一种能高效兼具特异性转化蔗糖的蔗糖异构酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及一种能高效兼具特异性转化蔗糖的蔗糖异构酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

异麦芽酮糖(isomaltulose)又作帕拉金糖，分子式为C

美国FDA批准异麦芽酮糖作为安全型食品添加剂，无摄入量限制。其所具有的理化性质和生理功能也使得异麦芽酮糖能够替代蔗糖广泛的应用于功能饮料，减肥保健品，糖尿病人食品中等。目前，全球已有40多个国家和地区已开始使用异麦芽酮糖来替代蔗糖作为食品添加剂，其中欧美与日本使用最多，2009年消耗量就已经达到100000t。而就我国而言，异麦芽酮糖需求量大，而国内异麦芽酮糖的工业化生产起步晚产能低，因而所需产品主要依赖德国和日本的进口，其中该糖的市场售价为1.5万元/t。

异麦芽酮糖在自然界极少，只少量的存在于蜂蜜和甘蔗汁中，因而直接的提取方法不可用。目前，经文献报道的异麦芽酮糖合成方法主要有：化学合成法、植物体内转化法、微生物细胞转化法、蔗糖异构酶转化法。化学合成法成本高且污染大，植物体内转化法会导致植物生产停滞，微生物细胞转化法产量高，但存在发酵液成分复杂，后期分离纯化略困难。故目前生产异麦芽酮糖的最佳方式为蔗糖异构酶转化法。

蔗糖异构酶，又称α-葡糖基转移酶，能够将蔗糖转化成异麦芽酮糖和海藻酮糖，并生成少量单糖的一种酶。蔗糖异构酶的催化机理：亲核攻击作用蔗糖使α1-β1糖苷键断裂及果糖基的取向；异构化或水解的发生。

用蔗糖异构酶来实现异麦芽酮糖的高产率，高纯度，低成本的生产始终是蔗糖异构酶研究的方向。在用蔗糖异构酶生产异麦芽酮糖的过程中，酶的利用率低和不可避免生成的副产物是两个重要的不利因素，且因为这两个因素使得异麦芽酮糖的生产成本维持在较高水平，而高成本也限制了异麦芽酮糖替代蔗糖的步伐。与单糖副产物的产生相比，在使用蔗糖异构酶的过程中，产生蔗糖的另一种同分异构体——海藻酮糖，由于其和异麦芽酮糖结构的相似性，使得下游分离纯化的难度提高，一般工业上分离海藻酮糖与异麦芽酮糖使用重结晶的方法。更高的异麦芽酮糖转化率意味着在生产过程中，可以使异麦芽酮糖的产率更高，或生产纯度更高的异麦芽酮糖产品。与此同时，提高蔗糖异构酶的酶活，可以提高生产效率，减少生产成本。

为了获得更高效的生物催化剂，筛选新的并且可能具有高效率生成异麦芽酮糖的蔗糖异构酶是当前的关键任务。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种能高效兼具特异性转化蔗糖的蔗糖异构酶突变体能将蔗糖转化为异麦芽酮糖，其转化率大大超出野生型蔗糖异构酶。

本发明还提供该突变体转化工程菌株。

本发明另一个目的是提供该突变体在生产异麦芽酮糖中应用。

本发明采用的技术方案如下。

本发明的第一个目的是，提供一种能高效兼具特异性转化蔗糖的蔗糖异构酶突变体，该蔗糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6其中任意一种所示。

所述蔗糖异构酶突变体是通过将出发氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2.所示的蔗糖异构酶经以下任意一种定位突变方式获得：

第245位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸，得到突变体F245L，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

第245位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸，第286位氨基酸由赖氨酸突变成缬氨酸，得到突变体F245L+K286V，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的另一个目的是，提供一种编码蔗糖异构酶突变体的基因，该基因的核苷酸序列包括以下任意一种：

a)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5其中任意一种所示的碱基序列；b)编码由如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6其中任意一种所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，该基因的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示的模板核苷酸序列通过基因合成得到，所述PCR扩增对应的引物分别如表1所示。

本发明的另一个目的是，提供一种用于编码蔗糖异构酶突变体的重组表达质粒，含有上述的核苷酸序列，表达载体包括pLacO1,SacB,Amp,pBR322。

本发明的另一个目的是，提供一种高效表达蔗糖异构酶的工程菌株，所述工程菌株能代谢产生上述的蔗糖异构酶突变体，或整合有上述的蔗糖异构酶突变体的基因，或含有上述的重组表达质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株以包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌在内的宿主微生物为感受态细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

本发明的另一个目的是，提供一种蔗糖异构酶突变体粗酶液，挑选上述的工程菌株中的阳性单克隆菌株进行富集培养，经分离、过滤后得所述蔗糖异构酶突变体粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的条件为：发酵温度30℃、发酵时间48h。

本发明的另一个目的是，提供上述的高效表达蔗糖异构酶的工程菌株或上述的蔗糖异构酶突变体粗酶液的应用，具体包括作为生物催化剂，用于催化异麦芽酮糖合成。

在本发明的一种实施方式中，在所述催化异麦芽酮糖合成的反应体系中，底物浓度为300g/L，加菌量为10

在本发明的一种实施方式中，在所述催化异麦芽酮糖合成的反应体系中，发酵温度为30℃，220rpm摇床孵育。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过易错PCR，对合成的野生型蔗糖异构酶基因进行随机突变，获得编码突变体的基因库，并在大肠杆菌表达系统中进行表达及筛选，得到的蔗糖异构酶突变体活力和转化率显著提高。

(2)本发明制备的蔗糖异构酶突变体是一种更高效的生物催化剂，在异麦芽酮糖的工业生产中应用可以提高生产效率，减少生产成本，在制备异麦芽酮糖过程中，底物的转化率有效提高至80％，相较于野生株，提高了50％以上。

(3)本发明制备的蔗糖异构酶突变体作为生物催化剂，在异麦芽酮糖的工业生产中，底物浓度提高至350g/L，适用于工业化大规模生产，具有广阔的实际生产应用前景。

附图说明

图1为pTD-176B质粒结构图，

图2为蔗糖浓度筛选条件的生长测试；

图3为2.5g/L MIX(两种标准糖溶液各2.5g/l色谱图；

其中蔗糖先出峰，保留时间为10.144min；异麦芽酮糖后出峰，保留时间为10.877min；3.298min为溶剂峰；

图4为WT菌株(原始蔗糖异构酶)摇瓶发酵96小时后产物HPLC检测结果，

图5为F245菌株(蔗糖异构酶突变体)摇瓶发酵96小时后产物HPLC检测结果，

图6为F245L+K286V菌株(蔗糖异构酶突变体)摇瓶发酵96小时后产物检测结果，

图7为WT菌株(原始蔗糖异构酶)粗酶液24小时产物检测结果，

图8为F245菌株(蔗糖异构酶突变体)粗酶液24小时后产物检测结果，

图9为模拟蔗糖异构化过程，即蔗糖异构酶催化蔗糖转化为异麦芽酮糖的HPLC峰面积和浓度对应图。

图10为模拟蔗糖异构化过程中不同转化率下蔗糖与异麦芽酮糖的HPLC检测图，

图11为突变体F245L和野生型蔗糖异构酶进行酶(粗酶液)反应的异麦芽酮糖产量及转化率，

图12为野生型蔗糖异构酶和突变体F245L/F245L+K286V摇瓶发酵的异麦芽酮糖产量及转化率。

具体实施方式

本发明以SEQ ID NO.7(来源于Pantoeadispersa UQ68J)所示编码序列为模板进行密码子优化调整(优化后的序列见SEQ ID NO.1)，然后以表1所示的引物，进行基因合成，随后以其测序正确序列为模板进行易错PCR，通过合适的筛选方法获得了蔗糖异构酶突变体F245L+K286V/F245L的基因序列；将得到的基因序列和野生型蔗糖异构酶序列，分别连接到pTD176B表达载体中，得到重组质粒pTD176(WT),pTD176(F245L)，pTD176(F245L+K286V)；将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性单克隆进行发酵培养。

本发明所使用的原始基因序列SEQ ID NO.7来源于Pantoeadispersa UQ68J，该菌种在GenBank中基因组编号是AY223549.1，基因全长1797bp；共有598个氨基酸，如SEQ IDNO.2所示。

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

本发明所涉及到的所有的生物材料本申请人实验室均有保存，可以对外公开发放。

pTD176B构建是在商业化载体pUC19上AmpR promoter和pBR322之间插入sacBpromoter+sacB。采用PCR的方法从商业化载体pUC19上用一对引物(pBR322-F:aggggataacgcaggaaag和pBR322-R:ctcaagaagatcctttgatcttttctacactccgctatcgctacg)扩增获得pBR322序列作为片段1和另一对引物(Amp-F:cgtagcgatagcggagtgtgttaccaatgcttaatcagtgagg和Amp-R:cgcggaacccctatttgtt)扩增获得AmpRpromoter+AmpR序列作为片段2；随后利用引物对(PSacB+SacB)-F:gACGCGTGCTAGAGGCATAgcacatatacctgccgttcac和(PSacB+SacB)-R:ctttcctgcgttatcccctgatgctatttgttaactgttaattgtccttgttc从实验室的BS168枯草杆菌菌株基因组扩增获得sacBpromoter+sacB片段3；分别对3个片段进行胶回收，随后用NanoDrop

实施例1

一种能高效兼具特异性转化蔗糖的蔗糖异构酶突变体及应用，其制备方法的具体步骤如下：

基因合成蔗糖异构酶野生型基因：基于用引物“搭桥”PCR拼接法合成基因，采用两轮PCR，反应体系如表2，表3，表4所示,将蔗糖异构酶野生型基因构建在表达载体pTD176B(见图1)上。

具体操作为：

1)首先利用引物对pBR322-R:ctcaagaagatcctttgatcttttctgtcaattgttatccgctcacaatt和Amp-F:cgtagcgatagcggagtgtgttaccaatgcttaatcagtgagg从pTD176B上扩增获得骨架backbone；2)采用两步法基因合成的方式合成密码子优化后的SIase野生型基因作为插入片段，分别对其进行胶回收。3)利用一种只切割甲基化位点的内切酶DpnI水浴孵育时间60分钟以处理骨架backbone残留的原质粒，减少假阳性。4)随后按照标准gibson连接程序进行2个片段的连接，将连接产物转化至感受态细胞，涂布至100ug/ml的氨苄青霉素LB固体平板中，于37℃培养箱中倒置过夜培养。5)第二天利用引物对F:caagcagcagattacgcgca和R:gttatctacacgacggggag进行菌落PCR验证，选择条带大小正确的进行送测，待测序准确无误后保存目标质粒和含目标质粒的菌株。

表1拼接法中的合成引物

表2：引物“搭桥”PCR第一步体系

表3：引物“搭桥”第二步PCR体系

表4：引物“搭桥”PCR程序

(2)以(1)中基因合成的野生型蔗糖异构酶基因(已测序确认)为模板进行易错PCR，在基因全范围内构建随机突变。易错PCR反应体系如表5及表6所示；易错PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸5min，进行35个循环，最后16℃保温。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收纯化。(表5中的上引物(F:CGAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGTTCCTGAACGGTTTCAAAACC)，下引物(R:ACACTCCGCTATCGCTACGTTAGTGATGGTGGTGGTGATG))

表5：易错PCR反应体系

表6：10×dNTPs不平衡混合液

(3)纯化后的易错PCR扩增产物用Gibson组装试剂连接至载体骨架(同上所述，利用引物对pBR322-R:ctcaagaagatcctttgatcttttctgtcaattgttatccgctcacaatt和Amp-F:cgtagcgatagcggagtgtgttaccaatgcttaatcagtgagg从pTD176B上扩增获得骨架backbone；)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，实验组液体复苏后不涂平板，培养2h后加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，待OD600至1左右时，提取突变库的混合质粒。对照组1ml菌液复苏后取100ul涂抗性平板，第二天对平板菌落进行计数，并挑取单克隆送测，以估计库容量及易错率。

对照组100ul抗性平板长出菌落401个，在平板上随机挑取7个菌落送Sanger测序，得出平均突变率约为3.86‰。最后连接时，连接产物共100ul，每10ul连接产物转化至100ul感受态细胞。故突变库库容量约为401*10*10＝4.01*10

(4)将(3)中的突变库质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，液体复苏后不涂平板，培养2h后加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，待OD600至0.5左右，加入诱导剂IPTG诱导蔗糖异构酶基因的表达，诱导表达3h后以适当的稀释度分别涂布在0g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L、400g/L蔗糖浓度的抗性平板上，统计是否有菌落生长及生长的具体菌落数。结果显示pTD176质粒(野生型SIase和sacB基因共表达)在蔗糖浓度低于300g/l均可以生长，大于300g/l蔗糖时菌落不能生长。故选择350g/l蔗糖抗性琼脂平板作为蔗糖异构酶的随机突变文库的筛选条件。结果如图2所示。

(5)将(4)中的突变体送测，获得蔗糖异构酶突变位点的信息。随后将含该序列的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行发酵的种子液培养，后转接入含100μg/mL氨苄青霉素的M9液体培养基30℃扩大培养和诱导48h得到发酵液。发酵液于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体后超声波破碎，离心后上清液过水系膜，获得粗酶液。

(6)添加粗酶液到含300g/l蔗糖底物的缓冲液中，于30℃摇床孵育24h,后离心上清液经0.22μm滤膜过滤到液相瓶中，高效液相配备氨基柱安捷伦Zorbax VC-NH

如图3-图12所示，野生型WT与其蔗糖异构酶突变体F245L的反应产物的鉴定结果，证实了异麦芽酮糖的成功转化；此外，蔗糖异构酶突变体F245L+K286V也具有与蔗糖异构酶突变体F245L的反应产物相似的鉴定结果，同样证实了异麦芽酮糖的成功转化。

实施例及对比例产品最大转化率对比可以发现与蔗糖异构酶野生型相比，突变体F245L/F245L+K286V的最大转化率均提高了50％以上。蔗糖异构酶突变体不仅酶活得到提高，而且对异麦芽酮糖的生产也起到了一定的促进作用，说明蔗糖异构酶突变体具有更好的应用性能。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。