一种食品中微生物的富集方法

技术领域

本发明涉及微生物富集技术领域，具体为一种食品中微生物的富集方法。

背景技术

微生物广泛分布于地球表面各处，一些有害微生物正在对人类生活造成危害。例如食品加工和运输过程中的微生物污染，水样中一些肠道致病菌的污染以及临床常见的血流感染，这些微生物的污染都对人类生命健康造成威胁。而对于感染性疾病的诊断一般是通过微生物检测明确病原体，进而通过病原体采取有针对的治疗方案。细菌培养是鉴定细菌的金标准，但是耗时长，阳性率不高，同时容易受到微生物污染。所以需要更加快速和可靠的方法用于微生物鉴定，甲烷是一种污泥厌氧消化的产物，同时也是一种潜在高效的电子供体和碳源。反硝化厌氧甲烷氧化(denitrifying anaerobic methane oxidation，DAMO)是由DAMO古菌和DAMO细菌驱动的分别以NO

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种食品中微生物的富集方法，以解决背景技术中提到的技术问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种食品中微生物的富集方法，包括以下步骤：

步骤一：食品混合物包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节；

步骤二：制备无机培养基：将酸性微量元素溶液、碱性微量元素溶液、CaCl2、KHCO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4加入至去离子水中，用HCl调节pH，配成培养基，向配置好的培养基中通入氮气，曝气以去除氧气，得到无机培养基，同时取窖泥进行培养，得到窖泥种子富集液；

步骤三：将五粮混合粉碎后，加水熬煮、糖化、沉淀、过滤得到天然培养基；其中，五粮质量配比为高粱：大米：糯米：小麦：玉米＝18：11：9：8：4；采用液化酶、糖化酶分别进行液化和糖化，温度为60-62℃，酶活性均大于3700活力单位/克；液化酶、糖化酶的添加量均为1-2g/L，所述天然培养基为五粮粉糖化液，糖化液终浓度为12-13°BX，pH为6.8；

步骤四：将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵，发酵温度为25-37℃，培养15-30天，即得富集梭菌属微生物的发酵液。

优选的是，所述窖泥为上层、下层或底层窖泥中至少一种。

在进一步中优选的是，向步骤二所得的无机培养基中添加硝酸盐，然后从进料口引至新型序批式生物反应器中；向液相中通入甲烷气，曝气；在序批式生物反应器中接种甲烷氧化耦合反硝化微生物；加入MBBR流化床生物填料供微生物附着。

在进一步中优选的是，所述步骤二的反应周期包括进水-反应-沉淀-排水，实现反硝化厌氧甲烷氧化微生物的成功富集。

在进一步中优选的是，所述步骤二中酸性微量元素溶液是指：每升溶液含1.14gFeSO

在进一步中优选的是，所述甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料是将工程化的甘露糖凝集素通过生物素和链霉亲和素的作用链接到四氧化三铁颗粒上。

在进一步中优选的是，所述甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料中四氧化三铁颗粒是经粒径为300nm链霉亲和素修饰。

在进一步中优选的是，免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料是将免疫球蛋白G以酸碱缩合的方式链接到四氧化三铁颗粒上而成的。

在进一步中优选的是，所述混合物还包括其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料。

在进一步中优选的是，所述碱性微量元素溶液是指：每升溶液含104mgNa

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种食品中微生物的富集方法，具备以下有益效果：

本发明通过上述步骤最终成功富集的反硝化厌氧甲烷氧化微生物在上述脱氮应用中具有高效的生物还原硝酸盐的效率，在72h的反应时间内可以将65mg N/L的硝酸盐完全生物还原，此外，甘露糖凝集素(MBL)是一种钙依赖性凝集素，能识别不同细菌、真菌和病毒表面的甘露糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖。而工程化的MBL(Fc-MBL)是通过基因工程去除天然MBL的促进凝血的结构域，剩余的糖结合结构域与免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段融合获得，其蛋白结构更加稳定，因此Fc-MBL包裹的磁性纳米材料已经成为一种广谱性的微生物捕获材料，可用于大部分常见细菌的捕获；IgG包裹的磁性纳米材料主要用于细胞表面产生蛋白质A、G、L的微生物的捕获。伴刀豆球蛋白A是从刀豆中提取的球蛋白，其对富含甘露糖的糖类有高亲和力，因此也可作为一种广谱性的细菌识别蛋白，万古霉素也是一种广谱糖肽类抗生素，由于可以结合大多数革兰氏阳性菌细胞壁中的D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-ala-D-ala)基团，因而成为一种针对革兰氏阳性菌的广谱性富集材料，此外，采用本发明的天然培养基定向富集后，梭菌属(Clostridium)的相对丰度提高了3-16倍，且梭菌属的相对丰度比在巴氏培养基中提高了38.14％。

附图说明

图1为本发明中一种食品中微生物的富集方法整体流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

请参阅图1，一种食品中微生物的富集方法，包括以下步骤：

步骤一：食品混合物包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节；甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料是将工程化的甘露糖凝集素通过生物素和链霉亲和素的作用链接到四氧化三铁颗粒上；

步骤二：制备无机培养基：将酸性微量元素溶液、碱性微量元素溶液、CaCl2、KHCO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4加入至去离子水中，用HCl调节pH，配成培养基，向配置好的培养基中通入氮气，曝气以去除氧气，得到无机培养基，同时取窖泥进行培养，得到窖泥种子富集液；

步骤三：将五粮混合粉碎后，加水熬煮、糖化、沉淀、过滤得到天然培养基；其中，五粮质量配比为高粱：大米：糯米：小麦：玉米＝18：11：9：8：4；采用液化酶、糖化酶分别进行液化和糖化，温度为60-62℃，酶活性均大于3700活力单位/克；液化酶、糖化酶的添加量均为1-2g/L，所述天然培养基为五粮粉糖化液，糖化液终浓度为12-13°BX，pH为6.8；

步骤四：将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵，发酵温度为25-37℃，培养15-30天，即得富集梭菌属微生物的发酵液。

在本实施例中，所述窖泥为上层、下层或底层窖泥中至少一种。

在本实施例中，向步骤二所得的无机培养基中添加硝酸盐，然后从进料口引至新型序批式生物反应器中；向液相中通入甲烷气，曝气；在序批式生物反应器中接种甲烷氧化耦合反硝化微生物；加入MBBR流化床生物填料供微生物附着。

在本实施例中，所述步骤二的反应周期包括进水-反应-沉淀-排水，实现反硝化厌氧甲烷氧化微生物的成功富集。

实施例2：

一种食品中微生物的富集方法，包括以下步骤：

步骤一：食品混合物包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节；

步骤二：制备无机培养基：将酸性微量元素溶液、碱性微量元素溶液、CaCl2、KHCO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4加入至去离子水中，用HCl调节pH，配成培养基，向配置好的培养基中通入氮气，曝气以去除氧气，得到无机培养基，同时取窖泥进行培养，得到窖泥种子富集液；酸性微量元素溶液是指：每升溶液含1.14gFeSO

步骤三：将五粮混合粉碎后，加水熬煮、糖化、沉淀、过滤得到天然培养基；其中，五粮质量配比为高粱：大米：糯米：小麦：玉米＝18：11：9：8：4；采用液化酶、糖化酶分别进行液化和糖化，温度为60-62℃，酶活性均大于3700活力单位/克；液化酶、糖化酶的添加量均为1-2g/L，所述天然培养基为五粮粉糖化液，糖化液终浓度为12-13°BX，pH为6.8；

步骤四：将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵，发酵温度为25-37℃，培养15-30天，即得富集梭菌属微生物的发酵液。

实施例3：

一种食品中微生物的富集方法，包括以下步骤：

步骤一：食品混合物包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节；

步骤二：制备无机培养基：将酸性微量元素溶液、碱性微量元素溶液、CaCl2、KHCO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4加入至去离子水中，用HCl调节pH，配成培养基，向配置好的培养基中通入氮气，曝气以去除氧气，得到无机培养基，同时取窖泥进行培养，得到窖泥种子富集液；

步骤三：将五粮混合粉碎后，加水熬煮、糖化、沉淀、过滤得到天然培养基；其中，五粮质量配比为高粱：大米：糯米：小麦：玉米＝18：11：9：8：4；采用液化酶、糖化酶分别进行液化和糖化，温度为60-62℃，酶活性均大于3700活力单位/克；液化酶、糖化酶的添加量均为1-2g/L，所述天然培养基为五粮粉糖化液，糖化液终浓度为12-13°BX，pH为6.8；

步骤四：将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵，发酵温度为25-37℃，培养15-30天，即得富集梭菌属微生物的发酵液。

在本实施例中，所述甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料中四氧化三铁颗粒是经粒径为300nm链霉亲和素修饰。

在本实施例中，免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料是将免疫球蛋白G以酸碱缩合的方式链接到四氧化三铁颗粒上而成的。

在本实施例中，所述混合物还包括其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料。

在本实施例中，所述碱性微量元素溶液是指：每升溶液含104mgNa

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。