一种重组乳酸乳球菌免疫增强剂及其制备和饲喂方法

技术领域

本发明涉及免疫增强剂领域，尤其涉及一种重组乳酸乳球菌免疫增强剂及其制备和饲喂方法。

背景技术

我国是水产养殖大国，但近年来，我国水产养殖业病害防控形势十分严峻，年均测算经济损失高达几百亿元。其中，水产病毒性疾病发病快、死亡率高、传染性强，一旦发病很难治愈，是危害水产动物最普遍和严重的病害。由于缺乏有效的防治药物，生产中渔药的滥用情况普遍存在，不仅防治效果差，还会引起耐药性等问题，对水产品质量带来安全隐患，而且严重污染水体及生态环境。鲤春病毒血症病毒(SVCV)可引起多种鲤科鱼类，如鲤、锦鲤、鲢、鳙和草鱼等发生急性、暴发性出血症—鲤春病毒血症。该病常在春季水温较低时暴发，死亡率高达90％以上，被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的二类鱼类疫病，该病严重影响了渔业生产并造成了巨大经济损失。

免疫增强剂又称免疫调节剂，是一类通过促进或诱导机体防御反应，提高机体自身非特异性免疫能力，增强机体对抗微生物或病原体特异反应的物质。其主要包括多糖类、中草药制剂、多肽、激素类、微生物组分等。免疫增强剂具有保护、促进、调节动物免疫系统的功能，也是鱼类疾病防控的重要方式之一。免疫增强剂可以激活鱼体中性粒细胞和白细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞的产生及淋巴因子的分泌，协调细胞免疫和体液免疫，诱发抗体及补体生成等，对鱼类的非特异性免疫和特异性免疫均有促进效果。多肽类的鱼类免疫增强剂可避免化学药物和抗生素滥用引起的耐药性及在鱼体、水体的残留，能够改善水产品质量、减少环境污染，具有良好的发展前景。

乳酸菌是一类能够利用环境中的碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌，可以分为乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)等20多个属。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是乳球菌属中最重要的一个菌种，是水产动物肠道内的正常菌群，被公认为安全的食品级微生物，具有生产成本低、制备简单、安全性高、可直接口服等优点，可用于活载体疫苗、微生态制剂和免疫增强剂的制备。乳酸乳球菌NZ9000衍生自食品级乳酸菌Lactococcus lactis MG1363，其安全性及有效性在食品和医药领域已得到深入研究论证。NICE(nisin controlled expression)食品级表达系统可在NZ9000中高效表达外源蛋白，表达蛋白可达细胞总蛋白的10％～60％，已被应用于十几种外源基因的表达。此外，NZ9000不产生内毒素和细胞外蛋白酶、并且菌体自身分泌蛋白少，减少了对外源蛋白的干扰，在免疫增强剂开发领域具备广阔的应用前景，然而，鱼类中尚无相关应用报道。

本实验室前期研究发现鲤Rhbdd3蛋白在鱼体内外过表达并不影响细胞的正常活性，但能促进天然免疫相关分子的表达，显著提高宿主的抗病能力，有效抑制多种病毒的增殖，然而目前生产实践中尚缺少Rhbdd3的相关应用。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用现代生物技术开发绿色免疫防治技术，提高水产动物自身的免疫机能，预防病毒性疾病的发生，实现水产绿色健康养殖。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高水产动物自身的免疫机能，预防病毒性疾病的发生，实现水产绿色健康养殖的免疫增强剂及其制备和饲喂方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种重组乳酸乳球菌免疫增强剂，包含表达鲤Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳球菌，所述鲤Rhbdd3蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的较佳实施方式中，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactispNZ8148-Rhbdd3，保藏编号为CCTCC NO：M20231309。

本发明还提供上述重组乳酸乳球菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：扩增鲤Rhbdd3基因；

步骤2：构建包含步骤1中鲤Rhbdd3基因的重组质粒；

步骤3：使用步骤2中所述的重组质粒构建表达Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳球菌。

在本发明的较佳实施方式中，在所述步骤1中扩增使用的引物包含限制性内切酶酶切位点NcoI和Hind III。

在本发明的另一较佳实施方式中，在所述步骤1中使用的引物序列为：

SEQ ID NO.2pNZ8148-Rhbdd3-F：

GAGGCACTCACCATGGATGCTCGATCATCTTTTTTCAGCAT；

SEQ ID NO.3pNZ8148-Rhbdd3-R：

GGTTCAAAGAAAGCTTCTATGACGCTGATGGCTTCTTCC。

在本发明的另一较佳实施方式中，在所述步骤2中使用pNZ8148载体构建重组质粒，所述pNZ8148载体的序列如SEQ ID NO.4所示，构建的重组质粒为pNZ8148-Rhbdd3，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的另一较佳实施方式中，在所述步骤3中，使用乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞构建重组乳酸乳球菌，制备完成的重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis pNZ8148-Rhbdd3。

本发明还提供上述免疫增强剂的饲喂方法，其特征在于，将表达鲤Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳球菌加入饵料中。

在本发明的较佳实施方式中，将表达鲤Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳球菌喷洒至基础饵料表面，并添加海藻酸钠进行包裹，混合均匀后烘箱烘干。

在本发明的另一较佳实施方式中，将表达鲤Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳以5.0×10

技术效果

1、本发明筛选并构建了表达Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactispNZ8148-Rhbdd3，饵料拌喂鲤鱼后可以显著提高鱼体免疫因子的表达水平，提高鱼体自身免疫力，有效抑制鲤鱼对鲤春病毒血症病毒的感染，可以广泛应用于鱼类相关疾病的预防。研究结果为鲤春病毒血症的绿色防控提供了一种有效的措施，促进了水产绿色养殖。

2、本发明中使用的乳酸乳球菌NZ9000衍生自食品级乳酸菌，其基因组学、安全性、功能特性及在食品和医药领域的应用已得到了深入研究论证。所用乳酸菌为食品级、安全性好、也对环境友好。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的鲤Rhbdd3基因编码片段和重组质粒pNZ8148-Rhbdd3的琼脂糖电泳凝胶结果图；

图2是本发明一个较佳实施例的重组乳酸乳球菌的结晶紫染色显微镜照片；

图3是本发明一个较佳实施例的重组乳酸乳球菌的诱导表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳结果图；

图4是本发明一个较佳实施例的重组乳酸乳球菌诱导表达产物的免疫印迹结果图；

图5是本发明一个较佳实施例的不同诱导条件下重组乳酸乳球菌诱导表达产物的免疫印迹结果图；

图6是本发明一个较佳实施例的重组乳酸乳球菌饵料拌喂后鲤鱼不同天然免疫基因表达水平结果示意图；

图7是本发明一个较佳实施例的施用了重组乳酸乳球菌免疫增强剂的鲤鱼中鲤春病毒血症病毒N基因的相对表达水平结果示意图；

图8是本发明的一个较佳实施例的重组质粒pNZ8148-Rhbdd3图谱。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例一：鲤Rhbdd3基因的扩增

首先利用Primer Express 5.0和BioEdit 7.0软件，根据GenBank中Rhbdd3基因序列(SEQ ID NO.1，GenBank号：OK338017)设计引物pNZ8148-Rhbdd3-F和pNZ8148-Rhbdd3-R，并引入限制性内切酶酶切位点NcoI和Hind III(以斜体下划线标注)，引物序列如下：

SEQ ID NO.2pNZ8148-Rhbdd3-F：

SEQ ID NO.3pNZ8148-Rhbdd3-R：

采用组织总RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取鲤鱼组织总RNA，利用反转录试剂盒(购自TaKaRa)合成cDNA，以其作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：ddH2O 30.5μL、10×LABuffer II(Mg2+plus)5μL、dNTP Mixture(2.5mmol/L)8μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、聚合酶LATaq Polymerase(5U/μL)0.5μL、DNA模板2μL，总体积为50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增结果如图1所示。

实施例二：重组质粒pNZ8148-Rhbdd3的构建

用DNA胶回收试剂盒对(1)中所述PCR产物进行切胶纯化回收，然后将pNZ8148载体(SEQ ID NO.4，购于REBIO公司)用NcoI和Hind III限制性内切酶37℃酶切3h，酶切产物纯化回收，利用TaKaRa公司的In-Fusion试剂盒，将纯化的PCR扩增产物和回收载体进行无缝克隆，热击法转化MC1061大肠杆菌感受态细胞(购于REBIO公司)，菌液PCR筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向序列测定，测序正确的重组质粒命名为pNZ8148-Rhbdd3(SEQ ID NO.5，图谱如图8所示)，质粒电泳结果如图1所示。

实施例三：表达Rhbdd3蛋白的重组乳酸乳球菌的构建

首先，制备乳酸乳球菌NZ9000(购于REBIO公司)感受态细胞。将活化的乳酸乳球菌NZ9000单菌落接种于5mL G/L-SGM17B(含0.5％葡萄糖、0.5M蔗糖、2.5％甘氨酸的M17液体培养基)培养基中，30℃恒温过夜培养。第二天，取5ml培养液至50ml G/L-SGM17B培养基中，30℃恒温过夜培养。第三天，取50mL培养液至400mL G/L-SGM17B培养基中，30℃静置培养至OD600＝0.3。4℃,6000g离心20min，弃上清，加入400mL预冷的0.5mol/L蔗糖+10％甘油洗细胞，6000g离心20min，然后用200mL预冷的0.5M蔗糖+10％甘油+50mM EDTA悬浮细胞，冰上静置15min，6000g离心20min。用200mL预冷的0.5M蔗糖+10％甘油洗细胞，6000g离心20min。用4mL预冷的0.5M蔗糖+10％甘油重悬细胞，在冰上每管40μL分装于无菌EP管中，直接用于电转化或者冻存于-80℃备用。

取1μL pNZ8148-Rhbdd3质粒和对照质粒pNZ8148分别加入40μL乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，转入预冷的2mm电击杯(购于Bio-Rad公司)中，电击参数为2500V,4.5～5ms。电击后加入1mL预冷的M17+0.5％葡萄糖+20mM MgCl2+2mM CaCl2，冰上放置5min后30℃培养1.5h，涂布于含0.5％葡萄糖和10μg/mL氯霉素的M17琼脂平板，30℃倒置培养1-2天。挑选阳性克隆，经测序验证正确后获得重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis pNZ8148-Rhbdd3和空载对照乳酸乳球菌Lactococcus lactis pNZ8148，其中重组乳酸乳球菌Lactococcuslactis pNZ8148-Rhbdd3经中国典型培养物保藏中心受理分类确定，保藏编号为CCTCC NO：M20231309。

实施例四：重组乳酸乳球菌的结晶紫染色

在载玻片中央滴一滴无菌水，用接种环取少许培养好的重组乳酸乳球菌，在载玻片的水滴中涂匀；将涂好的玻片在火焰上通过3～4次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上；用结晶紫染色30-60s，然后用洗瓶轻轻冲洗直至无多余的染液，晾干或用吸水纸从旁吸干，置于显微镜下观察，拍照(结果如图2所示)。

实例五：重组乳酸乳球菌的诱导表达

将乳酸乳球菌Lactococcus lactis pNZ8148-Rhbdd3和空载对照Lactococcuslactis pNZ8148接种至5mL含10μg/mL氯霉素的M17液体培养基中，30℃过夜静置培养，第2天以1:50比例扩大培养，待OD600值为0.4～0.6时，收取10mL菌液设为0h样品，剩余样品加入1ng/mL乳酸链球菌素nisin进行诱导表达，分别于诱导后1、3、5、6h收取等体积菌液，所有样品8000g离心10min，弃上清，菌体用100μL PBS重悬，加入20mg/mL溶菌酶充分裂解，取20μL裂解上清和5μL的5×蛋白上样缓冲液混匀，95℃煮5min，进行SDS-PAGE凝胶电泳(结果如图3所示)。

实施例六：重组乳酸乳球菌诱导表达产物的免疫印迹分析

裁剪与分离胶大小完全吻合的滤纸和PVDF膜，在转移缓冲液中平衡15min，凝胶电泳结束后，拆卸凝胶夹层，分离胶于适量转移缓冲液中平衡10min，组装转印夹层，在恒压下转移蛋白20V，40min。转膜完毕，将膜取出，放入杂交盒，加10mL 5％PBST-牛血清白蛋白封闭液，37℃孵育2h；倒掉封闭液，加入本实验室制备的兔抗Rhbdd3蛋白抗体(以体积比1:1000稀释)，37℃孵育2h；PBST洗3次，每次10min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(二抗，购于上海翊圣生物科技有限公司，以体积比1:5000稀释)，37℃孵育1h；倒掉二抗，PBST洗3次，每次10min，加入ECL发色底物(购自天根生化科技(北京)有限公司)，条带在5-10min内显色。

免疫印迹结果如图4所示，在预期位置出现了明显的条带，表明本发明的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis pNZ8148-Rhbdd3可以大量表达Rhbdd3蛋白。

此外，我们还设置了1、10、100和1000ng/mL不同浓度乳酸链球菌素nisin进行Rhbdd3蛋白的诱导表达，结果表明100ng/mL的乳酸链球菌素nisin诱导下，Rhbdd3蛋白表达水平最高(结果如图5所示)。

实施例七：重组乳酸乳球菌饵料拌喂对鲤鱼天然免疫基因表达水平的影响

将重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis pNZ8148-Rhbdd3以5.0×10

以cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组鲤鱼组织中免疫因子IFN-1、Mx1、IRF7、ISG15及Viperin的表达水平(结果如图6所示)，β-actin作为内参基因。将第0d样品设为1，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达水平，引物序列见表1。qRT-PCR反应体系如下：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq，10μmol/L正向引物、反向引物各0.4μL，待测样品cDNA2μL，补充双蒸水至20μL。置于7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为95℃30s；之后95℃5s、55℃30s 40个循环。

实施例八：重组乳酸乳球菌免疫增强剂在鲤鱼抗SVCV感染中的应用

实验鲤鱼饲喂14d后腹腔注射鲤春病毒血症病毒(100μL/尾)进行鱼体感染实验，分别在感染的第1、3、7d进行取肝、脾、肾组织，匀浆后根据(6)的方法进行病毒RNA的提取和反转录。利用qRT-PCR检测鱼体组织中鲤春病毒血症病毒N基因拷贝数。将第1d样品设为1，采用2-ΔΔCt法分析鲤春病毒血症病毒N基因的相对表达水平(结果如图7所示)，引物序列见表1。

表1引物序列

本实发明通过基因克隆技术将鲤Rhbdd3基因编码区克隆至表达载体pNZ8148上，通过一系列的试验验证，表明本发明的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis pNZ8148-Rhbdd3免疫增强剂饵料拌喂鲤鱼后可以提高鱼体免疫因子的表达水平，并可有效抑制鲤春病毒血症病毒的感染。本发明的重组乳酸乳球菌免疫增强剂为鲤鱼病毒病的防控提供了一种有效措施，可应用于鱼类相关疾病的预防，降低鲤鱼养殖过程中因病毒性疾病导致的经济损失，同时减少药物使用，提升水产品质量，具有广阔的应用推广前景。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。