一种分散泛菌ZHJ28、生物炭基菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体为一种分散泛菌ZHJ28、生物炭基菌剂及其制备方法。

背景技术

微塑料，是一种直径小于5mm的塑料颗粒，其来源一方面为近年来由于塑料制品的大量废弃，环境中塑料类废弃物的数量逐年增加。。另一方面，随着汽车人均保有量的持续增长，轮胎在道路上磨损产生的轮胎磨损颗粒也在各种环境介质中被广泛发现，轮胎在不同的行驶条件下磨损情况不同，生成不同尺寸范围的颗粒状橡胶(rubber crumb，简称RC)。RC进入水体后，可能会通过与水体中不同植物之间的相互作用，影响水生环境中植物的光合作用、生命代谢，导致对植物体的生长产生毒性效应。RC在土壤中导致硫酸盐和氯化物的水平都大大提高，增加了土壤盐度。RC对草坪草生长的不利影响可能归因于RC释放出的一些有毒物质。RC污染的土壤严重影响了植物，特别是对于豆科作物的生长。论文《微塑料对三种北方农作物生长与生理生态特征的影响》中提到，微塑料添加显著降低花生的株高，作物生长后期特别是成熟期，聚丙烯微塑料的添加显著抑制花生总生物量的积累。因此寻找一种有效的材料实现对微塑料的高效去除是一项重要的任务。

农业废弃物资源可经过高温高压煅烧制成生物炭，生物炭具有较大的孔隙度和比表面积，可以为微生物提供生存空间，生物炭也具有蓄水保肥的能力，可以为微生物的生长提供养料，将根际益生菌与生物炭复合施入土壤中，有利于提高根际益生菌存活期从而发挥稳定的益生效果。研究表明，生物炭能有效钝化土壤中的有机污染物和重金属，并阻控土壤污染物在作物体内积累，从而降低其植物毒性。生物炭对于土壤中的颗粒态污染物同样具有较强的固定钝化作用，研究表明，向土壤中施加生物炭能降低植物对工程纳米颗粒的吸收。此外，生物炭在土壤改良和作物增产方面也表现出巨大的应用潜力。专利“菌肥制剂、制备方法及其应用”(申请号：CN202010589384.0)提供了包括生物炭以及吸附于生物炭的促生微生物的菌肥制剂，使得水稻稻谷亩产量提高10％～25％。

生物炭是否能应用于花生土壤改良，以及是否能起到花生促生效果，尚未有公开的研究。

发明内容

为了解决种植花生的含微塑料土壤的改良问题，本发明提供了一种分散泛菌ZHJ28、生物炭基菌剂及其制备方法，采用植物根际益生菌和生物炭复合，用于微塑料污染土壤的修复，该技术安全无污染，且经济有效。本发明包括如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，在于提供了一种分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28，该菌株已于2023年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，其保藏号为：CGMCCNo.28511。

所述分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28分离自连作十年花生根际土壤。

具有如下特征：

菌落呈淡黄色，圆形，不透明，表面光滑，湿润，微凸，边缘整齐。

作为本发明的第二个方面，在于提供了生物炭基菌剂，包括作为微生物菌剂的所述花生根际促生菌ZHJ28，还包括生物炭，所述的生物炭为400-450℃高温下制成的玉米秸秆炭。

进一步地，所述的生物炭与微生物菌剂的配比为0.5g-1g:2.5ml。

作为一个优选方案，所述微生物菌剂中菌体浓度1×10

进一步的，所述生物炭直径范围为2.05～2.20mm。

作为一个优选方案，所述的生物炭为直径2mm的玉米秸秆生物炭。

植物根际微生物(PGPR)在植物修复重金属污染土壤时分泌的激素、铁载体、ACC脱氨酶、黄酮类化合物和酚酸类等有机物具有增强植物生长的作用，同时促进适应相应根际环境的功能微生物群落的建立。同时微生物能够降解微塑料从而修复微塑料污染是一种较为安全、低成本、高效益的修复方法之一，具有较为广阔的研究与应用前景。目前已分离出多种可降解不同类型微塑料的微生物，包括细菌、真菌和藻类等，其中占主要地位的是细菌和真菌。具有降解能力的细菌和真菌为异养微生物，可以附着微塑料表面将微塑料作为碳源利用。

作为本发明的第三个方面，在于提供了所述生物炭基菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)微生物菌剂的制备：将花生根际促生分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28在LB固体培养基中活化，然后挑取单菌落与LB试管中活化，将种子液接种到LB液体培养基中离心培养，得到促生菌的菌液。用无菌PBS缓冲溶液洗涤，制备成OD

其中LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水溶解定容至1L；高压蒸汽灭菌121℃，20min。用于固体培养基时，加1.5％琼脂。

(3)生物炭基的制备：将玉米秸秆在400-450℃下高温煅烧，此过程中通入惰性气体保护。制成生物炭后过筛，备用。

(4)将生物炭与所述的微生物菌剂按照(0.5-1)g:2.5ml的比例混合，在恒温摇床中发酵，使细菌充分的吸附在生物炭上。

作为本发明的第四个方面，在于提供所述生物炭基菌剂的应用，用于微塑料污染的土壤修复技术，采用生物炭负载微生物菌剂，能够有效的应用于修复微塑料污染的土壤，同时促进作物生长。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

1，本发明提供的分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28，单用可增加花生植株的主茎高、侧枝长、主茎直径，对作物的生长有促进作用。

2，本发明提供的生物炭菌剂，在没有微塑料污染的土壤中施用，分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28与生物炭协同作用，进一步促进作物的生长；在有RC污染的土壤中施用，对作物生长仍有提升作用；本发明首次阐明了生物炭与根际促生菌分散泛菌联合作用对缓解土壤微塑料污染对花生生长的影响，从而提高花生产量。

3，本发明提出的缓解土壤微塑料污染对花生毒害的生物炭基菌剂，具有提高花生光合作用的优势，生物炭作为载体可以有效的抵御外界环境的毒害，在实际农业生产中的应用方面具有重大的意义。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为生物炭与微生物菌剂不同比例对花生生长的影响，从左向右依次为CK、0.5:2.5、1:2.5。

图2为生物炭、微生物菌剂、生物炭+微生物菌剂处理下花生生长情况，从左向右依次为CK、2％C、PGPR、2％C+PGPR。

图3为生物炭基菌剂添加后不同处理花生生长情况，从左向右依次为CK、0.5％RC、0.5％RC+2％C+PGPR。

图4为生物炭、微生物菌剂、生物炭+微生物菌剂处理下对花生的净光合速率影响。

图5为生物炭基菌剂处理后与未施加相比花生的净光合速率。

图6为ZHJ28菌株划线图。

图7为ZHJ28菌株系统发育树。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

实施例1，微生物菌剂的定性筛选

(1)培养基的准备

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水溶解定容至1L；高压蒸汽灭菌121℃，20min。用于固体培养基时，加1.5％琼脂。

无机磷(PKO)培养基：葡萄糖10g，(NH

有机磷卵黄培养基：葡萄糖10g，(NH

CAS培养基：将0.06g CAS溶于50ml双蒸水中，并与10ml铁(Ⅲ)溶液(1mM FeCl

(2)菌株的筛选

从中国山东省农业科学院饮马泉试验田中选取连作十年花生植株，采用系列稀释分离法处理采集的花生根际土壤样品，具体操作如下：称花生根际土10g，加入到盛90ml无菌水的三角瓶中，震荡10min，制成1:10浓度的土壤悬浮液。土粒沉淀后，按浓度梯度稀释的方法稀释到10

挑取生长在LB培养基上的单菌落在LB液体培养基中培养。将培养的菌株分别在功能培养基上培养。

涂布：将稀释好的菌液分别涂布于上述平板上，每种培养基有三个重复。

恒温培养：Ashby无氮培养基(7d)、无机磷(PKO)培养基(3d)、有机磷卵黄培养基(3d)、缺钾液体培养基(7d)、CAS培养基(7d)、LB培养基(7d)。

观察：观察不同平板上菌落形态，如图6所示；挑取单菌落进行分离培养。

解有机P、解无机P的平板里分别挑选出优势菌株；解K菌的平板里挑选出优势菌株，共30株菌进行固N、解P、K、分泌Fe载体、产IAA、的检验。

(3)菌株的鉴定

将筛选得到的目标功能菌株进行PCR扩增，16S rDNA的引物选用27F、1492R扩增细菌16S rDNA序列产物在1500bp左右。将所得序列上传至Ezbiocloud数据库与已知序列进行比对，选取相关序列利用MEGAX采用邻接法(Neighbor-Joining)绘制系统发育树如图7所示，自展值为1000次。

菌株鉴定后，将该菌株于2023年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，其保藏号为：CGMCCNo.28511。

实施例2，微生物菌剂的制备

微生物菌剂的制备：将筛选出的具有固氮、解磷、产铁载体、产IAA的花生根际促生分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28在LB固体培养基中活化，然后挑取单菌落与LB试管中活化12h，将种子液按照1％的量接种到200ml LB液体培养基中37℃、180r培养12h，得到促生菌的菌液。用pH＝7的无菌PBS缓冲溶液将其洗涤3次，制备成OD

实施例3，生物炭的制备

将玉米秸秆在400-450℃下高温煅烧2h，此过程中通入惰性气N

作为可实施的方式，所述生物炭直径范围为2.05～2.20mm。

实施例4，生物炭基菌剂的制备

制备方案一

将生物炭与所述的微生物菌剂按照0.5g:2.5ml的比例混合，在37℃，180r·min

制备方案二

将生物炭与所述的微生物菌剂按照1g:2.5ml的比例混合，在37℃，180r·min

参照图5为，生物炭与微生物菌剂按照不同比例混合后对花生培养的情况。结果表明生物炭与微生物菌剂比例为1g:2.5ml时对花生的生长最有利。

实施例5，生物炭基菌剂的施用缓解土壤微塑料污染对花生的毒害

过夜活化实施例1中的保存菌株，将花生根际促生分散泛菌(Pantoea dispersa)ZHJ28活化后接种到装有200ml LB的液体培养的锥形瓶中，置于37℃、180r·min

为比较生物炭基菌对花生的促生效果，分别将生物炭、微生物菌剂、0.5％微塑料、生物炭基菌施入土壤中，观察花生植株生长状况。设计如表1所示：

表1试验处理

根据试验设置分别将生物炭、微生物菌剂以及0.5％的微塑料施入土壤中，并种植花生。通过观察花生各项生理指标变化情况来表示生物炭基菌剂对缓解土壤微塑料污染促进花生生长的作用。

结果：

1.生物炭与微生物菌剂不同比例对花生生长的影响，如图1。

2.不同处理下花生的农艺性状，如表2。

3.生物炭、微生物菌剂、生物炭+微生物菌剂处理下对花生的促生效果，如图2所示。

4.生物炭基菌剂对微塑料污染的土壤中的花生生长均有促进作用，通过图3观察不同组处理中花生生长图片。

5.生物炭、微生物菌剂、生物炭+微生物菌剂处理下对花生的净光合速率均有所提高，如图4所示。

6.生物炭基菌剂处理后与未施加相比花生的净光合速率均有所提高，如图5所示。

7.ZHJ28菌株划线图如图6所示。具有如下特征：菌落呈淡黄色，圆形，不透明，表面光滑，湿润，微凸，边缘整齐。

8.ZHJ28菌株系统发育树如图7所示。

表2不同处理的花生农艺性状

由上述表2和图2结果可知，采用本发明提供的分散泛菌ZHJ28，在没有微塑料污染的土壤中施用生物炭基菌，花生植株的主茎高、侧枝长、主茎直径与CK相比分别增加了3.85％、4.76％、7.25％，对作物的生长有促进作用；采用本发明提出的生物炭基菌剂缓解微塑料对花生的毒害作用有显著的效果。在没有微塑料污染的土壤中施用生物炭基菌，花生植株的主茎高、侧枝长、主茎直径与CK相比分别增加了7.69％、28.57％、12.5％，在有0.5％RC污染的土壤中施用生物炭基菌，花生植株的主茎高、侧枝长、主茎直径与只施加0.5％RC相比分别增加了7.69％、53.33％、5.56％。

由图3、图4可知，本发明提出的生物炭基菌剂缓解微塑料对花生的毒害作用有显著的效果，生物炭基菌剂对微塑料污染的土壤中的花生生长均有促进作用。生物炭基菌处理的花生净光合速率与CK处理、单独施用生物炭处理、单独施用微生物菌剂的处理相比分别提高了17.73％、1.38％、10.47％。在5％RC污染的土壤中施用生物炭基菌剂花生净光合速率与未施加生物炭基菌剂相比提高了19.81％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。