红球藻活性因子和干细胞在皮肤修复中的应用

技术领域

本发明涉及生物药物领域，更具体的，红球藻活性因子和干细胞在皮肤修复 中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的逐步提升，人们对延缓皮肤衰老的需求愈加强烈，保护 皮肤的意识也逐渐提高。皮肤是人体与外界环境隔离的第一道屏障。在户外，皮 肤无时无刻不暴露在紫外线(Ultraviolet，UV)辐照中。流行病调查和实验室研究 已经证实持续暴露UV(包括UVA和UVB)可引发急性或慢性的皮肤失调、损伤、 皮肤癌和皮肤老化等皮肤病变。UV辐射是造成皮肤外源性老化的主要因素，因 此如何预防皮肤暴露UV或缓解皮肤UV损伤，从而延缓皮肤光老化日益受到人 们的关注。

皮肤老化是一个复杂的生物学过程，分为内源性老化和外源性老化两种类 型。内源性老化是随时间推移而发生的皮肤老化，存在基因依赖性。外源性老化 是由外界环境因素引起，其中UV辐射为主要因素，占外界影响的80％，因此外 源性老化又被称为光老化。根据波长，UV分为UVA(320～400nm)，UVB(280～ 320nm)和UVC(100～280nm)。UV在通过地球大气层时，UVC被过滤掉。UVB 的波长较短，比UVA的能量强30～40倍，UVB可大部分被表皮层吸收，主要 引起皮肤红斑、灼伤、皮肤癌和免疫抑制。而UVA是较大波长的紫外线，可渗 透到皮肤深层的真皮层。UVA是皮肤暴露的紫外线的主要成分(95％)，普遍认为 UVA具有弱致癌性，但却是皮肤光老化的主要成因。目前，抗UV的研究重点 集中于UVB，例如SPF就是基于对UVB的防护制定的防晒系数，但已有研究 逐渐转向防护UVA对皮肤的伤害。光老化最为显著的临床特征是皮肤干燥、松 弛结节、细纹增多、弹性下降以及色斑沉着。组织学上，光老化皮肤的黑色素细 胞增多，色素过度沉着，朗格汉斯细胞明显减少，真皮层增厚，胶原蛋白纤维的 显著减少，但弹性纤维却大量增多变性。细胞水平光老化的特征主要表现为活性 氧自由基(re-activeoxygenspecies，ROS)的过度蓄积以及细胞外基质成分的改变。 UV照射使表皮晒伤和产生红斑，这与炎症介质如前列腺素(PG)、白细胞三烯等 的产生有关。COX具有两种酶的功能：COX催化花生四烯酸(AA)生成前列素 G2(PGG2)和O；过氧化酶催化PGG2生成前列素H2(PGH2)和2个不配对电子， 由此可生成氧自由基J。最近的研究证实，uV照射可以诱导HaCaT中COX-2表 达，信号转导机制显示酪氨酸激酶和活性氧中间产物促进COX-2mRNA的表达。 提示COX-2表达的增加在UV诱导的炎症和肿瘤发生中发挥重要作用。通过抑制COX-的活性，即可用于治疗UV诱导的炎症。

虾青素属于一类天然存在于微藻、甲壳类、鱼类和一些鸟类等生物中的类胡 萝卜素，因其强大的抗氧化能力而被归类为叶黄素。雨生红球藻在压力环境条件 下积累虾青素，是自然界中虾青素最丰富的来源，含量可以高达％。类胡萝卜素， 包括虾青素和岩藻黄素，被称为单线态氧猝灭剂。这些光合色素通过将多余的能 量以热量的形式消散并返回到初始基态来减轻与紫外线照射相关的有害影响。许 多研究表明，岩藻黄素比最常见的陆源抗氧化剂和类胡萝卜素具有更好的抗氧化 和光保护性能。最初，人们认为MAA在到达关键细胞目标之前仅通过吸收UV 起作用，但有研究发现来自各种物种的不同MAA也具有抗氧化特性，这是光保 护分子非常理想的特性。

近年来再生医学成为众多医学研究工作者的研究重点，再生医学即应用自身 的干细胞或者生长因子来修复自身受伤组织。脂肪间充质干细胞因具有多向分化 的性质而被应用，其分泌的生长因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛 素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子，这些细胞生 长因子能控制或者维持受伤组织细胞，引导其自身修复。目前，ADSC抗氧化的 研究不多见，但是已经有部分研究显示干细胞分泌的细胞因子对氧化损伤具有保 护作用。IGF能减少成纤维细胞与肠上皮细胞的氧化损伤；HGF对谷胱甘肽缺 乏症引起的视网膜色素上皮细胞氧化损伤有保护效果。白介素-6(IL-6)能减少 双氧水引起的上皮细胞的死亡率。这些研究均表明ADSC具有抗氧化作用。研 究表明，脂肪间充质干细胞及其条件培养基(ADSC-CM)能够促进受伤组织中 成纤维细胞中胶原蛋白的合成和转移。ADSC-CM通过下调B16黑色素瘤细胞中 酪氨酸及酪氨酸相关蛋白表达从而降低黑色素的形成。ADSC及其分泌的生长因 子对UVB引起的成纤维细胞也具有保护作用。临床研究表明，注射自体分离的 脂肪间充质干细胞，能使真皮厚度增加20-30％,同时减少皱纹形成。这些研究都 表明脂肪间充质干细胞及其条件培养基具有抗皮肤光老化的作用。

虽然现有技术中通过抑制COX-2活性或者采用虾青素或者采用干细胞都可 以用于治疗UV诱导的验证，但是目前将这些药物组合使用的研究还不多，治疗 效果也不好预期。

发明内容

一方面，本发明提供了一种COX-2单克隆抗体。

本发明的COX-2单克隆抗体通过鉴定发现具有较好的特异性，只能特异性 的结合人COX-2，而不与鼠COX-2结合，也不与其他蛋白结合，具有极好的特 异性。

COX-2单克隆抗体C6A4，其抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示， 重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗COX-2抗体，所述分离的抗 COX-2抗体包含：V

在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗COX-2抗体，所述分离的抗 COX-2抗体包含Fc片段。在一些实施例中，所述分离的抗COX-2抗体是全长 的IgG抗体。在一些实施例中，所述分离的抗COX-2抗体是全长的IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4抗体。在一些实施例中，所述分离的抗COX-2抗体是嵌合的、全 人的或人源化的。在一些实施例中，所述分离的抗COX-2抗体是抗原结合片段， 所述抗原结合片段选自由Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链抗体(scFv)、 Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体(nanobody)、双链抗体(diabody)和线性抗体。

本文所鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源 性”被定义：在认为保守性取代属于序列同一性的一部分的情况下进行序列对比， 候选序列与待比较多肽序列中相同氨基酸残基所占的百分比。可以通过本领域技 术范围内的多种比对方式来确定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件等可公开 获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括 在所比较序列的全长上实现最大化比对所需的任何算法。进一步的，本发明还提 供了COX-2单克隆抗体在制备用于治疗基于紫外线损伤的皮肤修复药物中的用 途。

在一些实施例中，所述抗COX-2抗体与非靶标结合的Kd值为10

在一些实施例中，提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如上所述任 一种抗COX-2抗体。在一些实施例中，提供一种载体，所述载体包含如上所述 任一种核酸分子。在一些实施例中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上 所述任一种抗COX-2抗体、如上所述任一种核酸分子或如上所述任一种载体。 在一些实施例中，提供一种制备抗COX-2抗体的方法，其包含：a)在能有效表 达抗COX-2抗体的条件下培养上述任一种宿主细胞；和b)从所述宿主细胞中获 得所表达的抗COX-2抗体。

进一步的，本发明还提供了COX-2单克隆抗体在制备用于治疗基于紫外线 损伤的降低HaCaT细胞凋亡的药物中的用途。

进一步的，所述药物含有可接受的载体。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓 冲剂如：磷酸盐、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防 腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵； 苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸 丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残 基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或 赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复 合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN

间充质干细胞在一些特定环境刺激下能促进细胞因子的分泌，这些细胞因子 能够促进皮肤损伤的修复。

所述的间充质干细胞可以是脐带间充质干细胞，其是通过商业购买的，或者 是通过脐带分离获得的，所述分离采用本领域常规的分离方法制备获得。

进一步的，本发明还提供了红球藻活性因子。

进一步的，本发明还提供了红球藻活性因子的制备方法，具体的包括制备红 球藻，然后提取其中的活性因子，该活性因子主要成分是虾青素，所述虾青素在 本领域具有抑制紫外线对皮肤损伤作用的效果。

进一步的，本发明还提供了COX-2单克隆抗体和脐带间充质干细胞细胞因 子以及红球藻活性因子在制备用于治疗基于紫外线损伤的降低HaCaT细胞凋亡 的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了COX-2单克隆抗体和脐带间充质干细胞细胞因 子以及红球藻活性因子在制备用于治疗基于紫外线损伤的降低皮肤损伤的药物 中的用途。

进一步的，所述药物含有可接受的载体。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓 冲剂如：磷酸盐、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防 腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵； 苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸 丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残 基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或 赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复 合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN

有益效果

本发明提供了脐带间充质干细胞细胞因子以及红球藻活性因子，二者均具有 抑制紫外线对皮肤损伤的效果，同时基于COX-2蛋白靶点，开发了特异性抑制 COX-2的单克隆抗体，所述抗体能够有效的抑制皮肤被紫外线损伤，同时与脐 带间充质干细胞细胞因子以及红球藻活性因子一起联用后，更是能够有效的抑制 皮肤细胞被紫外线照射后诱导的细胞凋亡，具有较好的应用前景。

附图说明

图1单抗对紫外线照射诱导的HaCaT细胞凋亡的影响

图2脐带间充质干细胞活性因子对人皮肤细胞抗氧化能力的影响

图3各组分协同作用降低紫外线照射诱导的HaCaT细胞凋亡的影响

具体实施方式

本领域的技术人员将认识到在本申请的范围和宗旨内可能的若干实施例。现 在将通过参考以下非限制性实施例来更详细地描述本申请。以下实施例进一步阐 明本申请，但不应解释为以任何方式进行限制其范围。

实施例1 COX-2单克隆抗体抑制剂的制备

以重组的COX-2作为免疫原。其购买自欣博盛生物，货号：60122。

用弗氏完全佐剂乳化，免疫周龄雌性Balb/c小鼠，皮下注射，每只小鼠6 点，剂量为120μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂乳化， 剂量为60μg/只。第3次加强免疫后7天，以间接ELISA检测小鼠血清中抗免疫 原的多抗效价，效价最高的4号小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混 匀，剂量为60μg/只。冲击免疫一周后，取脾脏制备细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细 胞SP2/0按细胞数量10：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养 液轻轻混悬，分散融合细胞到96孔细胞培养板中，220μl/孔，置37℃、5％CO

腹水诱生法制备C6A4和C8H5单克隆抗体：分别取对数生长期C6A4和 C8H5细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数5×10

单克隆抗体特性鉴定：亚型检测：选用Mouse Immunoglobulin Isotyping ELISA试剂盒(BD)，按操作说明，羊抗鼠IgG板子包被、封闭。取杂交瘤上 清，进行检测。结果显示，C6A4和C8H5单克隆抗体均为IgG1、λ型鼠源单克 隆抗体。

纯化后抗体效价检测：用PBS(pH 7.2)稀释包被重组的COX-2，1μg/mL， 每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS洗3次，每孔 加入200μL封闭液(含3％BSA的PBS)，37℃下孵育1小时，倾空液体，备 用。每孔加入稀释好的抗体溶液，1:3做梯度稀释，每孔100μL反应液，37℃ 下孵育1小时，倾空液体，用PBST清洗3次。用封闭液1:10000稀释HRP标 记的羊抗鼠抗体Anti-MouseIgG(Fc specific)(sigma公司)，每孔分别加入100μL，37℃下孵育1小时，倾空液体，用PBST清洗3次。每孔加100μLTMB显色液 进行显色反应，测定450nm波长下的OD值。结果如下表1所示。

表1单抗效价

从表1的结果可以看出，C6A4和C8H5单克隆抗体的效价均达到了1： 5.12×10

实施例2 COX-2单克隆抗体C6A4的亲和力测定及可变区序列测定

用CBS液将COX-2蛋白稀释成浓度1μg/mL和2μg/mL的包被液分别包被 酶标板，通过间接ELISA法测定单抗腹水效价，以单抗浓度为横坐标，OD450 值为纵坐标，绘出相应的2条间接ELISA反应曲线，以每条曲线上部平坦段的 OD450值作为100％，在曲线上算出50％OD450值时对应的抗体浓度。按照公式 Kaff＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算单抗的亲和常数，其中n＝[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、 [Ag′]t为2个不同的包被原浓度，[Ab]t、[Ab′]t为各包被原浓度下50％OD450 值对应的抗体浓度。根据亲和力测定结果计算出C6A4单克隆抗体解离常数Kd 值为6.23×10

取培养的杂交瘤细胞，离心取上清，将细胞沉淀委托上海生工进行抗体重链 和轻链可变区序列测定，结果显示抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示， 重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例3 C6A4单抗对紫外线照射诱导的HaCaT细胞凋亡的影响

HaCaT细胞贴壁培养于含10％胎牛血清的DMEM中，并置于37℃、5％CO

结果如图1所示，从图1的结果可以看出，正常对照组(即未给予UV照射 和实验处理的细胞)凋亡率约为5.00％，经过UV照射没有实验处理的空白给药 对照组细胞的凋亡率达到了37.12％，这也说明UV照射可以诱导HaCaT细胞发 生凋亡。而经过单抗处理后再经过UV照射，细胞凋亡率随抗体浓度的增加而逐 渐降低，具有较好的浓度依赖性，在浓度为200μg/mL C6A4单抗处理条件下， 细胞凋亡率只有6.83％，与不采用抗体处理相比差异极其显著，P<0.01。结果显 示本发明的抗体在相同浓度下比阳性对照NS398能更有效抵抗UV照射诱导的 细胞凋亡。

实施例4红球藻活性因子制备方法

将雨生红球藻(GY-D2 Haematococcus pluvialis)(购买自上海光语生物科技有限公司)以BBM为基本培养基，BBM培养基组分如下：NaNO

藻种经BBM培养基23℃下培养10d,经低速离心沉淀,弃去上清液, 加入缺氮培养基(BBM培养基中去掉氮元素),5000lx光照强度下继续培养7 d。离心，收集藻体，干燥后保存。

取5.0g前述培养的红球藻藻体，加入纤维素酶液(0.6mg/mL)200mL， 在50℃的条件下破壁30min，然后在5000rpm条件下离心5min，弃上清后， 将500mL的丙酮加入藻粉中，浸提40min，再次离心后，弃去下层沉淀得到 了粗提液。将粗提液浓缩蒸干，即到红球藻活性因子。

红球藻活性因子中虾青素含量的计算：准确称取2.5mg虾青素纯样品,用氯 仿溶解,并定容至25mL,分别准确移取出0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL,用氯仿 稀释并定容至50mL,于490nm处测吸光值.根据虾青素样品绘制的标准曲线计算 红球藻活性因子整个样品中虾青素的含量为146mg，具体提取效率为29.2mg虾 青素/g(红球藻干重)。

实施例5脐带间充质干细胞活性因子的制备

无菌条件取足月产的婴儿脐带10cm，D-Hanks液洗干净至组织无血色，去 除表皮、两条动脉血管及一条静脉血管，将组织剪碎至大约1mm3/块，加入含 10％FBS的DMEM/F12培养基(含双抗)，37℃、饱和湿度、5％CO2培养大约 一个星期，即可得到原代人脐带间充质干细胞。细胞融合度80％时，0.25％的胰 蛋白酶(含0.02％EDTA)消化细胞传代培养，取第3代的细胞实验。

取第3代干细胞，10％FBS DMEM/F12培养基培养细胞，当细胞融合度80％ 时，弃含10％FBS的培养基上清，PBS(pH＝7.0)洗涤细胞三次，加入PBS(pH＝7.0) 孵育细胞，用灭菌好的Tips在细胞表面来回摩擦损伤细胞，10摄氏度低温处理 1h，随后20μW/cm

人真皮成纤维细胞生长至融合度70％时，用含10％FBS的DMEM/F12培养 基稀释USFM至终浓度(干细胞活性因子高剂量组为20μg/ml，低剂量组为10 μg/ml)，加入人真皮成纤维细胞共培养，VitC100μg/ml为阳性药对照，同时不 处理的正常细胞为正常组，经过UV处理而不加药物的为模型组。培养12h后， UVA辐射强度为200μW/cm

从图2的结果可以看出，干细胞活性因子高、低计量都能在不同程度上提高 细胞内SOD酶的活性，干细胞活性因子高剂量组(20μg/ml)预处理组细胞内 SOD酶活性是46.88±1.21U/ml；干细胞活性因子低剂量组(10μg/ml)是 43.26±2.03U/ml。结果表明，干细胞活性因子能提高细胞内SOD酶活性，从而 减少因紫外线辐射诱导产生的氧自由基对细胞的攻击与损伤，降低细胞的凋亡 率。

实施例6各组分协同作用降低紫外线照射诱导的HaCaT细胞凋亡的影响

HaCaT细胞贴壁培养于含10％胎牛血清的DMEM中，并置于37℃、5％CO

1组为空白给药对照组；

2组为分别加入C6A4单抗200μg/mL+实施例4制备的红球藻活性因子 200μg/mL+干细胞活性因子20μg/ml；

3组为分别加入实施例4制备的红球藻活性因子200μg/mL+干细胞活性因子 20μg/ml；

4组为实施例4制备的红球藻活性因子200μg/mL；

每个浓度设4个复孔。孵育4h后，接受长波紫外线/中波紫外线(UVA/UVB) 照射。96孔培养板用铝泊纸做避光处理，解开需要处理的细胞孔，以SS-05紫 外线光疗仪进行光照射，紫外线与细胞之间的距离为20cm，照射剂量分别设定 为：UVA/UVB(1.00/0.02J/cm2)，同时设置正常对照组(不照光组)。每组4个复孔。 照光完毕后继续培养12h。消化贴壁细胞，并用含10％胎牛血清DMEM培养液 配成单细胞悬液，调整细胞密度约1×10

从图3的结果可以看出，采用C6A4单抗200μg/mL+实施例4制备的红球藻 活性因子200μg/mL+干细胞活性因子20μg/ml三个组分联合使用后，能够显著 的降低细胞的凋亡率，其凋亡率只有(2.03±0.38)％，与1组相比差异极其显 著(P<0.01)。3组和4组分别是采用二种组分或者1中组分对凋亡率的抑制效 果就没有1组的效果好，这充分说明三种组分一起使用能够显著的抑制细胞的凋 亡，具有极好的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限 制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术 人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对 其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技 术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。