得一次实验只能检测一种致病菌，且特异性不高。因此，开发出一种能及时、快速且准确地检测与鉴定食品中致病菌的技术对于预防由食源性致病菌引起的食品公共安全事件具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组、试剂盒和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明基于TaqMan探针法荧光定量PCR技术，针对食品中致病菌的特异性的致病基因，设计引物和荧光探针，通过优化反应体系和PCR扩增条件，开发出了能同时检测3种致病菌的高通量多重实时荧光定量PCR方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR引物组，包括如下序列：

扩增产志贺毒素大肠埃希氏菌基因wzx的引物和探针，所述引物序列如SEQ IDNO：1-2所示，所述探针序列如SEQ ID NO：3所示；

扩增单核细胞增生李斯特氏菌基因plcA的引物和探针，所述引物序列如SEQ IDNO：4-5所示，所述探针序列如SEQ ID NO：6所示；

扩增沙门氏菌基因hilA的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：7-8所示，所述探针序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明还提供一种上述的多重荧光定量PCR引物组在制备鉴定三种食源性致病菌产品中的应用。

本发明还提供一种同时检测食品中三种致病菌的试剂盒，包括上述的多重荧光定量PCR引物组。

本发明还提供一种同时检测食品中三种致病菌的多重荧光定量PCR方法，包括利用上述的多重荧光定量PCR引物组扩增待测样品目标菌株DNA的步骤。

进一步地，所述扩增的反应体系包括以下组分：2×SuperReal-time PreMix 10μL，上下游引物各0.6μL，探针各0.4μL，模板DNA各1μL，ddH

进一步地，所述扩增的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环。

本发明还提供一种如上述的多重荧光定量PCR引物组或上述的试剂盒在检测食源性致病菌中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明基于TaqMan探针法荧光定量PCR技术，针对食品中致病菌的特异性的致病基因，设计引物和荧光探针，通过优化反应体系和PCR扩增条件，开发出了能同时检测3种致病菌的试剂盒和高通量多重实时荧光定量PCR方法。

本发明提供的乳品致病菌的检测试剂盒包括用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌的引物对和探针等，能够一次性同时检测待测样品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及沙门氏菌这3种致病菌，可以在16小时以内对待测样品完成检测，大大缩短检测周期，并且检测的灵敏度可达10

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为产志贺毒素大肠埃希氏菌wzx基因单重荧光PCR扩增结果；图中对数曲线表示特异性扩增曲线；

图2为单核细胞增生李斯特氏菌plcA基因单重荧光PCR扩增结果；图中对数曲线表示特异性扩增曲线；

图3为沙门氏菌hilA基因单重荧光PCR扩增结果；图中对数曲线表示特异性扩增曲线；

图4为产志贺毒素大肠埃希氏菌PCR引物特异性实验结果(模板包含17种非目标菌)；图中对数曲线表示产志贺毒素大肠埃希氏菌wzx基因特异性扩增曲线；

图5为单核细胞增生李斯特氏菌PCR引物特异性实验结果(模板包含17种非目标菌)；图中对数曲线表示单核细胞增生李斯特氏菌plcA基因特异性扩增曲线；

图6为沙门氏菌PCR引物特异性实验结果(模板包含17种非目标菌)；图中对数曲线表示沙门氏菌hilA基因特异性扩增曲线；

图7为产志贺毒素大肠埃希氏菌灵敏度检测结果；对数扩增曲线1-6分别表示10

图8为单核细胞增生李斯特氏菌灵敏度检测结果；对数扩增曲线1-5分别表示10

图9为沙门氏菌灵敏度检测结果；对数扩增曲线1-6分别表示10

图10为二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线1为单增李斯特菌致病基因plcA对数扩增曲线，曲线2为产志贺毒素大肠埃希氏菌wzx基因对数扩增曲线；

图11为二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线1为单增李斯特菌致病基因plcA对数扩增曲线，曲线2为沙门氏菌hilA基因对数扩增曲线；

图12为二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线1为产志贺毒素大肠埃希氏菌wzx基因对数扩增曲线，曲线2为沙门氏菌hilA基因对数扩增曲线；

图13为产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌三重荧光PCR扩增结果；对数扩增曲线1-3分别代表产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1三种食源性致病菌的扩增引物和探针的特异性评估

1.1菌株

本发明所用菌株详细信息请见表1：

表1菌株名称及来源

1.2试剂和仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝试剂有限公司)、pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(艾德莱生物科技有限公司)、SuperReal荧光定量预混试剂(北京天根生化科技有限公司)、DH5α感受态(北京天根生化科技有限公司)、平板计数琼脂(翌圣生物科技有限公司)、LB液体培养基为本实验室保存。

荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司，型号CFX-96)，台式离心机(Himac公司)，高压蒸汽灭菌锅(发恩科贸)，超微量高精度紫外/可见光光度计(美国DeNovix公司)。

1.3引物和探针

通过Blast和MegAlign程序比对和筛选，确定产志贺毒素大肠埃希氏菌O抗原特异性基因wzx(GenBank:NC_002695.)，单核细胞增生李斯特氏菌磷脂酶C基因plcA(GenBank:NC_003210.1)和沙门氏菌毒力基因hilA(GenBank:NC_003197.2)序列为模板，利用Primer5.0设计特异性引物，分别命名为wzx-F和wzx-R、plcA-F和plcA-R、hilA-F和hilA-R。

利用设计好的引物首先进行普通PCR扩增，产物经过凝胶电泳检测、测序比对确认之后，采用Primer 5.0根据扩增片段的苷酸序列设计探针，并添加荧光基团和猝灭基团。PCR引物和探针均委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。三组引物和探针名称及序列详见表2：

表2三组引物和探针名称及序列

1.4引物和探针特异性检测实验

分别量取2mL表1中所包含的18标准菌株的增菌液(平板计数法测定菌含量10

(1)分别以三种致病菌的基因组DNA为模板，用相对应的引物和探针分别进行单重荧光定量PCR扩增。其反应体系具体组成如表3所示，扩增条件为95℃15min→(95℃3s→60℃30s)×40个循环。

表3单重荧光PCR扩增体系

各组引物和探针经过优化组合，确定其最终使用浓度分别为：wzx引物对和探针浓度分别是10μmol/L和10μmol/L，plcA引物对和探针分别是10μmol/L和10μmol/L，hilA引物对和探针分别是7.5μmol/L和10μmol/L。相对应的扩增结果如图1、图2和图3显示，3对引物和探针都能针对各自致病菌的靶基因呈现对数扩增曲线，且Ct值均小于32，表明各引物和探针组是可以作为检测各目标致病菌使用的。

(2)分别以3种目标菌和表1中其余的15种非目标菌的混合DNA为模板，根据优化后的反应体系，分别利用wzx-F、wzx-R和wzx-P，plcA-F、plcA-R和plcA-P，hilA–F、hilA-R和hilA-P进行定量PCR扩增。反应体系如表4所示，扩增条件同上。

表4特异性实验PCR扩增体系

结果如图4、图5和图6所示，各引物和探针只引起相应靶基因出现特异性对数扩增，且扩增曲线呈典型的S型，其他非目标菌均无任何非特异性扩增曲线，表明3对引物和探针具有良好的特异性，可满足后续三重荧光定量PCR体系的建立。

实施例2试剂盒检测灵敏度测定实验

吸取实施例1.4中提取的目标致病菌基因组DNA各1μL(原菌液浓度10

依据检测灵敏度一般判定标准，当Ct值≤32时可判断荧光定量PCR的检测呈阳性。如图7、图8和图9所示，本实验中当菌液浓度为10

实施例3三重荧光定量PCR检测方法的建立

3.1二重荧光定量PCR检测方法的建立

为了构建产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌的三重荧光定量PCR体系，首先将三种目标致病菌进行两两随意组合，共包含3组组合，以验证引物之间的兼容性。具体实施方法如下所述：

以实施例1.4中提取的产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌DNA为模板，3个靶基因wzx、plcA、hilA间的二重荧光定量PCR反应体系组成成分见表5。在PCR管中依次加入各组分，总反应体系为20μL，在荧光定量PCR仪上进行扩增反应，扩增条件同实施例1.4。

表5二重荧光定量PCR反应体系

经过优化，优选的各引物和探针组的最终使用浓度分别为：wzx引物对和探针浓度分别是10μmol/L和10μmol/L，plcA引物对和探针分别是10μmol/L和10μmol/L，hilA引物对和探针分别是7.5μmol/L和10μmol/L。

结果如图10，图11和图12所示，3种目标致病菌，即产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌的基因组DNA模板及其配套的特异性引物和探针两两组合进行荧光定量PCR扩增反应，都有相应特异性对数扩增曲线，各扩增曲线的Ct值均小于32，且无非特异性对数扩增曲线，说明根据三种致病菌相应的靶基因设计的三对引物和探针可以兼容，可以用于后续三重荧光定量PCR体系的构建。

3.2三重荧光定量PCR检测方法的建立

以产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌的基因组混合DNA为模板，在同一反应体系中同时加入wzx-F、wzx-R和wzx-P，plcA-F、plcA-R和plcA-P，hilA–F、hilA-R和hilA-P三组引物和探针，进行三重荧光定量PCR扩增。总反应体系为20μL，扩增条件同1.4，反应体系如表6所示：

表6三重荧光定量PCR体系

经过优化，确定各引物和探针组的最终使用浓度分别为：wzx引物对和探针浓度分别是10μmol/L和10μmol/L，plcA引物对和探针分别是10μmol/L和10μmol/L，hilA引物对和探针分别是7.5μmol/L和10μmol/L。

结果如图13所示，在同一反应体系中，三种致病菌均呈现特异性的扩增曲线，且呈典型的S型，其中产志贺毒素大肠埃希氏菌Ct值为19.5，单核细胞增生李斯特氏菌Ct值为16.4，沙门氏菌为Ct值16.1，均无非特异性扩增曲线，说明本试剂盒建立的三重荧光定量PCR检测方法具有良好的检出效果。

实施例4试剂盒应用于实际样品的检测

为了验证本试剂盒中三重荧光定量PCR检测方法的可靠性和实用性，本实施例中将采用本发明提供的三重荧光定量PCR方法和国标法两种检测手段，对实际样品进行目标致病菌的检测和比较。

4.1样本采集

采集18份来自不同超市的乳制品，主要包括牛奶，奶粉以及奶酪各6份。这些样品首先经国标法检测以确定不含有目标致病菌。然后，利用目标致病菌污染样品，然后放置37℃恒温培养箱，震荡培养16h，作为待测样品。

以上操作均在无菌超净台进行，所用器材均经高压灭菌。

4.2检测方法

18种待测样品中的三种目标致病菌均采用本试剂盒提供的三重荧光定量PCR检测方法进行检测。作为比较，沙门氏菌按照国标GB 4789.4-2016中沙门菌的检测方法行检测，单核细胞增生李斯特氏菌按照GB 4789.30-2010中食品安全国家标准食品微生物学检测方法检测，产志贺毒素大肠埃希氏菌按照国家标准《致泻大肠埃希氏菌检验》进行检测。

4.3结果分析

分别对三重荧光定量PCR和国标法对18份被人工接种目标致病菌感染的食品样品的检测结果进行比较分析，如表7所示，三重荧光定量PCR检测方法对接菌培养的18个乳制品样品的检测结果同国标法检测结果一致，符合率达100％，说明三重定量PCR法检测效果能达到国标法检测水平。但从检测效率和操作流程等方面比较，荧光定量PCR检测方法检测周期短、效率高，操作简单，可在同一体系下同时检测多种致病菌，适用于规模化生产的食品检测，具有重要的使用价值。

表7荧光定量PCR与国标法检测结果比较

表7中，A代表产志贺毒素大肠埃希氏菌，B代表单核细胞增生李斯特氏菌，C代表沙门氏菌，“+”代表阳性，“-”代表阴性。由表7的检测数据可知，采用菌株分离培养法检测乳品样品(牛奶、奶粉和奶酪)的阳性检出率为100％，采用三重荧光定量PCR检测方法检测乳品样品(牛奶、奶粉和奶酪)的阳性检出率也为100％，两种方法的检测结果完全相符，符合率为100％。与传统的菌株分离培养法相比，本申请的三重荧光定量PCR检测方法的操作简易、检测周期短(24h内)、可一次性同时检测产志贺毒素大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌3致病菌，检测效率高、灵敏度高、特异性好、具有很高的应用价值。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。