一株植物乳杆菌YBYC113及其在宜宾芽菜发酵中的应用

技术领域

本发明涉及食品领域，尤其是利用微生物发酵芽菜技术领域，具体为一株植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)及其在宜宾芽菜发酵中的应用。

背景技术

宜宾芽菜是四川“四大腌菜”之一，以“香、甜、脆、嫩、鲜”等独特风味而闻名，是芥菜的嫩茎通过清洗、划丝、晾晒、腌制、发酵等工艺制作的一种传统蔬菜发酵产品。

宜宾芽菜原料常用的干燥方法是自然晾晒，但是这种干燥方法有很多缺点。其一是宜宾芽菜原料在自然晾晒时容易再次混入尘土、树叶等杂质，后续需要增加人工挑选的环节来去除这些杂质，花费大量时间和人力；其二是宜宾芽菜原料是一年一收，收获时间一般在3月上旬，因为3月的太阳光照较弱，所以宜宾芽菜原料自然晾晒干燥时间较长，正常情况下宜宾芽菜原料需要晾晒2－3天，并且晾晒期间有阴雨天时，干燥时间会延长至4－6天，严重时还会导致宜宾芽菜原料腐败变质；其三是不同批次宜宾芽菜原料因晾晒时天气不同会导致其干燥程度不统一，从而导致宜宾芽菜成品质量不统一。近年来人们也会用热风空气干燥的方法来烘干一些农副产品水分，这种用热风烘干的方法替代自然晾晒的方法虽然能缩短宜宾芽菜原料的干燥时间、避免干燥时受天气影响和保证干燥程度统一，但空气干燥箱中的持续的热风环境会导致宜宾芽菜的品质、口感和色泽不佳。

宜宾芽菜的常用发酵方式是自然发酵，农户为了保证宜宾芽菜发酵期间不会腐败，会在发酵时加入大量的食盐，这种自然发酵的宜宾芽菜存在一些问题。其一是购买大量食盐使得宜宾芽菜的发酵成本较高；其二是宜宾芽菜产品食盐含量过高，在发酵结束后需要进行脱盐工艺来降低成品中的食盐含量，同时也造成了大量营养物质的损失；其三是传统宜宾芽菜产品的亚硝酸盐含量较高；其四是宜宾芽菜的主要发酵微生物在高盐条件下受到抑制，会导致宜宾芽菜成品发酵风味不足；其五是宜宾芽菜发酵周期过长。近年来，众多专家学者提出选育优良的菌株接种发酵代替自然发酵来缩短腌制菜的发酵周期、降低亚硝酸盐的含量，同时还能使其发酵风味更加浓郁，使腌制菜产品质量更突出。

随着人们生活水平的提高，消费者对于低盐蔬菜的呼声越来越高，为了促使宜宾芽菜尽早达到低盐化和保证其质量，则需要改进传统工艺降低宜宾芽菜产品食盐含量，筛选出一株能增加宜宾芽菜风味的优良菌株，使宜宾芽菜在低盐量下发酵也能保持宜宾芽菜的良好的品质、口感和色泽，并且还能丰富宜宾芽菜的风味、缩短宜宾芽菜的发酵周期。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)，将该菌株用于宜宾芽菜制备过程中的发酵阶段，能降低宜宾芽菜发酵时食盐的使用量，缩短宜宾芽菜的发酵周期和丰富宜宾芽菜的发酵风味物质，在保证宜宾芽菜成品有良好的品质、口感和色泽。

本申请的另外一个发明目的是提供一种制备宜宾芽菜的方法，在该方法中采用了循环冷凝干燥后，能极大程度地缩短宜宾芽菜原料的干燥时间，避免宜宾芽菜原料干燥时有新的杂质混入、受天气影响以及腐败变质；还能控制和调节宜宾芽菜原料干燥程度，进而保证宜宾芽菜产品有良好的品质和质量统一。

为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：

一株植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)，已于2023年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231113，保藏单位地址为中国˙武汉˙武汉大学。

本发明的另外一个发明目的是提供一种植物乳杆菌YBYC113(lactobacillusplantarum)在宜宾芽菜发酵中的应用。

作为本申请中一种较好的优选方式，该植物乳杆菌YBYC113(lactobacillusplantarum)在缩短宜宾芽菜发酵周期、降低食盐的添加量、减少亚硝酸盐含量以及增加风味物质中的应用。

利用植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)制备宜宾芽菜的方法，包括以下步骤：

1)选好的芥菜，控制老茎和菜叶含量，并进行划丝处理；

选菜时注意将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，这样可以减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的水的流速为30－40m

2)循环冷凝干燥：将划丝后的菜放入循环冷凝干燥设备(通过传输装置不停地循环带走芽菜脱出的水分)脱除水分，干燥后的物质中水分含量为30－40％；

3)盐腌：将干燥后的菜加入食盐，采用一层菜一层盐码放；

4)拌料：将三萘粉、花椒粉、八角粉按比例混合后加入盐腌的菜中，并搅拌均匀；

5)标糖：将红糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，再加入到拌料后的菜中。优选一层菜一层糖液码放，着色均匀。

6)接种：将植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)接种到标糖后的菜中，并混合均匀。

7)装坛、封坛或窖：将接种后的菜装入坛或窖中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，将坛置于避光干燥通风处密封发酵45－60天，即得。随时注意给坛子边缘加水，避免水干。窖池一般要在地势较高、地下水位较低、背风向阳的地方，尽量避免阳光直射。

作为本申请中一种较好的优选方式，步骤1)中，控制老茎和菜叶的总含量小于3％；划丝长度为60－70mm，宽度和厚度为10－15mm。

作为本申请中一种较好的优选方式，步骤2)中循环冷凝干燥的温度为50－55℃，干燥时间为4－6h。

作为本申请中一种较好的优选方式，步骤3)中食盐的添加量为该步骤蔬菜质量的8％－10％。

作为本申请中一种较好的优选方式，步骤4)中三萘粉的添加量为当前蔬菜质量的0.05－0.20％；花椒粉的添加量为当前蔬菜质量的0.10－0.40％；八角粉的添加量为当前蔬菜质量的0.05－0.20％。

作为本申请中一种较好的优选方式，步骤5)的红糖水中红糖的含量为10－14wt％；步骤6)中植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)的接种采用植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)菌悬液，该菌悬液接种量为宜宾芽菜体积分数的0.8％－1.2％。

作为本申请中一种较好的优选方式，植物乳杆菌YBYC113(lactobacillusplantarum)菌悬液的制备步骤为：

①将植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)接种于MRS琼脂培养基进行活化，划线培养2次；

②取单菌落接种于MRS肉汤培养基，在温度37℃条件下培养18-24h，传代3次；

③将②中传代培养后的种子液移取400-500mL离心弃去上清液，水洗2-3次后加入0.85％的生理盐水制成1×10

本发明是对传统宜宾芽菜的干燥工艺进行改进，通过循环冷凝干燥替代传统的自然晾晒干燥(循环冷凝式烘干是空气经过加热器后被加热成干燥的热空气穿过宜宾芽菜原料变成冷湿空气；冷湿的空气经过冷凝系统变成干燥的冷空气，同时析出水分收集到储水盒中或由排水管直接排出，干燥的冷空气再次通过加热器变成干燥的热空气穿过宜宾芽菜原料，如此循环不断将产品的湿气排走，达到干燥宜宾芽菜原料的目的)；②对传统宜宾芽菜的发酵工艺改进，筛选出一株能增加宜宾芽菜风味的优良菌株并应用于宜宾芽菜的发酵，通过接种发酵来替代自然发酵。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(一)本发明的循环冷凝干燥工艺相较于传统自然晾晒工艺，不仅缩短了宜宾芽菜原料42h－44h的干燥时间，还解决了原料易腐败、易受天气影响和宜宾芽菜成品质量不均一等问题。

(二)本发明筛选了的能增加宜宾芽菜风味的植物乳杆YBYC113(lactobacillusplantarum)；接种植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)的宜宾芽菜相较于自然发酵的宜宾芽菜降低了2％－4％食盐的使用量、减少了58.6％－64.3％亚硝酸盐含量、升高了8.1－13.4感官评分、降低了0.24－0.57pH值、增加了宜宾芽菜的4－8种风味物质、缩短了33％－50％发酵周期，同时接种植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)的宜宾芽菜的茴香脑的占比比接种市售混菌的宜宾芽菜高5.01％。

(三)经过循环冷凝干燥工艺并接种植物乳杆菌YBYC113(lactobacillusplantarum)的宜宾芽菜保持了传统宜宾芽菜良好的品质、口感和色泽。

(四)本发明对于宜宾芽菜等发酵制品的应用有着广阔的前景。

附图说明

图1为是实施例1中菌株的生长曲线；

图2是LPYC－A16菌株基于16S rDNA基因序列建立的系统发育树；

图3是LPYC－A16菌株的电子显微镜图；

图4是实施例3具体工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

将筛选得到的植物乳杆菌LPYC－A16指定名称为植物乳杆菌YBYC113(lactobacillus plantarum)，于2023年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231113，保藏单位地址为中国˙武汉˙武汉大学。

在本申请中，％如无特殊说明，均表示为质量百分含量，即wt％。

实施例1优良菌株的分离、初筛、复筛和鉴定

1分离

源菌的收集：购买6份四川碎米芽菜有限公司的发酵2个月的宜宾芽菜，将芽菜样品混匀、研磨成浆状，加入无菌蒸馏水过滤后作为取样作为源菌。菌种的分离纯化：将源菌样品用浓度为0.85％的生理盐水稀释到适宜的浓度后，用MRS固体培养基进行平板倾注37℃培养48h，挑取溶钙圈直径较大且明显的单菌落，进行多次平板划线纯化。初筛得到45株菌，且均为革兰氏染色阳性、过氧化氢酶实验阴性菌，初步判断为乳酸菌。菌种的保藏：将分离纯化好的菌株接种到MRS固体培养基中，于37℃培养48h，挑取生长情况较好的单菌落接种于MRS肉汤培养基中，于37℃培养24h，将所得菌液加入到甘油体积分数为30％的甘油溶液中并在－20℃保存。

2初筛

将分离得到的45株菌接种于MRS固体培养基中，并加入培养基质量8％的NaCl，于37℃下恒温培养48h，选择4株在培养基上生长较好的菌株，分别编号为LPYC－A7、LPYC－A16、LPYC－A23、LPYC－A33。

3复筛

将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的饮用水的流速为35m

将发酵45天的芽菜样品从发酵坛中取出，采用顶空固相微萃取－气质联用法(SPME－GC－MS)，芽菜剪碎研磨均匀后，称取5.0g置于15mL的顶空进样瓶中，在70℃下加热平衡15min后吸附45min，在230℃下解析5min。(GC条件：DB－WAX色谱柱(60mm×250μm×0.25μm)；程序升温：初温50℃，保持3min，再以5℃/min到120℃，保持1min，再以10℃/min到230℃，保持5min；载气为氦气，不分流进样，体积流量为1.0mL/min。MS条件：离子源为EI源；离子化能量70eV，采集模式为全扫描，离子源温度230℃，MS四极杆温度150℃，溶剂延迟3min。)以茴香脑、棕榈酸乙酯的相对含量为指标，在LPYC－A7、LPYC－A16、LPYC－A23、LPYC－A33中筛选出最优良的菌株，具体结果如表1所示：

表1：接种LPYC－A7、LPYC－A16、LPYC－A23、LPYC－A33的宜宾芽菜发酵45天后的主要风味物质的相对含量

宜宾芽菜的主要风味物质为烃类和酯类，茴香脑、棕榈酸乙酯分别为宜宾芽菜中烃类、酯类风味物质的主要代表物质之一。如表1所示，接种LPYC－A16菌株发酵45天的宜宾芽菜的茴香脑、棕榈酸乙酯的相对含量高于接种LPYC－A7、LPYC－A23、LPYC－A33菌株发酵45天的宜宾芽菜。接种LPYC－A16菌株的宜宾芽菜更能增加其风味。

活化LPYC－A16菌种，制备种子液，按宜宾芽菜体积分数1.0％的接种量将菌株接种到MRS肉汤培养基中，20℃条件下培养。分别在0－48h每隔2h取5mL发酵液测OD600后，将OD600换算成细菌数，分别以细菌数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制菌株生长曲线图1。

4鉴定

取甘油保藏的菌株LPYC－A16于10mL MRS肉汤培养基中，37℃培养24h。取适量培养液离心10min(6000r/min)，弃去上清，采用DNA提取试剂盒提取菌体DNA，进行PCR扩增，PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序，获得16S rDNA片段的基因序列。通过NCBI的BLAST比对，并构建系统发育树(见图2)，将菌株LPYC－A16鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantar um)，其与Lactobacillusplantarumstrain K25和KCC－9处于一个分支。将L PYC－A16菌株指定为株号YBYC113(lactobacillus plantarum)后进行保藏，YBYC113(lactobacillus plantarum)已于2023年06月27号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国˙武汉˙武汉大学，保藏编号为CCTCC N O：M 20231113。

实施例2：植物乳杆菌LPYC－A16的生长特性

将植物乳杆菌LPYC－A16接种于MRS琼脂培养基，置于37℃倒置培养48h，观察菌落形态；挑取单菌落于载玻片上，经过适当稀释后，滴加1－2滴革兰氏染色剂，盖上盖玻片，静置5min后镜检，记录其细胞形态。

高倍镜下观察到结果如图3所示，植物乳杆菌LPYC－A16呈杆状，经革兰氏染色后呈蓝紫色，说明该菌为革兰氏阳性菌。该菌株在MRS琼脂培养基上生长时的菌落呈乳白色，边缘光滑，菌体凸起。

实施例3：循环冷凝芽菜原材料并接种发酵的宜宾芽菜

具体工艺流程图为图4，下面为具体实施步骤：

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的水的流速为40m

划丝：将选好的菜进行划丝处理，划丝长度在65mm，宽度和厚度在10mm。

循环冷凝干燥：将划丝后的菜放入循环冷凝干燥设备，通过传输装置不停地循环带走芽菜脱出的水分。循环冷凝干燥设备中的干燥温度为55℃左右，干燥时间为4h；干燥后的原料中含水量为38％左右。

盐腌：向经循环冷凝干燥后的菜中加入占菜质量10％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：以该步骤中的蔬菜质量计，将三萘粉(占蔬菜质量的0.10％)、花椒粉(占蔬菜质量的0.30％)、八角粉(占蔬菜质量的0.10％)混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖的质量含量为10％，将红糖水加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，使着色均匀。

植物乳杆菌LPYC－A16接种液制备：①将筛选出的植物乳杆菌LPYC－A16(植物乳杆菌YBYC113，lactobacillus plantarum)接种于MRS琼脂培养基进行活化，划线培养2次；②取单菌落接种于MRS肉汤培养基，在温度37℃条件下培养18h，传代3次；③将②中传代培养后的种子液移取400mL离心弃去上清液，水洗2次后加入0.85％的生理盐水制成1×10

接种：将植物乳杆菌LPYC－A16以宜宾芽菜体积的1.0％的接种量接种到标糖后的菜中，混合均匀，进行发酵。

装、封坛：将接种后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干，密封发酵50天，得宜宾芽菜。

实施例4：循环冷凝芽菜原材料并接种发酵的宜宾芽菜

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的饮用水的流速为35m

划丝：将挑选好的宜宾芽菜原料进行划丝处理，划丝长度在60mm，宽度和厚度在12mm。

循环冷凝干燥：将划丝好的菜放入循环冷凝干燥设备，通过传输装置不停地循环带走芽菜脱出的水分。循环冷凝干燥设备中的干燥温度为50℃，干燥时间为6h，干燥后的含水量为32％。

盐腌：向循环冷凝干燥后的菜中加入占菜质量为8％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：以该步骤中的蔬菜质量计，将三萘(占蔬菜质量的0.15％)、花椒(占蔬菜质量的0.35％)、八角(占蔬菜质量的0.15％)磨成粉按比例混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖的含量为12％，将红糖水加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，使着色均匀。

植物乳杆菌LPYC－A16接种液制备：①将筛选出的植物乳杆菌LPCY－A16接种于MRS琼脂培养基进行活化，划线培养2次；②取单菌落接种于MRS肉汤培养基，在温度37℃条件下培养24h，传代3次；③将②中传代培养后的种子液移取400mL离心弃去上清液，水洗3次后加入0.85％的生理盐水制成1×10

接种：将植物乳杆菌LPYC－A16以宜宾芽菜体积的1.2％的接种量接种到标糖后的菜中，混合均匀，进行发酵。

装、封坛：将接种后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干，密封发酵60天，即得。

实施例5：循环冷凝芽菜原材料并接种发酵的宜宾芽菜。

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的饮用水的流速为30m

划丝：将挑选好的宜宾芽菜原料进行划丝处理。划丝长度在70mm，宽度和厚度在15mm。

循环冷凝干燥：将划丝好的菜放入循环冷凝干燥设备，通过传输装置不停地循环带走芽菜脱出的水分。在53℃的干燥温度下干燥，干燥时间为5h，干燥后的原料中含水量为35％左右。

盐腌：将循环冷凝干燥后的菜加入菜质量的8％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：以该步骤中的蔬菜质量计，将三萘(0.20％)、花椒(0.35％)、八角(0.20％)磨成粉按比例混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖含量为12％，加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，着色均匀。

植物乳杆菌LPYC－A16接种液制备：①将筛选出的植物乳杆菌LPCY－A16接种于MRS琼脂培养基进行活化，划线培养2次；②取单菌落接种于MRS肉汤培养基，在温度37℃条件下培养24h，传代3次；③将②中传代培养后的种子液移取500mL离心弃去上清液，水洗3次后加入0.85％的生理盐水制成1×10

接种：将植物乳杆菌LPYC－A16以宜宾芽菜体积的1.2％的接种量接种到标糖后的菜中，混合均匀，进行发酵。

装、封坛：将接种后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，密封发酵45天，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干。

对比例1：循环冷凝芽菜原料后自然发酵的宜宾芽菜

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的水的流速为35m

划丝：将选好的菜进行划丝处理，划丝长度在60mm，宽度和厚度在12mm。

循环冷凝干燥：将划丝后的菜放入循环冷凝干燥设备，通过传输装置不停地循环带走芽菜脱出的水分。在50℃的干燥温度下干燥，干燥时间为6h，干燥后的含水量为38％。

盐腌：将循环冷凝干燥后的菜加入菜质量的12％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：将三萘粉(0.15％)、花椒粉(0.35％)、八角粉(0.15％)混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖含量为12％，加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，着色均匀。

装、封坛：将标糖后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，密封发酵60天，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干。

对比例2：自然晾晒后接种植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的水的流速为35m

划丝：将选好的菜进行划丝处理，划丝长度在60mm，宽度和厚度在12mm。

自然晾晒：将划丝后的菜放到有充足阳光的空地进行自然晾晒，在不下雨的情况下晾晒48h。

盐腌：将晾晒后的菜加入菜质量的8％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：将三萘粉(0.15％)、花椒粉(0.35％)、八角粉(0.15％)混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖含量为12％，加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，着色均匀。

植物乳杆菌LPYC－A16接种液制备：①将筛选出的植物乳杆菌LPCY－A16接种于MRS琼脂培养基进行活化，划线培养2次；②取单菌落接种于MRS肉汤培养基，在温度37℃条件下培养24h，传代3次；③将②中传代培养后的种子液移取400mL离心弃去上清液，水洗3次后加入0.85％的生理盐水制成1×10

接种：将筛选出的植物乳杆菌LPYC－A16接种到标糖后的菜中，植物乳杆菌LPYC－A16以宜宾芽菜体积的1.2％的接种量接种，混合均匀。

装、封坛：将接种后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，密封发酵60天，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干。

对比例3：自然晾晒后自然发酵的传统宜宾芽菜

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的水的流速为35m

划丝：将选好的菜进行划丝处理，划丝长度在60mm，宽度和厚度在12mm。

自然晾晒：将划丝后的菜放到有充足阳光的空地进行自然晾晒，在不下雨的情况下晾晒48h。

盐腌：将晾晒后的菜加入菜质量的12％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：将三萘粉(0.15％)、花椒粉(0.35％)、八角粉(0.15％)混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖含量为12％，加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，着色均匀。

装、封坛：将标糖后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，密封发酵60天，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干。

对比例4：自然晾晒后自然发酵的宜宾芽菜

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的水的流速为35m

划丝：将选好的菜进行划丝处理，划丝长度在60mm，宽度和厚度在12mm。

自然晾晒：将划丝后的菜放到有充足阳光的空地进行自然晾晒，在不下雨的情况下晾晒48h。

盐腌：将晾晒后的菜加入菜质量的12％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：将三萘粉(0.15％)、花椒粉(0.35％)、八角粉(0.15％)混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖含量为12％，加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，着色均匀。

装、封坛：将标糖后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，密封发酵90天，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干。

对比例5：循环冷凝芽菜原材料并接种混菌发酵的宜宾芽菜

选菜：将新鲜二平桩芥菜用饮用水进行冲洗除去芥菜表面污染物，减少微生物及农药残留并进行挑选。冲洗宜宾芽菜原料用的饮用水的流速为35m

划丝：将挑选好的宜宾芽菜原料进行划丝处理，划丝长度在60mm，宽度和厚度在12mm。

循环冷凝干燥：将划丝好的菜放入循环冷凝干燥设备，通过传输装置不停地循环带走芽菜脱出的水分。在50℃的干燥温度下干燥，干燥时间为6h，干燥后的含水量为32％。

盐腌：将循环冷凝干燥后的菜加入菜质量的8％的食盐，一层菜一层盐码放。

拌料：将三萘(0.15％)、花椒(0.35％)、八角(0.15％)磨成粉按比例混合加入盐腌的菜中，搅拌均匀。

标糖：将食糖加水后熬制至颜色焦黄和有明显甜香气，红糖水中红糖含量为12％，加入到拌料后的菜中进行标糖，一层菜一层糖液码放，着色均匀。

接种：将市售由江南大学联合实验室研发的混合菌粉(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌等)以宜宾芽菜体积的1.2％的接种量接种到标糖后的菜中，混合均匀，进行发酵。

装、封坛：将接种后的菜装入坛中，一层层装入并压实，后密封严实，不留空隙，密封发酵60天，将坛置于避光干燥通风处，尽量避免阳光直射，随时注意给坛子边缘加水，避免水干。

表2：芽菜感官评价表

感官品评：邀请10位年龄在20－35周岁具有一定专业技能基础的品评员进行感官评价，对芽菜的色泽、香气、滋味及质地进行感官品评。

具体结果见表3。

表3：实施例3－5与对比例1－5工艺下宜宾芽菜产品的干燥时间、亚硝酸盐含量、感官评分、pH及色差L＊值的结果

亚硝酸盐的测定：参照GB5009.33－2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法测定。

pH值的测定：参照GB10468－89《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》加以改进：取20.0g粉碎后的芽菜样品，加入2倍的去离子水，置于70℃的水浴锅中30min，取出冷却至室温，过滤出约30mL的滤液，用pH计测定芽菜滤液的pH，平行测定3次。

色差的测定：将芽菜剁碎采用UltraScanVIS台式色差仪分别测定芽菜的L＊值，每个样品经过一次测定后分别向左上、右下平移2cm后各测定1次。

亚硝酸盐含量是宜宾芽菜等腌制菜中一个很重要的食品安全指标，根据GB2714－2015要求的国标限量，要求酱腌菜的亚硝酸盐含量必须在20mg/kg以下。pH值会影响宜宾芽菜的微生物的发酵，宜宾芽菜的发酵主要是以乳酸菌为主，乳酸菌的最适pH为4.2－4.6之间。色差L＊值是衡量物品黑白的一个亮度指标，数字越小，说明被测量的物品越趋近黑色。

实施例3－5与对比例1－5工艺下宜宾芽菜产品的亚硝酸盐含量都在国标限量内。将实施例3－5与对比例1的结果对比可知，接种植物乳杆菌LPYC－A16能有效地降低亚硝酸盐含量，亚硝酸盐含量降低了58.6％－64.3％；实施例3－5的感官评分比对比例1的感官评分高8.1－13.4，接种植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜比未接种的宜宾芽菜在感官上更好；接种植物乳杆菌LPYC－A16也能使得宜宾芽菜的pH能更低且在4.2－4.6，从而有利于宜宾芽菜发酵过程中发挥主要作用的乳酸菌的发酵，有利于缩短宜宾芽菜的发酵周期，还能较为快速地降低宜宾芽菜产品的色差L＊值。

将实施例3－5与对比例2的结果对比可知，循环冷凝干燥后的宜宾芽菜与自然晾晒的宜宾芽菜的亚硝酸盐含量、感官评分和pH相近，色差L＊值降低了4.0－7.3。

将实施例3－5与对比例3的结果对比可知，循环冷凝干燥后接种植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜与传统宜宾芽菜相比，亚硝酸盐含量降低了63.7％－68.7％、感官评分升高了11.2－16.5、pH降低了0.20－0.53、色差L＊值降低了10.2－13.5。

将对比例3和对比例4的结果对比可知，随着发酵时间增加，宜宾芽菜的亚硝酸盐含量降低、感官评分升高、pH降低和色差L＊值降低。

将实施例3－5与对比例4的结果对比可知，实施例3－5与对比例4的亚硝酸盐含量、pH和色差L＊值相近，感官评分上实施例3－5略高于对比例4。

将实施例4与对比例5的结果对比可知，接种植物乳杆菌发酵的宜宾芽菜与接种混菌发酵的宜宾芽菜的亚硝酸盐含量、感官评分、pH和色差L＊值相近。

表4：实施例3－5与对比例1－5工艺下宜宾芽菜产品的加盐量、发酵时间、风味物质种类数和主要风味物质及其占比的结果

采用顶空固相微萃取－气质联用法(SPME－GC－MS)，芽菜剪碎研磨均匀后，称取4.0g置于15mL的顶空进样瓶中，在70℃下加热平衡15min后吸附45min，在230℃下解析5min。GC条件：DB－WAX色谱柱(60mm×250μm×0.25μm)；程序升温：初温50℃，保持3min，再以5℃/min到120℃，保持1min，再以10℃/min到230℃，保持5min；载气为氦气，不分流进样，体积流量为1.0mL/min。MS条件：离子源为EI源；离子化能量70eV，采集模式为全扫描，离子源温度230℃，MS四极杆温度150℃，溶剂延迟3min。

对比例1、3、4中8％的加盐量进行发酵会造成部分宜宾芽菜样品在发酵过程中腐败变质，经测试后发现12％的加盐量能防止宜宾芽菜的腐败变质，所以对比例1、3、4选用12％的加盐量进行发酵。实施例3－5和对比例2能在8％－10％的加盐量下正常发酵的原因是接种的植物乳杆菌是乳酸菌能抑制腐败菌的生长。茴香脑是宜宾芽菜的主要风味物质之一，它具有特殊的茴香气味和相应的甜味，可用于绝大部分食品，特别是糕点食品的加香。

将实施例1－3与对比例1的结果对比可知，经循环冷凝干燥并发酵后，接种植物乳杆菌LPYC－A16发酵的宜宾芽菜比未接种发酵的宜宾芽菜风味物质种类多4－8种，说明接种植物乳杆菌LPYC－A16能使得宜宾芽菜的气味更加丰富并且接种了植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜的茴香脑比未接种的宜宾芽菜茴香脑占比更多；将实施例3－5与对比例2的结果对比可知，循环冷凝干燥后的宜宾芽菜与自然晾晒的宜宾芽菜风味物质种类数差别不大，但后者茴香脑百分占比高于前者；将实施例3－5与对比例3的结果对比可知，接种了植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜比传统宜宾芽菜的风味物质多1－5种，将对比例3与对比例4的对比结果可知，宜宾芽菜会随着发酵时间的增加，风味物质会变得更加丰富，茴香脑的占比也在增加；将实施例3－5与对比例4的结果对比可知，实施例3－5与对比例4的风味物质种类数和茴香脑占比相近；将实施例4与对比例5的结果对比可知，对比例5的风味物质种类数比实施例4多2种，而实施例4的茴香脑的占比比对比例5高5.01％。

综合表3－4的结论可知，本发明的循环冷凝干燥工艺相较于传统自然晾晒工艺，不仅宜宾芽菜原料的干燥时间缩短了42h－44h，而且色差L＊值还降低了4.0－7.3；接种植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜相较于自然发酵的宜宾芽菜食盐的使用量降低了2％－4％、亚硝酸盐含量减少了58.6％－64.3％、pH降低了0.24－0.57、风味物质增加了4－8种。经循环冷凝干燥后接种植物乳杆菌LPYC－A16发酵45－60天的宜宾芽菜与自然晾晒自然发酵90天的宜宾芽菜相比，亚硝酸盐含量、感官评分、pH、色差L＊值、风味物质的种类数和主要风味物质相对含量相近，同时接种植物乳杆菌LPYC－A16的宜宾芽菜的茴香脑的占比比接种市售混菌的宜宾芽菜高5.01％，说明通过本发明的方法能降低食盐的添加量、缩短宜宾芽菜33％－50％发酵周期、丰富风味物质种类的同时能保持其良好的品质、口感和色泽。

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。