一种瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型、构建方法、应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型、构建方法、应用。

背景技术

瓦斯爆炸是煤炭行业常见的灾害事故，属于突发公共卫生事件的一种，常发生在矿井或坑道，造成成批矿工的伤亡。瓦斯爆炸对煤矿职业人群健康的威胁已成为公共卫生领域关注的焦点。每年发生的井下瓦斯爆炸事故造成了直接和间接的经济损失，严重威胁了国家财产和矿工的生命安全。

国内赵瑞峰等人曾对49例瓦斯爆炸矿难幸存者进行脑部磁共振成像(MRI)研究发现：瓦斯爆炸对幸存者脑部海马和脑皮质等部位产生明显影响，6个月及1年复查共有30例表现有不同程度的创伤后应激障碍临床症状，致伤率高达61.22％。本发明的发明人在真实巷道环境下开展大量动物实验研究，并发现瓦斯爆炸能够导致大鼠神经行为学改变，脑组织微观结构破坏以及功能受损。说明脑组织是瓦斯爆炸的重要靶器官，伴随氧化应激、炎症、水肿等损伤现象。也提示瓦斯爆炸导致的认知功能障碍是瓦斯爆炸伤的重要并发症。但是目前对瓦斯爆炸所致脑损伤的生理-病理机制尚不十分清楚，国内外尚无系统性的研究，导致对相关疾病的治疗缺乏有效的方法或干预手段。

动物模型或体外细胞模型通常是疾病的生理-病理机制研究的常用手段，现有技术中对于瓦斯爆炸致脑冲击伤的研究主要利用大型巷道和激波管模型构建动物脑损伤模型，操作复杂，实施困难，造模成本高且损伤效应不稳定，模型应用不广泛。因此，研究开发能够模拟瓦斯爆炸致脑冲击伤的体外细胞模型，对于研究瓦斯爆炸致脑冲击伤的生理-病理机制，提高对瓦斯爆炸并发症的干预及时性和有效性，降低瓦斯爆炸导致的人员伤亡，具有重要的社会意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供小胶质细胞在构建瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型方面的应用，构建能够模拟瓦斯爆炸致脑冲击伤生理-病例机制的体外细胞模型。

本发明的目的之二在于提供一种瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型，能够通过体外细胞实现真实反映瓦斯爆炸致脑冲击伤生理-病理现象，用于瓦斯爆炸致脑冲击伤作用机制研究。

本发明的目的之三在于提供一种瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

小胶质细胞在构建瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型方面的应用。

作为优选的，所述小胶质细胞为大鼠小胶质细胞GMI-R1；通过机械的方式对小胶质细胞施加冲击波构建而成。

瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型的构建方法，包括在密闭容器内，对小胶质细胞悬浮液施加冲击波构建形成体外模型细胞。

进一步优选的，小胶质细胞为大鼠小胶质细胞GMI-R1；小胶质细胞悬浮液的浓度为1～10×10

作为优选的，小胶质细胞悬液的浓度为7×10

可选的，采用冲击波理疗仪对小胶质细胞悬浮液施加冲击波。需要说明的是，冲击波理疗仪仅为举例说明，也可以采用其他能够产生冲击波能量的设备。

所述冲击波的频率为1～21Hz；进一步优选的，冲击波的频率为10Hz。

可选的，冲击波的能量强度为10bar。

可选的，冲击次数为0～5000次；进一步优选，冲击次数为1500次。

细胞受到冲击损伤后通常会呈现先损伤会修复的过程，为了真实模拟瓦斯爆炸致脑冲击上，还包括将体外模型细胞进行体外培养；所述培养时间为12～48h；进一步优选的，所述培养时间为12h；

可选的，所述体外培养为将体外模型细胞接种至孔板进行培养，接种浓度为1000-10000个/孔；进一步优选，接种浓度为5000个/孔；

还包括对造模成功的体外模型细胞进行药物干预，作为体外药物干预模型。

一种瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型，包括体外模型细胞和细胞活性干预试剂；其中体外模型细胞由上述方法构建而成。

可选的，所述细胞活性干预试剂为姜黄素；进一步优选的，采用姜黄素对细胞活性干预的施用浓度≤5μg/mL，进一步优选为5μg/mL。

本发明选用小胶质细胞，优选大鼠小胶质细胞，构建瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型，为瓦斯爆炸造成的脑冲击伤研究提供了稳定、简便且成本较低的建模方法。本发明通过试验验证，选用小胶质细胞，在特定条件下(冲击波频率、冲击能量、冲击密度和冲击次数等)，在机械冲击波的作用下，形成的细胞损伤生理-病理特征与实际瓦斯爆炸致脑冲击伤的特征相似，尤其是表现出相同的细胞炎症反应，表明本发明构建的体外模型能够应用于瓦斯爆炸致脑冲击伤的生理—病理研究。

为了验证本发明通过冲击波暴露构建的体外模型细胞的有效损伤，在本发明的具体实施例中通过LPS药物损伤作为阳性对照，优选的，采用LPS对细胞活性干预的施用浓度为0.5μg/mL；进一步优选为0.5μg/mL。

另外，本发明通过试验验证，当采用相同的条件对不同的脑神经细胞，比如星型胶质细胞进行体外模型试验，结果表明星型胶质细胞的损伤病理特征与实际的瓦斯爆炸致脑损伤的病例特征不完全相同，尤其是出现不同的细胞炎症反应，该结果表明瓦斯爆炸致脑损伤体外模型对神经细胞的类型具有一定的特异性，本发明创造性的选取小胶质细胞作为模型细胞，成功构建能够仿真模拟瓦斯爆炸致脑损伤的生理—病理特征的体外模型。

进一步的，本发明提供的体外模型，包括体外模型细胞和细胞活性干预试剂，可以通过对处于不同损伤阶段的体外模型细胞开展体外干预试验，用于指导瓦斯爆炸致脑损伤的临床干预。具体的，根据具体的研究需求，可以分别对损伤初始阶段、最严重损伤阶段和损伤恢复阶段的细胞(对体外模型细胞体外培养不同时间形成不同损伤阶段的细胞)，通过施加一定浓度的细胞活性干预试剂，开展体外干预试验，观察不同损伤阶段的细胞干预有效性，进而用于指导瓦斯爆炸致脑损伤的最佳临床干预时机。

附图说明

图1为不同种板接种密度细胞生长状态示意图；

图2为不同冲击次数条件下，大鼠小胶质细胞GMI-R1和大鼠星型胶质细胞CTXTNA2冲击损伤后12h小时细胞活性对比结果示意图；

图3为不同冲击能量条件下，大鼠小胶质细胞GMI-R1和大鼠星型胶质细胞CTXTNA2冲击损伤后12h小时细胞活性对比结果示意图；

图4为不同冲击能量条件下，大鼠小胶质细胞GMI-R1和大鼠星型胶质细胞CTXTNA2冲击损伤后24h小时细胞活性对比结果示意图；

图5为不同冲击能量条件下，大鼠小胶质细胞GMI-R1和大鼠星型胶质细胞CTXTNA2冲击损伤后48h小时细胞活性对比结果示意图；

图6为不同冲击密度下，大鼠小胶质细胞GMI-R1和大鼠星型胶质细胞CTX TNA2冲击损伤后12h细胞活性对比结果示意图；

图7为不同浓度LPS对大鼠小胶质细胞GMI-R1细胞活性损伤检测结果示意图；

图8为冲击波暴露与LPS药物对大鼠小胶质细胞GMI-R1细胞活性损伤对比检测结果示意图；

图9为大鼠小胶质细胞GMI-R1冲击损伤后培养12h后，细胞内IL-1β水平；

图10为大鼠小胶质细胞GMI-R1冲击损伤后培养12h后，细胞内IL-6水平；

图11为大鼠星型胶质细胞CTX TNA2冲击损伤后培养12h后，细胞内IL-1β水平；

图12为大鼠星型胶质细胞CTX TNA2冲击损伤后培养12h后，细胞内IL-6水平；

图13为大鼠小胶质细胞GMI-R1冲击损伤后培养0h、6h、12h、24h、48h、72h，细胞活性对比检测结果示意图；

图14为大鼠小胶质细胞GMI-R1冲击损伤后，不同浓度姜黄素对细胞活性干预作用的检测结果示意图；

图15为不同时间添加姜黄素对细胞活性的干预效果对比检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；

下述实施例和试验例所用的材料和仪器包括，未提及的材料和仪器均为市售商品：

冲击波理疗仪购自购自武汉淘梦商贸有限公司(HM08CJ型)；

大鼠小胶质细胞GMI-R1、大鼠星型胶质细胞CTX TNA2购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；

H-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、青－链霉素双抗、冻存液购自上海中桥新舟生物科技有限公司；

耦合剂购自天津津亚科技发展有限公司(备案号：津械备20190383号)；

酶标仪购自美国BioTek公司；

CO2培养箱购自赛默飞世尔科技有限公司；

细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

下述实施例中细胞培养方法包括：用10％胎牛血清H-DMEM培养基培养细胞(89％H-DMEM+10％FBS+1％双抗)，置于37℃，5％C02培养箱中培养。当细胞长到80％左右将细胞消化传代和实验。2天换一次液，传代比例为1:3，传代时加入1mL Trypsin-EDTA的胰蛋白酶，37℃消化2min，加入2mL培养基终止消化。轻轻吹打细胞至完全脱落，转移至离心管。

下述实施例中瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型细胞判定标准定义如下：

1)在一定当量的冲击波干预后12h贴壁细胞活性为(47.3±2.4)％；

2)细胞贴壁后继续培养至24h，贴壁细胞活性恢复率≤60％。

实施例1

本实施提供瓦斯爆炸致脑损伤体外模型细胞构建方法，具体方法为：

1)准备细胞：将消化下来的细胞悬液进行细胞计数，将1mL一定浓度的细胞悬液加入到5ml的无菌离心管中，密封离心管管口；

2)冲击波致细胞损伤：设置冲击波能量强度和频率，将步骤1)制备的离心管放置在涂有足量耦合剂的冲击理疗仪手柄上，设置冲击次数，构成体外冲击伤模型细胞；

3)模型质控：同步设置正常细胞对照组，将步骤2)构建的体外模型细胞和对照组细胞分别接种至96孔板，每孔接种细胞数量为5000个，37℃培养箱内培养，测定12h后贴壁细胞活性，以及细胞贴壁后继续培养至24h的细胞活性恢复率，符合标准即表明成功构建获得体外模型细胞；

其中细胞活性、损伤程度的测序方法如下：

1)CCK-8法检测细胞活性

根据CCK-8法试剂盒说明书，冲击波损伤后于相应时间点每孔加入l0μL CCK-8溶液，避光操作，同时避免产生气泡。37℃，5％CO

2)统计学方法

所有数据均采用GraphPadPrism 7.0进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK检验，两个独立样本比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

实施例2体外模型细胞冲击波参数及质控参数筛选

1、种板培养接种浓度：

将冲击按摩仪设置冲击条件为10bar，10Hz，冲击次数为1500次，细胞悬液密度为1×10

2、确定冲击波能量、冲击频率、冲击密度和冲击次数：

方法：选定三个参数为固定条件，一个参数为变动条件，变动条件设置不同梯度，按照实施例1所述方法分别对GMI-R1细胞和CTX TNA2细胞冲击完成后，种板培养后测12h，24h，48h细胞存活率，种板培养按照每个孔5000个接种数量，实验重复三次。CCK8检测细胞活性，以12h贴壁细胞活性，以及细胞贴壁后继续培养至24h，贴壁细胞活性恢复率符合体外模型细胞判定标准选定合适的冲击波参数条件；

结果：如图2、图3、图4、图5、图6所示，通过试验选定冲击条件为10bar，10Hz，冲击次数为1500次，冲击密度为7×10

上述结果表明GMI-R1细胞体外冲击波处理后构建的体外模型细胞满足模型细胞活性要求，(12h贴壁细胞活性为(47.3±2.4)％；细胞贴壁后继续培养至24h，贴壁细胞活性恢复率≤60％)；

CTX TNA2细胞在冲击波处理后构建的体外模型细胞24h细胞活性恢复率不能满足体外模型细胞判定标准；

表明在瓦斯爆炸致脑冲击损伤的体外模型细胞方面，GMI-R1具有特异性。

3、为了进一步验证将小胶质细胞暴露在冲击波环境下形成的细胞损伤作为体外模型细胞的有效性，分别设置空白对照组、模型组、阳性对照组；

其中模型组为将GMI-R1细胞在冲击密度7×10

阳性对照组为细胞培养基中添加LPS干预培养，对于LPS的干预浓度进行梯度浓度试验，浓度梯度设置为0.1μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，将试验细胞悬液接种在种板中，按照不同试验浓度在对应的试验孔中添加LPS，每个浓度设置5个重复，培养12h后，采用CCK8检测细胞活性，结果如图7所示(注：与0μg/mL比较，**P<0.01)，筛选确定0.5μg/mL为最佳干预浓度。因此，阳性对照组为正常GMI-R1细胞悬液接种孔板培养，添加LPS终浓度为0.5μg/mL；

空白对照组为正常GMI-R1细胞悬液；

将模型组、阳性对照组和空白对照组分别按照5000个/孔的接种密度进行种板接种培养，测定培养12h后细胞活性，结果如图8所示，表明本发明将大鼠小胶质细胞GMI-R1暴露在冲击波环境下构建的体外模型细胞，与采用LPS药物导致的细胞活性损伤类同，表明本发明采用大鼠小胶质细胞GMI-R1暴露在冲击波环境下能够对细胞造成有效损伤，能够作为体外模型细胞。

4、为了进一步验证GMI-R1细胞在构建瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型方面的特异性性，分别对GMI-R1细胞(作为模型组)和CTX TNA2细胞(作为模型组)在冲击密度7×105，冲击能量10bar，冲击频率10Hz，冲击次数为1500次，冲击条件下冲击完成后，种板培养12h后，采用Western-blot法检测细胞内IL-1β和IL-6水平，设置正常细胞为对照组，结果如图9和图10所示(注：与对照组比较，*P<0.05)为GMI-R1细胞冲击波处理后细胞内IL-1β和IL-6水平；如图11和图12所示((注：与对照组比较，*P<0.05))为CTX TNA2细胞冲击波处理后细胞内IL-1β和IL-6水平；

上述结果显示，GMI-RI大鼠小胶质细胞IL-1β和IL-6炎症因子表达明显增高，CTXTNA2大鼠星型胶质细胞IL-1β和IL-6炎症因子表达有下降趋势；

真实巷道环境下，瓦斯爆炸致脑冲击伤的炎症因子病理特征表现为炎症因子水平升高，表明GMI-RI大鼠小胶质细胞在受到冲击波损伤后的炎症病理能够模拟真实巷道环境下瓦斯爆炸致脑冲击伤的细胞炎症病理特征，在应用于瓦斯爆炸致脑冲击伤体外模型方面具有特异性。

实施例4体外干预可行性

1、细胞活性：

对7×10

2、体外干预效果：姜黄素

将18.42mg姜黄素中加入1mLDMSO，配置成50mmol/L的姜黄素原液；

试验方法：

(1)干预浓度筛选：

按照姜黄素终浓度20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1μmol/L设置不同的浓度梯度，将试验细胞悬液接种在种板中，按照不同试验浓度将姜黄素原液稀释后添加在对应的试验孔，每个浓度设置5个重复，培养12h后，采用CCK8检测细胞活性，结果如图14所示(注：与0μmol/L比较，**P<0.01)，筛选确定5μmol/L为最佳干预浓度。

(2)体外干预时间对比评价：

对7×10

将试验用细胞悬液接种96孔板培养，每孔接种5000个细胞，分别在接种孔板培养0h、6h、12h、24h、48h和72h按照5μmol/L浓度添加姜黄素，对比培养至78h的细胞活性，结果如图15所示，表明可以对比出不同时间添加姜黄素对细胞活性恢复效果不同，其中12h使用姜黄素干预对细胞活性提升有效性最佳，提示临床应用也存在最佳干预时间，指导临床在合适时间使用药物预防或治疗瓦斯爆炸脑冲击伤。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。