降解糖噬糖菌FZY0027及其应用

技术领域

本发明涉及多糖的降解开发技术领域，具体为一株潮间带表层海水来源的细菌菌株降解糖噬糖菌(Saccharophagus degradans)FZY0027及其在多糖的降解中的应用。

背景技术

降解糖嗜糖菌(Saccharophagus degradans)是目前所报道的多糖降解功能性最为多样的海洋微生物之一，被誉为“超级降解者”。近年来，随着对其生态学和应用价值的不断深入研究，降解糖嗜糖菌在环境、食品、医药、能源等方面具有广泛的研究和应用价值。从分类地位上来看，降解糖嗜糖菌属于γ-变形菌门，与海洋分解菌属(Marinobacter)和帕氏菌属(Pseudoalteromonas)等分解海洋沉积物的菌种存在着密切联系。然而，在降解多糖的水平上，它们之间还存在着一些差异。降解糖嗜糖菌具有高效的多糖降解功能，包括琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、羧甲基纤维素、几丁质、β-葡聚糖、海带多糖、果胶、支链淀粉、淀粉和木聚糖等多种多糖，该物种很可能在海洋碳循环中发挥重要作用。这使得它成为了一种重要的用于海洋物质分解和有机质降解的细菌菌种。降解糖嗜糖菌能够快速降解多种多糖，同时优化其生长条件便于其生物质的产生，在生物燃料、药物制剂和生物材料的生产等方面具有巨大的潜力。从应用价值上来看，降解糖嗜糖菌的多糖降解能力被广泛应用于多个领域。在环境治理方面，它能够分解海藻、污水中的有机废料等污染物，有效减少它们对环境的影响。在食品工业方面，降解糖嗜糖菌的多糖降解酶已被广泛应用于生产过程中，例如用于面包、乳制品、奶酪、布丁、糖果和果冻等食品的研发和生产，这不仅有助于提高产品品质和口感，而且能够降低食品加工成本。此外，降解糖嗜糖菌还被用于制备各种生物材料，例如纤维素衍生物、木质素衍生物和甘露聚糖衍生物的重要中间体，以及防火材料、吸附材料和生物涂层等。

从“中国知网”(https://www.cnki.net)中检索到有关降解糖噬糖菌Saccharophagus degradans已发表专利25项，涉及到的菌株大部分为Saccharophagusdegradans 2-40

而新的降解糖嗜糖菌的发现将具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明公开了一株降解糖噬糖菌FZY0027，其分类命名为Saccharophagusdegradans FZY0027，保藏时间：2023年3月23日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.26885。

降解糖噬糖菌FZY0027采集自中国黄海的盐城大丰农场的潮间带(33°6’59”N,120°51’9”E)的表层海水样品(样品编号L6)，样品L6在R2A(supplemented with 2.5％seasalt)(本发明中使用的R2A培养基均需添加2.5％海盐，后文简称R2A)平板形成较大的降解坑洞，表现出较强的琼脂降解活力。使用稀释涂布法，在R2A培养基中28℃培养5天后挑取单菌落获得纯培养。菌株Saccharophagus degradans FZY0027对多糖具有一定的水解能力，且对淀粉、海藻酸钠、木聚糖和甘露聚糖的水解活力较好；在培养温度为37℃时，对淀粉的水解效果更显著；对海藻酸钠和甘露聚糖的水解效果在32℃培养时较37℃时显著。其中，R2A培养基从美国BD公司购买，并按照产品说明书进行配置，货号218263。

本发明的具有降解多糖能力的菌株Saccharophagus degradans FZY0027的形态特征：

菌株Saccharophagus degradans FZY0027为革兰氏阴性菌，划线接种至R2A固体平板并置于28℃培养72h后，菌落粘稠，呈圆形，表面光滑，呈红色，大小约为1.0-1.5mm。划线接种至2216E固体平板并置于28℃培养72h后，菌落粘稠，呈圆形，表面光滑，黑色，且出现明显琼脂降解现象。在透射电镜下，菌株FZY0027的细胞呈杆状，其大小为2.5-3.5×0.8-1.2μm，有端生鞭毛。其中，2216E培养基从北京索莱宝科技有限公司购买，并按照产品说明书进行配置，货号LA0341。

本发明菌株Saccharophagus degradans FZY0027的培养特性：

好氧菌，生长温度范围为4～42℃，最适生长温度范围为24～32℃。可以在1～5％NaCl浓度的环境中生长，2～3％ NaCl浓度为最适浓度。

本发明的菌株Saccharophagus degradans FZY0027的基因组特征：

菌株Saccharophagus degradans FZY0027的基因组由武汉贝纳科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000测序仪进行二代测序和Oxford Nanopore PromethION测序仪进行实时单分子测序(三代测序)，基因组测序结果利用Unicycler(v 1.0)进行组装。得到的基因组只含有1条总长度为5.2Mb的环形染色体，G+C含量为45.5％。将基因组上传到NCBI，得到的GenBank登录号为CP123764、BioProject登录号为PRJNA958120、BioSample登录号为SAMN34277932。

菌株FZY0027的16S rRNA序列片段大小为1335bp，根据NCBI比对的结果，菌株Saccharophagus degradans FZY0027的16S rRNA序列相似度最高的菌株有：“Saccharophagus sp.”AG21(99.9％)，Saccharophagus degradans2-40

其中，从韩国济州岛南海岸采集的红色海藻(Gelidium amansii)中分离出的琼胶分解细菌Saccharophagus sp.AG21(https://doi.org/10.4014/jmb.1209.09009)，16SrRNA基因GenBank登录号为JQ743648。在菌株Saccharophagus sp.AG21中发现了一个新的β-琼胶酶基因(beta-agarase II)，命名为agy1，已发表在NCBI数据库中，GenBank登录号为AFR90184，但无完整的基因组数据。Agy1属于GH16(glycosyl hydrolase family 16)家族，与Saccharophagus degradans 2-40

使用Burkholderia cepacia ATCT 25416

为了进一步确定菌株FZY0027的系统发育树，选择了Cellvibrionaceae科中的9个基因组和外群Haliea salexigens 3X/A02/235

使用GGDC(http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php#)、Average Nucleotide Identitycalculator和Average Amino acid Identity calculator(http://enve-omics.ce.gatech.edu)在线工具进行分析，菌株FZY0027与Saccharophagus degradans 2-40

本发明菌株Saccharophagus degradans FZY0027的琼胶多糖降解能力特征：

菌株Saccharophagus degradans FZY0027在2216E固体培养基中28℃培养3天，菌落大片生长，在平板表面出现较明显的凹陷。经卢戈氏碘液染色后，菌株Saccharophagusdegradans FZY0027在菌落周围形成较大的透明圈，透明圈产生的原因是卢戈氏碘液能使琼胶多糖染成深棕色而不能使琼胶水解后产生的琼胶寡糖着色。通过观察菌落的水解圈大小和卢戈氏碘液染色鉴定结果，发现菌株Saccharophagus degradans FZY0027表现出较强的琼胶降解能力。采用DNS比色定糖法，用紫外可见分光光度计测定540nm波长处的吸光度，根据半乳糖标准曲线确定反应产生的还原糖的量，反应菌株Saccharophagus degradansFZY0027的琼胶酶活力，还原糖产量越多，琼胶酶活力越高。还原糖浓度在对数生长期及稳定期1-4d中呈上升趋势，菌株在稳定期时活细胞数目稳定且初级代谢积累物达到最高峰，并在第四天达到最高值。

本发明菌株Saccharophagus degradans FZY0027的多糖降解能力特征：

本发明通过DNS方法验证菌株FZY0027对淀粉、海藻酸钠、木聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、几丁质、微晶纤维素、卡拉胶、黄原胶、果胶和硫酸软骨素。在胞外多糖降解体系中，菌株FZY0027对淀粉的降解能力最强，产生的还原糖浓度为2.28mg/mL，其次是木聚糖(1.83mg/mL)、甘露聚糖(1.15mg/mL)、海藻酸钠(0.41mg/mL)，果胶(0.22mg/mL)，硫酸软骨素(0.15mg/mL)，微晶纤维素(0.12mg/mL)，几丁质(0.12mg/mL)，卡拉胶(0.12mg/mL)，黄原胶(0.11mg/mL)和壳聚糖(0.11mg/mL)。菌株FZY0027对淀粉、木聚糖、甘露聚糖和海藻酸钠表现出较强的多糖降解能力，但无法降解果胶、微晶纤维素、几丁质、卡拉胶、黄原胶及壳聚糖。另外，与菌株2-40

本发明菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagusdegradans 2-40

菌株Saccharophagus degradans FZY0027和Saccharophagus degradans2-40

本发明根据菌株Saccharophagus degradans FZY0027的琼脂糖降解能力，分析参于降解琼脂糖的琼脂酶结构域，并且找出菌株Saccharophagus degradans FZY0027中与Saccharophagus degradans 2-40

结合CAZymes的结构域预测结果发现菌株Saccharophagus degradans FZY0027的蛋白质序列QFX18_15130～QFX18_07375对应的基因与菌株Saccharophagus degradans 2-40

菌株Saccharophagus degradans FZY0027及突变体、变异体的培养物、细胞内容物、细菌菌株的菌液、发酵培养液及培养液的过滤液及各种代谢产物、衍生物均可用于降解多糖。可用于对琼胶、淀粉、木聚糖、甘露聚糖和海藻酸钠等多糖降解产生各种代谢产物和衍生物。

Saccharophagus degradans FZY0027中参与编码琼脂酶的基因：QFX18_15130、QFX18_15125、QFX18_07410、QFX18_07385、QFX18_07440和QFX18_07375基因可用于参与表达琼脂酶产物和包含这些蛋白产物的各种生物制剂的制备中。

本发明所达到的有益效果是：本发明的菌株Saccharophagus degradansFZY0027，在琼脂培养基表现出较高的琼脂降解活性，具有降解多种生物多糖的潜力。另外，大部分降解糖噬糖菌无完整的基因组序列，但菌株FZY0027基因组序列已完成测序并保存在NCBI数据库中，其GenBank登录号为CP123764、BioProject登录号为PRJNA958120、BioSample登录号为SAMN34277932。与“超级降解者”Saccharophagus degradans 2-40

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为透射电镜下菌株Saccharophagus degradans FZY0027在2216E固体培养基中28℃培养3天的形态。Bar,1.0μm；

图2为菌株Saccharophagus degradans FZY0027基于16S rRNA基因序列构建的邻接法系统发育树；

图3为菌株Saccharophagus degradans FZY0027基于120个高度保守基因构建的最大似然法系统发育树；

图4为菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagusdegradans 2-40

图5为菌株Saccharophagus degradans FZY0027的卢戈氏碘液染色结果；

图6为菌株Saccharophagus degradans FZY0027琼脂多糖降解能力验证；

图7为菌株Saccharophagus degradans FZY0027多糖降解能力验证；

图8为菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagusdegradans 2-40

图9为表1中菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagusdegradans 2-40

图10为D-半乳糖标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1、本发明菌株Saccharophagus degradans FZY0027分离方法：

菌群L6-3的共培养物分离自盐城大丰农场的潮间带水样(样品编号L6)，并在R2A琼脂培养基上形成明显的琼脂降解坑洞。将稳定的亚群落培养物(L6-3)用10倍梯度稀释法得到10

2、本发明的具有较好降解多糖能力的菌株Saccharophagus degradans FZY0027的鉴定方法：

(1)菌株基因组DNA的提取

按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B518255)操作说明提取细菌基因组DNA。

(2)16S rRNA基因扩增

用所提出的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

引物序列为(5’-3’)：27F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

1492R，GGTTACCTTGTTACGACTT。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸100s，共34个循环；72℃延伸5min。取5μL PCR产物，在含有SuperRed/GeLRed核酸染料的0.8％琼脂糖凝胶上，160V电泳20min，并在凝胶成像仪下观察拍照。

(3)16S rRNA序列测定及其系统发生分析

16s rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，使用BioEid软件将所得结果与NCBI数据库上的获得的参比序列进行比对，使用MEGA X软件进行系统发育分析。采用Kimura双参数模型计算遗传距离，采用邻接法(Neighbour-joining,NJ)构建系统进化树。

将菌株接种到2216E液体培养基中，在28℃、200r/min条件下培养72h后，收集菌体。基因组DNA的提取和测序由武汉贝纳科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000测序仪进行二代测序和Oxford Nanopore PromethION测序仪进行三代测序完成。公司交付的结果为经过质控后的clean data，在Ubuntu系统中使用UGENE软件包中的SPAdes程序(http://cab.spbu.ru/software/spades/)进行基因组组装，删除Coverage小于5或长度小于500bp的序列后，将基因组数据提交到GenBank并使用NCBI的PGAP在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/)对基因组进行注释。选择120个高度保守管家基因，使用EasyCGTree软件包(

在bac120核心基因集系统发育树的基础上，通过Kostas Lab的在线工具(

(4)菌株最适生长条件的测定

将菌株分别划线接种到R2A、2216E、LB和TSA常用固体培养基上，确定2216E为最适培养基。将菌株划线接种到2216E固体培养基上，分别放入4℃、20℃、24℃、28℃、37℃、42℃以及45℃的环境中培养7天，每隔24h观察菌株在不同温度条件下的生长情况。分别配制海盐浓度为0％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％和12％的2216E固体培养基。将菌株划线接种到不同盐浓度的2216E固体培养基中，放入28℃的培养箱中培养7天，每隔24h观察菌株在不同盐浓度下的生长情况。

3、本发明的具有较好降解多糖能力的菌株Saccharophagus degradans FZY0027的降解琼脂多糖能力鉴定方法：

(一)卢戈氏碘液染色

鉴定原理：卢戈氏碘液是一种染色试剂，能使琼脂糖呈现黑色，而不能将琼脂寡糖染色，因此能够用于检测细菌的琼脂糖降解能力。经卢戈氏碘液染色后，通过观察菌落周围是否形成透明圈来判断细菌是否具有琼脂糖降解能力，透明圈大小反映菌落利用琼脂糖的能力。

通过移液枪将卢戈氏碘液(卢戈氏碘液配方：5g碘(I

(二)DNS比色定糖法

实验原理：采用DNS比色定糖法，由于琼脂酶能分解琼脂糖生成含还原性末端的琼脂寡糖，DNS又可以与琼脂寡糖在碱性条件下发生氧化还原反应，将寡糖结构中的还原性基团氧化为羧基，而DNS则被还原成3-氨基-5-硝基水杨酸，该物质在沸水浴中加热后呈红棕色。反应后的溶液在540nm波长下测定吸光度(Optical Density，OD)，然后通过D-半乳糖标准曲线计算琼脂寡糖的含量，实现琼脂寡糖的快速定量。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂：将6.3g的3,5-二硝基水杨酸和262mL的2mol/L氢氧化钠，加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000mL，即制成DNS试剂，贮于棕色瓶中,放置一周后备用。

D-半乳糖标准曲线的制作：

(1)D-半乳糖标准溶液的配制：准确称取100mg预先在105℃下烘干至恒重的D-半乳糖，溶于少量蒸馏水中，转移至100mL的容量瓶后定容至刻度线，终浓度为1mg/mL。

(2)取6支15mL的离心管，按表4.3加入试剂，沸水浴下加热5min，待冷却至室温后，用蒸馏水补足至15mL，通过紫外可见分光光度计测定540nm波长处的OD值。

(3)绘制以D-半乳糖含量(mg/mL)为横坐标和以OD

其中：D-半乳糖标准溶液、蒸馏水与DNS试剂的单位均为mL。

测样样品制备：

本发明将菌株FZY0027与琼脂糖共培养来制备样品，这里简称为共培养法，探究菌株FZY0027产生琼脂酶的琼脂糖降解活性。

(1)挑取在2216E琼脂平板上生长活跃的FZY0027菌落接种至100mL含有0.1％(w/v)琼脂糖的2216E液体培养基中，25℃，150r/min，摇瓶培养；

注：设置未接种菌株FZY0027为空白对照组，实验组做3个平行。

(2)每隔24h后，在无菌环境下从每一份液体培养基中均匀吸取20mL的液体，相对离心力12000×g离心10min；

(3)取离心后的上清液1mL于新的离心管中，立即加入2mL DNS试剂，沸水浴加热5min；

(4)冷却至室温后，蒸馏水补足至15mL，测定540nm波长处的OD值；

(5)连续5天皆按上述操作检测样品。

琼脂酶活性分析：

根据D-半乳糖标准曲线的制作方法，D-半乳糖含量(mg/mL)与其对应的OD

共培养法一共需要检测5天的OD值，并记录实验数据，通过D-半乳糖标准曲线计算出相应的还原糖含量。将这5天的还原糖数据，运用软件Origin 2023绘制柱状图可以得到图6。

4、本发明的具有较好降解多糖能力的菌株Saccharophagus degradans FZY0027的多糖降解能力的鉴定方法：

降解糖嗜糖菌能够降解多种生物质多糖，生成具有还原性末端的寡糖。3,5-二硝基水杨酸(DNS)在碱性条件下能与琼胶寡糖进行氧化还原反应，使寡糖结构中的还原性基团被氧化为羧基。而DNS被还原成3-氨基-5-硝基水杨酸，该物质在沸水浴中加热后呈红棕色，颜色的深浅与寡糖含量呈正比例关系，因此可通过比色法检测，从而实现简单快速地定量海藻寡糖。

(1)葡萄糖标准曲线的制作

分别取葡萄糖标准液(1mg/mL)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于15mL试管中，用蒸馏水补足至1.0mL,分别准确加入DNS试剂2mL，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15mL刻度。在540nm波长下测定吸光度。绘制以在540nm波长下的吸光度为横坐标以葡萄糖溶液浓度为横坐标的葡萄糖标准曲线，如图10所示。线性回归方程：Y＝0.0737X+0.00388，R

挑取平板上的菌落周围具有明显凹陷或水解圈的菌株，加入到含有2.5％海盐的无菌水中配置成浊度为0.5的菌悬液，充分混匀后，取100μL的菌悬液加入到配置好的10mL的以多糖(黄原胶、果胶、硫酸软骨素、壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、木聚糖、甘露聚糖、微晶纤维素、几丁质、卡拉胶)为唯一碳源的液体培养基中，每种多糖设置1组不加菌液的对照组和3组平行组，充分混匀后，在32℃的条件下150r/min震荡培养7天。

取3mL以多糖为唯一碳源的培养基中的培养基3mL至15mL的离心管中12000r/min离心10min，取1mL离心后的上清液于15mL的试管中，加2mL DNS试剂，沸水加热5min，使还原糖与DNS试剂充分反应，冷却后用蒸馏水补足到15mL，在540nm波长下测定吸光度，每个试管中的待测液都测量3次以减少误差。从标准曲线查出葡萄糖对应的浓度，计算出样品中还原糖含量，运用软件Origin 2023绘制柱状图可以得到图7。

4、本发明的具有较好降解多糖能力的菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagus degradans 2-40

在软件BRIG(v 0.95)(

KEGG数据库资源，用于从分子水平的信息，尤其是基因组测序和其他高通量生成的大规模分子数据集，去了解细胞、生物体和生态系统等生物系统的高水平功能和利用。其中KEGG PATHWAY是一组手动绘制的通路图，从Metabolism(新陈代谢)、GeneticInformation Processing(遗传信息处理)、Environmental Information Processing(环境信息处理)、Cellular Processes(细胞过程)、Organismal Systems(有机体系统)、HumanDiseases(人类疾病)与Drug Development(药物发展)七个大类代表了对分子相互作用、反应和关系网络的理解。根据菌株Saccharophagus degradans FZY0027的系统发育树结果，本研究选定同为噬糖菌属的标准菌株Saccharophagus degradans 2-40

CAZymes数据库(

4、结果分析

菌株Saccharophagus degradans FZY0027在透射电镜下的形态结构如图1所示，可见细胞为椭球形，有鞭毛。

菌株Saccharophagus degradans FZY0027基于16S rRNA基因序列构建的邻接法系统发育树如图2所示。菌株FZY0027与菌株降解糖噬糖菌Saccharophagus degradans聚集在一起，属于同一种属。

菌株Saccharophagus degradans FZY0027基于120个高度保守基因构建的最大似然法系统发育树如图3所示。菌株FZY0027与菌株Saccharophagus degradans 2-40

菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagus degradans 2-40

菌株Saccharophagus degradans FZY0027的卢戈氏碘液染色结果如图5所示，经卢戈氏碘液染色后，菌株Saccharophagus degradans FZY0027在菌落周围形成较大的透明圈。

对菌株Saccharophagus degradans FZY0027琼脂多糖降解能力的验证，采用DNS比色定糖法，用紫外可见分光光度计测定540nm波长处的吸光度，根据半乳糖标准曲线确定反应产生的还原糖的量，反应菌株Saccharophagus degradans FZY0027的琼胶酶活力，还原糖产量越多，琼胶酶活力越高。如图6所示，还原糖浓度在对数生长期及稳定期1-4d中呈上升趋势，菌株在稳定期时活细胞数目稳定且初级代谢积累物达到最高峰，并在第四天达到最高值。

对菌株Saccharophagus degradans FZY0027降解多糖能力验证，如图7所示，菌株FZY0027对淀粉、木聚糖、甘露聚糖和海藻酸钠表现出较强的多糖降解能力，但无法降解果胶、微晶纤维素、几丁质、卡拉胶、黄原胶及壳聚糖。

菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagus degradans 2-40

菌株FZY0027与菌株2-40T的对比

上表菌株Saccharophagus degradans FZY0027与菌株Saccharophagusdegradans 2-40

如图9所示，其中从上到下依次排列着的是表1中两菌株两两对应的蛋白质序列预测结构域。红色代表GHs结构域，蓝色代表CBMs结构域。

从菌株Saccharophagus degradans FZY0027与Saccharophagus degradans2-40

WP_011469134.1与QFX18_07375的结构域预测结果如下表所示。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。