一种用于制备超低分子铁皮石斛多糖的固定化复合酶及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及固定化酶技术领域，尤其是涉及一种用于制备超低分子铁皮石斛多糖的固定化复合酶及其制备方法和应用。

背景技术

传统名贵中草药铁皮石斛是中医学临床上的常见名录品，人们历经多年指称具有滋阴生津、养目补体、润肤增肌、补脾益胃、护肝利胆、强身健体、增强免疫、降低血糖等有益功效，其富含多类成分包括：氨基酸、生物碱、生物多糖、油脂、倍半萜类、黄酮类、菲类、甾体等活性成分。由于市场需求在日益增长，而铁皮石斛生长环境要求高，造成野生资源日渐稀缺，供需仍旧未平衡。人工仿野生种植不仅振兴乡村农业经济，同时逐步提升产量，然而品质优良的铁皮石斛种植周期一般在两年左右，更甚可达三年，对种植户和产业链带来不少的成本压力，因此有效提高铁皮石斛利用率和产品价值成为非常关键的环节。

天然产物多糖是由于大分子结构中糖单元排列方式不同，产生不同的药理活性。单糖及单糖以相同线型架构排列的糖物质，没有三维立体结构，在酶分解下提供人体需要的能量。生物多糖是空间结构上有支链链接并形成三维构造，不会马上被人体消耗，从而能够接触细胞膜，产生药理功效。铁皮石斛生物质多糖是石斛提供活性功效的主要有益成分，常作为铁皮石斛制品或衍生产品的目标提取物。研究人员整理出国内石斛多糖药理活性和化学结构，石斛多糖具有(1)免疫增强作用、(2)抗肿瘤活性、(3)抗氧化活性、(4)降血糖及胰岛修复、(5)抗白内障功效。其中铁皮石斛多糖分子量分布在十几万到百万道尔顿，主链是由β-1,3-D-甘露吡喃糖基和β-1,4-D-葡萄吡喃糖基组分重复构成，为O-乙酰葡萄甘露聚糖。

多糖类物质分子量较小、分支程度低的多糖类在水中有一定的溶解度，加热情况下更容易溶解，在分子量大、分支程度高的情况下水中溶解性低，与单糖的亲水性差别较大。天然产物多糖如铁皮石斛多糖的分子量分布高达几十上百万道尔顿，进入水相后，以无规线团的形式存在，糖苷键的选择性构型导致多糖溶于水后黏度大，更甚则形成凝胶，难以构成均相水溶液，因而利用率较低。

目前，铁皮石斛多糖提取方法多见为水提法、有机醇提法、生物酶提法。水提法以水为溶剂，热水浸提或冷水浸提，部分水溶性多糖可以由此获取，植物多糖常见热水浸提。水提法的缺点在于温度高、耗时长、提取率低。有机醇提法与水提法相类似，但生物大分子多糖不溶于乙醇，因而可通过沉淀将多糖提纯出来。醇提法的缺点在于消耗大量有机溶剂，提取效率有限，耗时长，无法快速大量获取。

生物酶提法是利用生物酶催化活性高，针对性催化破坏原料，提升多糖提取率，且生物酶提法可以避免有机溶剂的使用，得到的铁皮石斛多糖更安全。但生物酶提法仍存在以下缺点：生物酶提法使用的游离酶容易受到本身活力影响催化效果，在温度较高的氛围下容易失活，或受工作环境的杂质干扰，降低提取速率。游离酶提取铁皮石斛多糖会由于多糖分子量大且黏度大，酶活动受限导致其催化效率降低，或部分酶活性被损伤，乃至失活，无法顺利完成多糖提取。再者，游离酶提取法的铁皮石斛粗多糖的分子量分布于几十上百万道尔顿，水溶解性低，黏度大，大分子量多糖难以与人体内功能受体实现合理性结合或达到功效。更进一步，游离酶在工业应用中常常受到操作稳定性低、难以重复利用、回收困难等特点，使得生物酶提法提取铁皮石斛多糖无法实现工业化生产。

发明内容

本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种固定化复合酶及其制备方法和应用。本申请制备的固定化复合酶在不同温度下的热稳定性、耐盐性均较佳，其固定化复合酶可以重复使用，解决了游离酶难回收等问题，有利于实现生物酶提法提取铁皮石斛多糖工业化生产。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：

第一方面，本申请提供了一种固定化复合酶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将γ-环糊精加入至含有氢氧化钾、钾盐的水溶液中，混合均匀后经微波反应，得到混合物A；

S2：对所述混合物A进行加热、搅拌，搅拌过程中加入醇类溶剂，继续搅拌反应，冷却至室温，得到混合物B；

S3：在所述混合物B中加入亲水性聚合物，混合均匀，静置后所得析出物为固定化酶载体材料；

S4：将黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纤维素酶用缓冲溶液溶解，得到混合酶溶液A，将努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶用缓冲溶液溶解，得到混合酶溶液B；

S5：将步骤S3的所述固定化酶载体材料加入至所述混合酶溶液A中搅拌混合，然后再加入所述混合酶溶液B搅拌混合，所得沉淀物为用于制备超低分子铁皮石斛多糖的固定化复合酶。

本申请制备一种由γ-环糊精为主体组成的固定化酶载体材料，具有耐温多孔保护功能，可以减少酶的损失和酶活性衰减；其中，环糊精与钾离子合成的MOF材料作为固定化酶载体材料，钾是作为MOF材料的离子，环糊精是作为MOF材料的配体。

本申请使用黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶形成复合酶，通过固定化酶载体材料负载形成固定化复合酶，使用上述的固定化复合酶对铁皮石斛进行酶解提取，得到的超低分子石斛多糖在粗多糖的占比高。

本申请提供了一种固定化复合酶，解决传统游离酶耐热性差，高温易失活的问题，实现在高温的条件下用生物酶解法提取铁皮石斛多糖，提高铁皮石斛多糖的提取物效率，大大缩短铁皮石斛多糖的提取时间，增加铁皮石斛多糖的产量。

其中步骤S5，酶溶液与固定化酶载体材料的加入顺序对最终产品的固定化效果和酶解效果有很大影响，酶溶液与固定化酶载体材料的混合顺序影响着酶进入载体的时间和位置。本申请中先让黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纤维素酶与载体混合，随后再加入努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶，即黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纤维素酶先进入至载体材料的内部，努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶在外部，总体上看，不同的酶形成了内外包裹的结构，有利于提高固定化复合酶的稳定性、固载率和提高超低分子铁皮石斛多糖的产率。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶形成的复合酶与所述固定化酶载体材料的质量比为0.16：(0.8～1.2)，优选为0.16:1。

固定化酶载体材料与复合酶的质量比影响到复合酶的包裹效果以及固定化效果，最终影响到酶的热稳定性。采用上述质量比有利于提高复合酶的固定化效果，以提高固定化复合酶的热稳定性。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶的质量比为(3～5)：(2～4)：(2～4)：(4～8)，优选质量比为4：3：3：6。

本申请使用黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶与纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的菌种发酵液经过定量培养后获得产物酶与中性蛋白酶进行两两混配，在配比为(3～5)：(2～4)：(2～4)：(4～8)条件下的固定化复合酶对铁皮石斛进行提取，得到的超低分子石斛多糖在粗多糖的占比高。

在上述四种酶加入的情况下，复合酶在固定化酶载体材料中的配合较紧密，与载体材料的相互作用较强，最终产品的酶活力更高、耐盐性更好，四种酶的配比发生变化、或是缺少其中一种酶、或是四种酶进入的顺序不同，均会使得酶与载体材料的相互作用发生变化，导致固定化复合酶的酶活力变差、耐盐性较差。

所述努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶的制备方法为：

(1)用接种环挑取努比卤地无氧芽胞杆菌落至液体培养基中，于55-63℃，100-200rpm条件下培养36-60h，得到努比卤地无氧芽胞杆菌种子液。

(2)将所述努比卤地无氧芽胞杆菌种子液以0.2-0.5％的接种量接种至固体发酵培养基中，于28-35℃下静置培养48-96h，期间每隔24h翻料一次，得到发酵曲料。

(3)称取8-15％的发酵曲料于pH＝5.0-6.0的醋酸缓冲液，在32-38℃、100-200rpm下搅拌0.5-2h，过滤后得到滤液。

(4)在所述滤液中加入20-40％的(NH

优选地，所述努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶的制备方法为：

(1)用接种环挑取努比卤地无氧芽胞杆菌落至液体培养基中，于58℃，150rpm条件下培养48h，得到努比卤地无氧芽胞杆菌种子液。

(2)将所述努比卤地无氧芽胞杆菌种子液以0.3％的接种量接种至固体发酵培养基中，于32℃下静置培养72h，期间每隔24h翻料一次，得到发酵曲料。

(3)称取10％的发酵曲料于pH＝5.6的醋酸缓冲液，在35℃、150rpm下搅拌1h，过滤后得到滤液。

(4)在所述滤液中加入30％的(NH

所述液体培养基的制备方法为(以制备1L为例)：蛋白胨4.0-6.0g，牛肉浸取物2.0-4.0g，NaCl 4.0-6.0g，琼脂13.0-20.0g，MnSO

所述固体发酵培养基的制备方法为：以质量百分比计，28-35％麸皮，6-10％豆饼粉，1.2-2.0％铁皮石斛茎粉，0.3-0.7％(NH

优选地，所述液体培养基的制备方法为(以制备1L为例)：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，MnSO

优选地，所述固体发酵培养基的制备方法为：以质量百分比计，32％麸皮，8％豆饼粉，1.6％铁皮石斛茎粉，0.5％(NH

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤S1中，所述氢氧化钾、钾盐、γ-环糊精的摩尔浓度比为(2～8)：(2～8)：1，优选为4：4：1；微波反应的时间为12～17min，优选为15.2min；所述微波反应的功率为500～800W，优选为600W。

微波反应的时间影响到固定化酶载体材料孔径尺寸的大小，若反应的时间过短，则固定化酶载体材料容易生成大尺寸的固载材料，得到的固定化酶载体材料的孔径会较大，后续固定化复合酶中的酶容易脱落，降低固载效果；若反应的时间过长，固定化酶载体材料容易生成小尺寸的固载材料；酶无法进入到固定化酶载体材料中；为了匹配本申请的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶的尺寸，本申请的微波反应的时间为12～17min，最优时间为15.2min，得到的固定化酶载体材料后续的固载效果较好。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述钾盐中钾离子的浓度为2.0～4.0mol/L，优选为2.8mol/L。

所述钾盐包括硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钾中的至少一种，优选地，所述钾盐为硝酸钾。

所述氢氧化钾的浓度为2.0～4.0mol/L，优选为2.8mol/L；

所述硝酸钾的浓度为2.0～4.0mol/L，优选为2.8mol/L；

所述γ-环糊精的浓度为0.4～1.2mol/L，优选为0.7mol/L。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中，所述混合物A的加热温度为35～55℃，搅拌的速度为200～600rpm，搅拌的时间为20～40min；优选地，所述混合物A的加热温度为45℃，搅拌的速度为360rpm，搅拌的时间为30min。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述醇类溶剂包括甲醇，乙醇，正丙醇中的至少一种。所述醇类溶剂优选为甲醇。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中，所述混合物A与所述醇类溶剂的体积比为(4～6)：3，优选为5：3。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述亲水性聚合物包括聚乙二醇；优选地，所述聚乙二醇为聚乙二醇70000。

本申请选择聚乙二醇70000，其分子量远大于常见的聚乙二醇8000、聚乙二醇10000以及其他低聚类型的聚乙二醇，其分子尺寸的空间效应或分子阻碍效应就与前面提及的聚乙二醇不同。进一步地，选用的聚乙二醇分子量大，其对固定化载体材料的模板调控作用也大，可以更好调控固定化酶载体材料的孔径的尺寸，以便其孔径大小与本申请中的酶相匹配。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述聚乙二醇的加入量为所述混合物B的0.7～1.2％；优选地，所述聚乙二醇的加入量为所述混合物B的0.95％。

聚乙二醇的加入量影响固定化酶载体材料的平均孔径以及成型孔径范围。具体的，聚乙二醇影响体系的粘度，影响到了固定化酶载体材料晶体的析出时间，进而影响到固定化酶载体材料的平均孔径以及成型孔径范围。聚乙二醇的加入量越大，体系的粘度越大，制备得到的固定化酶载体材料的平均孔径越大，成型孔径范围越大。本申请控制聚乙二醇的加入量，有利于复合酶的固定化效果，使得固定化复合酶在不同温度下的热稳定性、耐盐性均较佳。

所述步骤S3中，静置的时间为10～15h，优选为12h。

所述步骤S3中，静置的目的是为了让固载材料的晶体生长出来，得到固定化酶载体材料。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤S3中，在得到所述析出物后，还包括将析出物进行洗涤和干燥处理。

所述洗涤所用的溶剂为无水乙醇。

所述步骤S4中，所述缓冲溶液为PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.015～0.03mol/L，pH为6.3～6.8；优选地，PBS溶液浓度为0.02mol/L，pH为6.5。

所述步骤S4中，黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纤维素酶用缓冲溶液溶解后室温孵育20～40min，得到酶溶液A，将努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶用缓冲溶液溶解后室温孵育20～40min，得到酶溶液B；

所述室温孵育的时间优选为30min。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤S5中，所述搅拌的速度为100～150rpm，所述搅拌的时间为2～7h；优选地，所述搅拌的速度为120rpm，所述搅拌的时间为3.5h。

搅拌的速度会影响到酶的舒展形态，影响到酶进入到载体的形态及固定化效果。搅拌的速度太快会降低载体的负载率，搅拌的速度太低，此时酶处于拉伸状态，酶不容易进入到载体内。因此，搅拌的速度要控制在一定的范围。

作为本申请所述固定化复合酶的制备方法的优选实施方式，所述步骤S5中，在得到所述沉淀物后，还包括将所述沉淀物进行冲洗；所述冲洗为采用缓冲溶液冲洗所述沉淀物的表面；所述缓冲溶液为PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.015～0.03mol/L，pH为6.3～6.8；优选地，PBS溶液浓度为0.02mol/L，pH为6.5。

第二方面，本申请提供了上述制备方法制备得到的固定化复合酶。

本申请制备的固定化复合酶可以制备超低分子铁皮石斛多糖(小于或等于5kDa以下)，改善铁皮石斛多糖黏度大的问题。本申请制备的固定化复合酶可以重复使用，解决游离酶难回收等问题，有利于实现生物酶提法提取铁皮石斛多糖工业化生产。

第三方面，本申请提供了上述固定化复合酶在制备超低分子铁皮石斛多糖中的应用。

与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

本申请提供了一种固定化复合酶及其制备方法和应用，本申请使用γ-环糊精制备得到一种耐高温的固定化酶载体材料，配比不同的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶(Acidityofβ-Mannanase from Aspergillus niger)和纤维素酶，并同时将努比卤地无氧芽胞杆菌(Anoxybacillus rupiensis)的菌种发酵液获得产物酶和中性蛋白酶进行多元复配，固载到前述制备的固定化酶载体材料，使用升温加热法，对铁皮石斛原料进行酶提多糖处理，最终获得超低分子的铁皮石斛多糖。其中，黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纤维素酶先进入至载体材料的内部，努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶在外部，总体上看，不同的酶形成了内外包裹的结构，有利于提高固定化复合酶的稳定性、固载率和提高超低分子铁皮石斛多糖的产率。

附图说明

图1为实施例1的固定化酶载体材料的扫描电镜图；

图2为实施例1的固定化酶载体材料的另一扫描电镜图。

具体实施方式

为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。

在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在实施例和对比例中，以下酶的来源如下：

努比卤地无氧芽胞杆菌的菌株编号为CICC 10208，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶购于上海华上翔洋生物技术有限公司；

纤维素酶购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

中性蛋白酶购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

本申请的努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶的制备方法为：

(1)用接种环挑取努比卤地无氧芽胞杆菌落至液体培养基中，于58℃，150rpm条件下培养48h，得到努比卤地无氧芽胞杆菌种子液。

(2)将所述努比卤地无氧芽胞杆菌种子液以0.3％的接种量接种至固体发酵培养基中，于32℃下静置培养72h，期间每隔24h翻料一次，得到发酵曲料。

(3)称取10％的发酵曲料于pH＝5.6的醋酸缓冲液，在35℃、150rpm下搅拌1h，过滤后得到滤液。

(4)在所述滤液中加入30％的(NH

所述液体培养基的制备方法为(以制备1L为例)：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，MnSO

所述固体发酵培养基的制备方法为：以质量百分比计，32％麸皮，8％豆饼粉，1.6％铁皮石斛茎粉，0.5％(NH

实施例1

本实施例提供了一种固定化复合酶的制备方法，包括以下步骤：

S1：将0.7mol的γ-环糊精加入至含有2.8mol/L氢氧化钾、2.8mol/L硝酸钾的混合溶液(1L)中，混合均匀后经微波反应15.2min，微波反应器的功率为600w，得到混合物A。

S2：将混合物A加热至45℃下保温，于360rpm下搅拌，搅拌过程中加入0.6L的甲醇(混合物A与甲醇的质量比为5:3)，加入完成后搅拌反应30min，冷却至室温，得到混合物B。

S3：在混合物B中加入0.95％的聚乙二醇70000，混合均匀后静置12h，得到析出物；取析出物用无水乙醇洗涤干净，干燥后得到固定化酶载体材料。

S4：称取200mg黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和150mg纤维素酶用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)溶解，室温孵育30min，得到混合酶溶液A；称取150mg努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和300mg中性蛋白酶用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)溶解，室温孵育30min，得到混合酶溶液B。

S5：称取5g的固定化酶载体材料加入至混合酶溶液A中，120rpm下搅拌3.5h(一次搅拌)，再在体系中加入混合酶溶液B，120rpm下搅拌3.5h(二次搅拌)，静置取沉淀物，使用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗表面，去除表面残留，得到固定化复合酶。

实施例2～7、对比例1～6与实施例1相比，区别如表1所示，其余试剂、参数与实施例1相同。

表1

实施例8～13、对比例7～12与实施例1相比，区别如表2所示，其余试剂、参数与实施例1相同。

表2

实施例14

S1：将0.5mol的γ-环糊精加入至含有3mol/L氢氧化钾、1.5mol/L碳酸钾的混合溶液(1L)中，混合均匀后经微波反应17min，微波反应器的功率为500w，得到混合物A。

S2：将混合物A加热至55℃下保温，于200rpm下搅拌，搅拌过程中加入0.75L的无水乙醇(混合物A与无水乙醇的质量比为4:3)，加入完成后搅拌反应20min，冷却至室温，得到混合物B。

S3：在混合物B中加入0.8％的聚乙二醇70000，混合均匀后静置10h，得到析出物；取析出物用无水乙醇洗涤干净，干燥后得到固定化酶载体材料。

S4：称取200mg黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和150mg纤维素酶用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)溶解，室温孵育30min，得到混合酶溶液A；称取150mg努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和300mg中性蛋白酶用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)溶解，室温孵育40min，得到混合酶溶液B。

S5：称取4.5g的固定化酶载体材料加入至混合酶溶液A中，130rpm下搅拌2h，再在体系中加入混合酶溶液B，130rpm下搅拌2h，静置取沉淀物，使用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗表面，去除表面残留，得到固定化复合酶。

实施例15

S1：将1mol的γ-环糊精加入至含有2mol/L氢氧化钾、2mol/L碳酸氢钾的混合溶液(1L)中，混合均匀后经微波反应12min，微波反应器的功率为800w，得到混合物A。

S2：将混合物A加热至35℃下保温，于600rpm下搅拌，搅拌过程中加入0.5L的正丙醇(混合物A与正丙醇的质量比为6:3)，加入完成后搅拌反应40min，冷却至室温，得到混合物B。

S3：在混合物B中加入1％的聚乙二醇70000，混合均匀后静置15h，得到析出物；取析出物用无水乙醇洗涤干净，干燥后得到固定化酶载体材料。

S4：称取200mg黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和150mg纤维素酶用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)溶解，室温孵育30min，得到混合酶溶液A；称取150mg努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和300mg中性蛋白酶用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)溶解，室温孵育20min，得到混合酶溶液B。

S5：称取6g的固定化酶载体材料加入至混合酶溶液A中，110rpm下搅拌7h，再在体系中加入混合酶溶液B，110rpm下搅拌7h，静置取沉淀物，使用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗表面，去除表面残留，得到固定化复合酶。

对比例13

对比例13的固定化复合酶的制备步骤与实施例1基本相同，区别仅在于步骤S5改为：称取5g的固定化酶载体材料加入至混合酶溶液B中，120rpm下搅拌3.5h，再在体系中加入混合酶溶液A，120rpm下搅拌3.5h，静置取沉淀物，使用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗表面，去除表面残留，得到固定化复合酶。

对比例14

对比例14的固定化复合酶的制备步骤与实施例1基本相同，区别仅在于步骤S5改为：将混合酶溶液A和混合酶溶液B混合均匀，再加入步骤S3的所述固定化酶载体材料，120rpm下搅拌7h，静置取沉淀物，使用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗表面，去除表面残留，得到固定化复合酶。

测试例1、孔径和孔径分布测试

将实施例1-15，对比例1-14的步骤S3制备得到的固定化酶载体材料用扫描电镜进行查看。实施例1的固定化酶载体材料的扫描电镜图如图1和图2所示。实施例1的固定化酶载体材料具有多孔隙结构，其孔径平均值为0.35μm，分布在0.25-0.55μm之间，其余实施例电镜图类似。

测试例2、复合酶的固定化率

在上述实施例1-15和对比例1-14的步骤S5中，取静置后的上清液进行残留酶活浓度的测定，根据加入的总酶活和残留酶活换算得到固定化颗粒中的总酶活，计算酶的固定化率。

固定化率＝(固定化颗粒中的总酶活/加入的总酶活)*100％。

测试例1、测试例2的结果如下表3。

表3

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测试结果表明，固定化酶载体材料的制备过程中，微波反应的时间，搅拌的速度对制备得到的固定化酶载体材料的平均孔径以及成型孔径范围有很大影响。对比实施例1-3，对比例1-2可知，随着微波反应的时间增大，平均孔径逐渐变小，孔径范围也在逐渐变小。

对比实施例1、实施例4、5，对比例3、4可知，搅拌的速度影响平均孔径以及成型孔径范围。搅拌的速度越小，平均孔径逐渐变小，孔径范围也在逐渐变小，随着搅拌速度提升，平均孔径在变大，孔径范围也在也在变大。

对比实施例1、实施例6、7，对比例5、6可知，聚乙二醇的加入量影响固定化酶载体材料的平均孔径以及成型孔径范围。具体的，聚乙二醇影响体系的粘度，影响到了固定化酶载体材料晶体的析出时间，进而影响到固定化酶载体材料的平均孔径以及成型孔径范围。聚乙二醇的加入量越大，体系的粘度越大，制备得到的固定化酶载体材料的平均孔径越小，成型孔径范围越小。

平均孔径和孔径的范围影响复合酶的固定化效果，平均孔径过大或过小均影响复合酶与固定化酶载体材料的匹配性，不利于复合酶的固定化效果，因此，在本申请中，微波反应的时间控制在12-17min，搅拌的速度控制在200-600rpm，聚乙二醇70000的加入量为混合物B的0.7-1.2％，优选地，微波反应时间为15.2min，搅拌的速度为360rpm，聚乙二醇70000的加入量为混合物B的0.95％。

因实施例8-14所用的固定化载体材料与实施例1相同，因此，其固定化载体材料的平均孔径以及孔径范围分布以实施例1相同。此外，从实施例1、8-13和对比例7-14可知，酶的固定化率与固定化载体材料的用量、固定化载体材料和酶的混合的工艺有关，酶的种类对固定化率的效果影响较小，因此，实施例1、8、9和对比例7-10制备的固定化复合酶的固定化率仍较高。

结合实施例1、10-13、对比例11、12可知，固定化载体材料的用量、搅拌的速度对最终产品的固载率有影响，本申请中，复合酶的总质量与所述固定化酶载体材料的质量比为0.16(g)：0.8-1.2(g)；优选为0.16(g)：1(g)，步骤S5中固定化酶的搅拌速度应控制在二次搅拌的速度均为100-150rpm。

对比实施例1和对比例13、14可知，固定化酶载体材料与复合酶的混合工艺影响到最终产品的固定化率，将混合溶液B与固定化酶载体材料先混合，努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶先占据了固定化酶载体材料内部位置，导致黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶和纤维素酶后续较难进入固定化酶载体材料内，最终产品的固定化率较低。同时将黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶和中性蛋白酶同时与固定化酶载体材料混合，四种酶同时进入固定化酶载体材料内，容易导致最终产品的固定化率较低。

测试例3、不同温度下酶活力测试

将固定化复合酶分别置于不同温度条件下，探究固定化复合酶在不同温度下的酶活力。

测试方法：将实施例1-15、对比例1-14的固定化复合酶分别浸泡于不同温度下的去离子水中，浸泡3小时，测定：(1)浸泡前固定化复合酶的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶中酶活力，结果取平均值(30℃下恒温10min)；(2)浸泡后固定化复合酶的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶中酶活力，结果取平均值；以30℃下游离的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶的最高酶活力的平均值作为100％，计算不同条件下固定化复合酶和游离酶的相对活性。

对照组：游离的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶，四者的酶活力取平均值(30℃下恒温10min)。

表4

如表4的结果可知，本申请实施例的1-15制备得到的固定化复合酶的热稳定较好，在30-70℃下浸泡3小时，四种酶的活性保持在95℃以上，在70℃条件下，游离酶已经完全失活，无法进行酶解反应，因此，本申请的固定化复合酶适合于工业生产。

对比实施例1-7和对比例1-6可知，在固定化酶载体材料的制备步骤中，微波反应的时间，搅拌的速度，聚乙二醇70000的加入量对固定化酶载体的平均孔径和孔径分布有影响，影响到了酶的固定化效果，最终影响到复合酶在不同温度下的稳定性，对比例1-6中的固定化复合酶的热稳定较差。

对比实施例1、8、9、对比例7-10、对比例13、14可知，四种酶的配比、酶进入载体的顺序对于固定化酶整体的热稳定性有一定影响，在四种酶菌加入的情况下，复合酶在固定化酶载体材料中的配合较紧密，酶不容易脱落，所以最终产品的热稳定较好，四种酶的配比发生变化、或是缺少其中一种酶、或是四种酶进入的顺序不同，均会使得酶与酶之间的配合较差，导致最终产品的热稳定性较差。

对比实施例1、对比例11、12可知，载体与复合酶的质量比以及混合过程中搅拌的速度影响到复合酶的包裹效果以及固定化效果，最终影响到酶的热稳定性。因此，本申请需要控制复合酶的总质量与所述固定化酶载体材料的质量比为0.16(g)：0.8-1.2(g)；步骤S5中固定化酶的搅拌速度应控制在二次搅拌的速度均为100-150rpm。

测试例4、不同盐浓度条件下的酶活力测试

将固定化复合酶分别置于去离子水和模拟自来水中，探究固定化复合酶在不同水质下的酶活力。

模拟自来水：配置含有500mg/L CaCl

测试方法：将实施例1-15、对比例1-14的固定化复合酶分别浸泡于去离子水和模拟自来水中，于30℃下浸泡3小时，测定：(1)浸泡前固定化复合酶的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶中酶活力，结果取平均值；(2)浸泡后固定化复合酶的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶中酶活力，结果取平均值；以30℃下游离的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶的最高酶活力的平均值作为100％，计算不同条件下固定化复合酶和游离酶的相对活性。

对照组：游离的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶、中性蛋白酶，四者的酶活力取平均值(30℃下恒温10min)。

表5

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在工业生产的过程中，如果直接使用自来水进行生产，可以省去水的提纯步骤，大大缩短制程时间和降低生产成本。自来水中含有较多的Ca

如表5的结果可知，本申请实施例制备的固定化复合酶在模拟自来水的条件下，复合酶仍能够保持很高的活性，而此时游离酶的活性已经降低了30％，使用本申请的固定化复合酶作为酶解反应的酶，可以实现用自来水进行酶解反应。

对比实施例1-7和对比例1-6可知，在固定化酶载体材料的制备步骤中，微波反应的时间，搅拌的速度，聚乙二醇70000的加入量对固定化酶载体材料有一定影响，在后续进行酶固定化的步骤中，影响到了酶的固定化效果，最终是的到复合酶的耐盐性，对比例1-6中的固定化复合酶的耐盐性较差。

对比实施例1、8、9、对比例7-10、对比例13、14可知，四种酶的配比、酶进入载体的顺序对于固定化酶整体的耐盐性有一定影响，在四种酶菌加入的情况下，复合酶在固定化酶载体材料中的配合较紧密，与载体材料的相互作用较强，最终产品的耐盐性较好，四种酶的配比发生变化、或是缺少其中一种酶、或是四种酶进入的顺序不同，均会使得酶与载体材料的相互作用发生变化，导致最终产品的耐盐性较差。

对比实施例1、对比例11、12可知，载体与复合酶的质量比以及混合过程中搅拌的速度影响到复合酶的包裹效果以及固定化效果，最终影响到酶的热稳定性。因此，本申请需要控制复合酶的总质量与所述固定化酶载体材料的质量比为0.16(g)：0.8-1.2(g)；步骤S5中固定化酶的搅拌速度应控制在二次搅拌的速度均为100-150rpm。

测试例5、铁皮石斛的酶解效果

铁皮石斛茎的酶解步骤：对铁皮石斛茎进行粉碎处理获得铁皮石斛茎粉末。称取100g铁皮石斛粉末投于1L去离子水，用0.05M的盐酸调节pH到6.5，搅拌上述铁皮石斛粉末溶液，经70℃加热15min后，等待铁皮石斛粉末充分溶胀获得悬浮液，使用无纺布袋装入上述3g实施例1-15或对比例1-14的固定化复合酶材料，继续65℃水浴2h，经过酶提取结束后，取出无纺布袋室温PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗三遍，可重复使用，铁皮石斛粉末溶液90℃灭活10min，过滤剩余少量不溶性杂质，取液，测定铁皮石斛粉末溶液中超低分子铁皮石斛多糖(小于或等于5kDa的铁皮石斛多糖)在总铁皮石斛多糖的占比。对照组中，在获得待铁皮石斛粉末充分溶胀获得悬浮液后，加入3g的游离的黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶、纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶与中性蛋白酶的复合酶(四种酶的质量比与实施例1相同)。

测试方法参照如下文献：

[1]周金平,王自凡,卢永仲,等.铁皮石斛多糖分级制备及理化活性研究[J].日用化学品科学,2022(008):045.

[2]熊文皙,黄清俊,黄金龙,等.国内主要石斛种类茎部有效成分石斛多糖的含量比较[J].南昌大学学报：理科版,2022(003):046.测试结果如下表6：

表6

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如上表6所示，本申请的实施例制备的固定化复合酶对铁皮石斛具有很好的酶解效果，在制备得到的铁皮石斛粗多糖中，超低分子铁皮石斛多糖超低分子铁皮石斛多糖(小于或等于5kDa)占比粗多糖的产率达85以上。结合固定化复合酶的制备工艺进行分析。实施例1-7的区别点在于载体材料的制备步骤存在差别，但超低分子铁皮石斛多糖(小于或等于5kDa)占比粗多糖的产率达90％以上，说明在本申请限定的条件下制备得到的固定化酶载体材料对复合酶具有很好的固定效果，最终能制备得到超低分子铁皮石斛多糖占比较高的酶解液。而对于实施例1与对比例1-6，在对比例1-6制备的固定化载体材料中，由于微波反应的时间、搅拌的速度、聚乙二醇70000的加入量影响到结晶的速度等等，制备得到的载体材料对复合酶的固定化率低，材料中固载的酶较少，进一步地，在酶解的过程中，复合酶容易脱落，酶在65℃的条件下容易失活，使得最终制备得到的酶解液中，超低分子铁皮石斛多糖占比较少。

对比实施例1、8、9、对比例7-10可知，在同等质量的酶的加入量的条件下，复合酶的种类、黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶与纤维素酶、努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶与中性蛋白酶的加入配比等会对超低分子铁皮石斛多糖的产率有很大影响，四种酶在酶解过程中起到协同作用，不仅可以将铁皮石斛的多糖大量提取出来，还可以将这些粗多糖进一步酶解，得到超低分子铁皮石斛多糖，缺少其中一种酶，制备得到的超低分子铁皮石斛多糖较少。

对比实施例1、对比例13、14可知，固定化复合酶的固定化顺序，对最终产品的酶解效果有很大影响，本申请中，将黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶与纤维先进入到载体材料中，努比卤地无氧芽胞杆菌的产物酶与中性蛋白酶后进入，使得复合酶在载体中能形成内外包裹的结构，有利于大分子的铁皮石斛多糖的逐级酶解。缺少这样的包裹结构(对比例14)，或酶的位置进行互换，固定化酶的酶解效果均较差，最终制备得到的超低分子铁皮石斛多糖较少。

测试例6、5次循环后酶活力的测定

重复测试例5中的铁皮石斛的酶解实验，其中，固定化酶在每次酶解结束后，用PBS溶液(pH＝6.5,0.02M)冲洗三遍后，投入至下一次的酶解实验中，重复实验5次，测试在进行酶解前、第5次酶解后、固定化酶的酶活力(测试温度为30℃)。酶活力的测试方法参考测试例3。

表7

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如表7的结果可知，在循环使用5次后，本申请的固定化复合酶仍保持很高的酶活性，平均酶活性在85％以上，对比例的固定化复合酶在使用5次后，出现了不同酶活性的减弱。综合可知，本申请制备的固定化复合酶可以多次重复使用，适合用于工业化生产。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。