一种生产聚（4-羟基丁酸酯）和/或1,4-丁二醇的工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

聚(4-羟基丁酸酯)和1,4-丁二醇是非常重要的化工原料，聚(4-羟基丁酸酯)(P4HB)是一种聚羟基脂肪酸酯，作为一种可吸收的医用生物材料，最早是在20世纪90年代早期由麻省理工学院的研究人员利用生物发酵法合成的。这种生物聚合物拓展了生物材料的设计空间，并获得美国FDA和欧盟监管机构批准，是可用于医疗应用的一类聚羟基脂肪酸酯(PHA)。P4HB作为一种具有传统缝合材料强度但更灵活的材料，从众多用于医疗应用的PHA中脱颖而出。

1,4-丁二醇(1,4-butanediol，BDO)，又名1,4-亚丁基二醇是一种无色油状液体，可燃并且能与水混溶。1,4-丁二醇是一种重要的有机化工及精细化工原料，其下游产品包括四氢呋喃(THE)、γ-丁内醋(GBL)、聚对苯二甲酸丁二醇醋(PBT)和聚氨(PU)及涂料增塑剂等。其中THF脱水聚合生产聚四亚甲基乙二醇(PTMEG)而PTMEG是合成氨纶、聚醚弹性体及热塑性聚氨醋的基本原料。此外，1,4-丁二醇还可用于制备维生素B6、己二酸和1.3-丁二烯，用作生产医药和农药的中间体，用作溶剂涂层树脂、增湿剂、柔顺剂、链增长剂和交联剂等。因此1,4-丁二醇在医药、纺织化工、造纸、汽车和日用化工等领域用途十分广泛。

目前，聚(4-羟基丁酸酯)和1,4-丁二醇的传统化学合成法存在原料成本高、反应条件苛刻、设备要求高、产品收率低以及污染环境等问题，其应用受到一定限制。生物转化法的优势在于反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高，逐渐越来越受重视，如有报道以糖等生物质原料通过生物发酵合成聚(4-羟基丁酸酯)(P4HB)再通过化学过程合成γ-丁内醋继而合成1,4-丁二醇，但该工艺流程过长，最终产物是以高附加值的γ-丁内醋到低附加值的1,4-丁二醇，因此仅适合理论性的验证，并不具备工业化的价值。

综上所述，开发高效生产1,4-丁二醇及聚(4-羟基丁酸酯)的生物方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的工程菌及其构建方法和应用。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的工程菌，所述工程菌中缺失功能性乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶；过表达琥珀酰辅酶A合成酶、辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶；所述工程菌中还过表达PHA聚合酶和/或醇醛脱氢酶。

本发明中，在乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶敲除的基础上，通过构建表达载体，过表达大肠杆菌中的琥珀酰辅酶A合成酶，表达克氏梭菌中的辅酶依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，牙龈卟啉单胞菌中的4HB脱氢酶获得4HB生成路径质粒，进一步地，构建1,4-丁二醇(BDO)合成载体质粒，表达克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶，丙醇丁醇梭菌的醇醛脱氢酶，能够合成BDO，或者，构建聚(4-羟基丁酸酯)(P(4HB))合成载体质粒，表达克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶，富养罗尔斯通氏菌的PHA聚合酶，能够合成P(4HB)，或者构建同时表达4-羟基丁酸COA转移酶、醇醛脱氢酶和PHA聚合酶的载体质粒，实现同时合成P(4HB)和BDO。

可以理解，本领域通用的缺失功能性酶或过表达酶的手段均适用于本发明明。

优选地，所述工程菌中缺失或弱化表达乙醇脱氢酶基因、甲酸裂解酶基因、苹果酸脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因。

优选地，所述工程菌的出发菌株包括大肠杆菌(E.Coli)DH5α、大肠杆菌BL21或大肠杆菌JM109等中任意一种。

优选地，所述大肠杆菌包括DH5α。

第二方面，本发明提供第一方面所述的生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的工程菌的构建方法，所述方法包括：

在出发菌株中缺失功能性乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶；过表达琥珀酰辅酶A合成酶、辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶；还过表达PHA聚合酶和/或醇醛脱氢酶。

优选地，所述缺失功能性乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶具体包括敲除乙醇脱氢酶基因、甲酸裂解酶基因、苹果酸脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因。

优选地，所述过表达的方法包括：将目标酶的基因插入载体中，得到重组载体，将所述重组载体导入出发菌株中。

可以理解，表达琥珀酰辅酶A合成酶、辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶、PHA聚合酶和醇醛脱氢酶或相同功能酶的核酸序列均适用于本发明。

优选地，所述琥珀酰辅酶A合成酶的基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。

优选地，所述辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。

优选地，所述4-羟基丁酸脱氢酶的基因的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。

优选地，所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的基因的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。

优选地，所述醇醛脱氢酶的基因的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。

优选地，所述PHA聚合酶的基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。

SEQ ID NO.1：

atgaaggaaactgacatcgcgggaattctaacctccacccacacgattgcactcgtcggagcctccgataaacccgacagacccagctatcgagtgatgaagtatctattagatcaaggttaccacgttatacctgtctctccaaaggtggccggtaaaaccttacttggccaaaaaggatacggcacgttagccgatgtacctgaaaaagtggatatggtagatgtattccggaattcagaggccgcttggggcgtcgcccaagaagccatagcgataggggcgaaaactctttggatgcaattgggtgttattaacgagcaggccgcggtcttagcgcgtgatgccggtttaaatgtcgtaatggaccgttgtccagcgatagaaatcccccgtctgggattggcaaag。

SEQ ID NO.2：

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SEQ ID NO.3：

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SEQ ID NO.4：

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SEQ ID NO.5：

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SEQ ID NO.6：

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优选地，所述载体包括质粒载体。

优选地，所述质粒载体包括pZA33、pZE13s或PBBR1MCS2中任意一种。

第三方面，本发明提供权利要求1-3任一项所述的生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的工程菌在生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇中的应用。

第四方面，本发明提供一种生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的方法，所述方法包括：

培养第一方面所述的生产聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇的工程菌，进行产物纯化，得到聚(4-羟基丁酸酯)和/或1,4-丁二醇。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明在乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶敲除的基础上，通过构建表达载体，过表达大肠杆菌中的琥珀酰辅酶A合成酶，表达克氏梭菌中的辅酶依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，牙龈卟啉单胞菌中的4HB脱氢酶获得4HB生成路径质粒，进一步地，构建1,4-丁二醇(BDO)合成载体质粒，表达克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶，丙醇丁醇梭菌的醇醛脱氢酶，能够合成BDO，或者，构建聚(4-羟基丁酸酯)(P(4HB))合成载体质粒，表达克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶，富养罗尔斯通氏菌的PHA聚合酶，能够合成P(4HB)，或者构建同时表达同时4-羟基丁酸COA转移酶、醇醛脱氢酶和PHA聚合酶的载体质粒，实现同时合成P(4HB)和BDO，采用微生物发酵法来适应节能减排、绿色、低碳经济发展的需求，另一方面，提高1,4-丁二醇产能，加大1,4-丁二醇与γ-丁内脂、1,4-丁二醇与四氢呋喃、1,4-丁二醇与聚匹亚甲基醚二醇、聚氨脂和1.4-丁二醇与聚对苯甲酸丁二醇脂的联产，创造出附加值更高的化工产品。

附图说明

图1为合成1,4-丁二醇和聚4-羟基丁酸酯的技术路线示意图；

图2为发酵产物检测结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。

微生物细胞以葡萄糖为底物生物合成聚4-羟基丁酸酯和1,4丁二醇的过程是一个复杂的生化反应过程。由于微生物细胞内的酶系十分复杂，细胞内各种代谢活动、细胞结构、细胞生理活性对酶的催化效率会产生很大的影响。这些因素相互关联，相互影响，需要全方面认真考虑这些问题，底物抑制，高浓度的底物葡萄糖会影响菌株生长和葡萄糖转化率。本发明以大肠杆菌菌为基础研究菌株，对其进行基因改造，改造大肠杆菌工程菌可以发酵产生1,4丁二醇和聚4-羟基丁酸酯，消耗了一部分底物葡萄糖。本发明中生物发酵法合成1,4-丁二醇和聚4-羟基丁酸酯的技术路线图如图1所示，以葡萄糖为碳源，经微生物代谢为琥珀酸，利用琥珀酰辅酶A合成酶、辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4HB脱氢酶将琥珀酸转化为4-羟基丁酸(4HB)，利用4-羟基丁酸COA转移酶将4HB转化为4-羟基丁酰-CoA，基于4-羟基丁酰-CoA，可利用醛醇脱氢酶合成1,4-丁二醇，或利用PHA聚合酶合成聚4-羟基丁酸酯。

本发明具体实施例中，实验材料包括

1.工程菌来源：克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、牙龈卟啉单胞菌(Poyphyromonas gingivalis)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)H16、大肠杆菌；

2、基因片段来源：琥珀酰辅酶A合成酶基因(sucCD)为源于大肠杆菌；辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶基因(sucD)源于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；4HB脱氢酶基因(4HBd)源于牙龈卟啉单胞菌(Poyphyromonasgingivalis)；富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16的PHA聚合酶基因(phaC)和克氏梭菌(Clostridium kluyveri)中编码4-羟基丁酸COA转移酶基因(cat2)、醛醇脱氢酶(adhE2)源自于丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)；

3.培养基：LB培养基、M9培养基、R培养基；培养基的组成包括：碳源20-30g/L，氮源2-7g/L，无机盐0.1-2g/L。碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括葡萄糖等。氮源选自酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐；

筛选条件为：将菌株接种到筛选培养基，培养温度30-40℃，培养时间为16-48小时，发酵过程中微量供氧，保持培养过程中培养基的pH值在6.0-7.5之间；

质粒：pKESS5.3、pZA13s、PBBR1MCS2、pKD46、PKD3、pCP20；

抗生素：氨苄青霉素、卡那青霉素。

本发明具体实施例中基因工程研究实验方法包括：利用同源重组基因敲除的实验方法，依次将工程菌中的乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶敲除；

(1)敲除片段的获得，使用通用引物为模板扩增出反转酶识别位点FRT。在获得FRT+抗性基因表达元件+FRT序列后，在上下游引物的两端加入乙醇脱氢酶/甲酸裂解酶/苹果酸脱氢酶/乳酸脱氢酶基因CDS两侧50bp左右的同源臂；

(2)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株；

(3)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备；

(4)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂；

(5)基因敲除菌株的鉴定。

利用构建表达质粒的方法构建了在经过敲除的大肠杆菌中表达琥珀酰辅酶a合成酶、辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、4HB脱氢酶的质粒，包括：

(1)表达质粒的线性化，在载体质粒上的限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化；

(2)扩增过表达的目的基因。进行PCR扩增，可获得大肠杆菌中的琥珀酰辅酶A合成酶的基因片段，克氏梭菌中的辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和源于牙龈卟啉单胞菌的4-羟基丁酸脱氢酶；

(3)目的基因与线性化载体相连，将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过抗性的平板进行筛选阳性克隆，阳性克隆中提取的质粒；

(4)质粒的转化，取制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入构建后质粒进行电击转化，涂布在性的平板上，过夜培养。

利用构建表达质粒的方法构建了在大肠杆菌中表达4-羟基丁酰辅酶a转移酶、醇醛脱氢酶，结合上一步质粒转入同一大肠杆菌菌株，具体包括：

(1)表达质粒的线性化。在载体质粒上的限制性酶切位点用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化；

(2)扩增过表达的目的基因，以克氏梭菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶基因片段cat2，以丙酮丁醇梭菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得丙酮丁醇梭菌中的醇醛脱氢酶基因dhaE2；

(3)目的基因与线性化载体相连，将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过抗性的平板进行筛选阳性克隆，阳性克隆中提取的质粒。

利用构建表达质粒的方法构建了在大肠杆菌中表达4-羟基丁酰辅酶a转移酶、PHA聚合酶，结合4HB表达质粒，该菌株是用于生产聚4-羟基丁酸酯的菌株；

(1)表达质粒的线性化，在载体质粒上的限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化；

(2)扩增过表达的目的基因。以克氏梭菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中4-羟基丁酸辅酶A转移酶cat2基因片段；以富养罗尔斯通氏菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得富养罗尔斯通氏菌中PHA聚合酶phaC基因片段；

(3)目的基因与线性化载体相连，将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒。

利用构建表达质粒的方法构建了在大肠杆菌中表达4-羟基丁酰辅酶a转移酶、PHA聚合酶、醇醛脱氢酶，结合4HB表达质粒，该菌用于生产BDO和聚4-羟基丁酸酯；

(1)表达质粒的线性化，在载体质粒(商业产品)上的限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化；

(2)扩增过表达的目的基因。以克氏梭菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中4-羟基丁酸辅酶A转移酶cat2基因片段，以富养罗尔斯通氏菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得富养罗尔斯通氏菌中PHA聚合酶phaC基因片段，以丙酮丁醇梭菌的基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，可获得丙酮丁醇梭菌中的醇醛脱氢酶基因dhaE2；

(3)目的基因与线性化载体相连，将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆，阳性克隆中提取的质粒。

2.采用液-液萃取法从发酵液中提取丁二酸。

3.发酵培养发酵工艺：

大肠杆菌工程菌生产1,4-丁二醇的方法，该方法为：将大肠杆菌工程菌接种到培养基中，进行发酵培养。

发酵培养基的组成包括：碳源30-50g/L，氮源5-50g/L，无机盐5-10g/L。

发酵的碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括葡萄糖。氮源选自酵母提取物、蛋白胨、尿素、酪蛋白水解物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度28-30℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

培养发酵工艺：大肠杆菌工程菌生产聚4-羟基丁酸酯的方法，该方法为：将大肠杆菌工程菌接种到培养基中，进行发酵培养。

发酵的碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括葡萄糖、4HB。氮源选自酵母提取物、蛋白胨、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

培养发酵工艺：所述大肠杆菌工程菌生产1,4-丁二醇和聚4-羟基丁酸酯的方法，该方法为：将大肠杆菌工程菌接种到培养基中，进行发酵培养。

发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。

发酵的碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括葡萄糖。氮源选自酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

4.工程菌检测

(1)发液中生物量的测定

将发酵液稀释至一定范围，以纯净水为对照，采用可见光分光光度计测定650nm波长下的吸光光度值来表征菌体生物量。发酵液一般稀释至OD 650nm示数为0.2-0.6为宜。

(2)4-羟基丁酸浓度的测定

使用高效液相对发酵液中的4-羟基丁酸含量进行测定。

(3)1,4-丁二醇的测定

使用高效液相对发酵液中的1，4-丁二醇含量进行测定。

4)聚4-羟基丁酸酯检测

聚4-羟基丁酸酯分析方法采用气相色谱分析方法。

实施例1

本实施例利用基因重组方法构建乙醇脱氢酶基因失活的大肠杆菌菌株，来实现乙醇脱氢酶活性的失活。

(1)扩增乙醇脱氢酶基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以YC1U:5’-atgaataacttcaatctgcacacccccacgcgcattctattcggcaaggg-3’，YC1D:5’-cccttgccgaatagaatgcgcgtgggggtgtgcagattgaagttattcat-3’，YC2U:5’-accatgacattacactagatgtatctcgtcggatatacgaggcggcccga-3’，YC2D:5’-tcgggccgcctcgtatatccgacgagatacatctagtgtaatgtcatggt-3’为特异性引物，以大肠杆菌DH5α基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到乙醇脱氢酶基因前后的DNA序列。以P1：5’-ATATGAATATCCTCCTTAG-3’P2:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。

(2)以pMD18-T-s:5-’atcgtcgacctgcaggca-3’和pMD18-T-a:5’-atctctagaggatccccgggt-3’为特异性引物，以质粒pMD-18T simple(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到线性化的pMD18-T基因片段。

(3)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Clo ning Kit试剂盒中的操作方法，之后将重组片段化转入DH5α感受态细胞中，并用安卞霉素抗性平板进行筛选，筛选的阳性克隆。

(4)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株，使用热激发法将基因敲除载体pKD46转化至待敲除的大肠杆菌中。

(5)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。

(6)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂将敲除片段和pKD46质粒混匀，诱导表达，完成基因敲除和抗性基因重组。

(7)基因敲除菌株的鉴定，消除敲除菌株的抗性基因，选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序，消除菌株的抗性基因，把pCP20转化至完成敲除的菌株，30℃培养过夜后转为42℃培养，消除pCP20。

实施例2

本实施例利用基因重组方法构建甲酸裂解酶基因失活的大肠杆菌菌株，来实现甲酸裂解酶活性的失活。

(1)扩增甲酸裂解酶基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以JS1U:5’-atgaaggtagacatcgatacttcagataagctatacgctgatgcgtggtt-3’，JS1D:5’-aaccacgcatcagcgtatagcttatctgaagtatcgatgtctaccttcat-3’，JS2U:5’-cgcgcgaacagcagcaagatgtgatttctcggacgtttacacaagcttta-3’，JS2D:5’-taaagcttgtgtaaacgtccgagaaatcacatcttgctgctgttcgcgcg-3’为特异性引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到甲酸裂解酶基因前后的DNA序列。以P1：5’-atatgaatatcctccttag-3’，P2:5’-tgtaggctggagctgcttcg-3’，为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。

(2)pMD18-T-s:5’-atcgtcgacctgcaggca-3’和pMD18-T-a：5’-atctctagaggatccccgggt-3’为特异性引物，以质粒pMD-18T simple(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到线性化的pMD18-T基因片段。

(3)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Clo ning Kit试剂盒中的操作方法。之后将重组片段化转入DH5α感受态细胞中,并用安卞霉素抗性平板进行筛选，筛选的阳性克隆。

(4)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株。使用热激发或者电转化法将基因敲除载体pKD46转化至待敲除的大肠杆菌中。

(5)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。

(6)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂将敲除片段和pKD46质粒混匀，诱导表达，完成基因敲除和抗性基因重组。

(7)基因敲除菌株的鉴定，消除敲除菌株的抗性基因。选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序。消除菌株的抗性基因，把pCP20转化至完成敲除的菌株，30℃培养过夜后转为42℃培养，消除pCP20。

实施例3

本实施例利用基因重组方法构建苹果酸脱氢酶基因失活的大肠杆菌菌株，来实现苹果酸脱氢酶活性的失活。

(1)扩增苹果酸脱氢酶基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以PG1U:5’-atggagccgaaaaccaaaaagcaacgttcgctctacattccctatgctgg-3’，PG1D:5’-ccagcatagggaatgtagagcgaacgttgctttttggttttcggctccat-3’，PG2U:5’-acgataacttttggcaagcagagtatcgagactatagacgaacatcaatc-3’，PG2D:5’-gattgatgttcgtctatagtctcgatactctgcttgccaaaagttatcgt-3’为特异性引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到苹果酸脱氢酶基因前后的DNA序列。以P1：5’-atatgaatatcctccttag-3’p2:5’-tgtaggctggagctgcttcg-3’，为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。

(2)pMD18-T-s:5’-atcgtcgacctgcaggca-3’和pMD18-T-a：5’-atctctagaggatccccgggt-3’为特异性引物，以质粒pMD-18T simple(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到线性化的pMD18-T基因片段。

(3)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Clo ning Kit试剂盒中的操作方法。之后将重组片段化转入DH5α感受态细胞中，并用安卞霉素抗性平板进行筛选，筛选的阳性克隆。

(4)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株。使用热激发或者电转化法将基因敲除载体pKD46转化至待敲除的大肠杆菌中。

(5)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。

(6)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂将敲除片段和pKD46质粒混匀，诱导表达，完成基因敲除和抗性基因重组。

(7)基因敲除菌株的鉴定，消除敲除菌株的抗性基因。选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序。消除菌株的抗性基因，把pCP20转化至完成敲除的菌株，30℃培养过夜后转为42℃培养，消除pCP20。

实施例4

本实施例利用基因重组方法构建乳酸脱氢酶基因失活的大肠杆菌菌株，来实现乳酸脱氢酶活性的失活。

(1)扩增乳酸脱氢酶基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以RS1U:5’-atgaaacttgccgtttatagcacgaaacagtatgacaaaaagtatctgca-3’，RS1D:5’-tgcagatactttttgtcatactgtttcgtgctataaacggcaagtttcat-3’，RS2U:5’-agaatttgtcaaacctagagaagggagaaacttgccccaatgagttagtc-3’，RS2D:5’-gactaactcattggggcaagtttctcccttctctaggtttgacaaattct-3’为特异性引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到乳酸脱氢酶基因前后的DNA序列。以P1：5’-atatgaatatcctccttag-3’，P2:5’-tgtaggctggagctgcttcg-3’，为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。

(2)pMD18-T-s:5’-atcgtcgacctgcaggca-3’和pMD18-T-a:5’-atctctagaggatccccgggt-3’，为特异性引物，以质粒pMD-18T simple(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到线性化的pMD18-T基因片段。

(3)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Clo ning Kit试剂盒中的操作方法。之后将重组片段化转入DH5α感受态细胞中，并用安卞霉素抗性平板进行筛选，筛选的阳性克隆。

(4)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株。使用热激发或者电转化法将基因敲除载体pKD46转化至待敲除的大肠杆菌中。

(5)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。

(6)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂将敲除片段和pKD46质粒混匀，诱导表达，完成基因敲除和抗性基因重组。

(7)基因敲除菌株的鉴定，消除敲除菌株的抗性基因。选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序。消除菌株的抗性基因，把pCP20转化至完成敲除的菌株，30℃培养过夜后转为42℃培养，消除pCP20。

经过实施例1-4，制备出乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶敲除的大肠杆菌。

实施例5

本实施例构建表达琥珀酰辅酶a合成酶、辅酶a依赖性琥珀酸半醛脱氢酶和4HB脱氢酶的质粒。

(1)表达质粒的线性化。在pZA33质粒粒(商业产品)上的MaubⅠ和ScaⅠ、XhoⅠ和XmaⅠ、PstⅠ和HpaⅠ限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。

(2)扩增过表达的目的基因。以大肠杆菌的基因组为模板，以F1：5’-CGCGCGCGCGCGATGAAGGAAACTGACATCGCG-3’以及R1：5’-CGCGAGTACTCTTTGCCAATCCCAGACGG-3’为引物进行PCR扩增，可获得大肠杆菌中的琥珀酰辅酶A合成酶的基因片段。大肠杆菌中的琥珀酰辅酶A合成酶的基因片段序列如SEQ ID NO.1。

以克氏梭菌的基因组为模板，以F2：5’-CGCGCTCGAGATGGAGATCAAGGAGATGGTGAG-3’以及R2：5’-CGCGCCCGGGGAGCTCCCAAATCTCCTTGTC-3’为引物进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中的辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的基因片段。克氏梭菌中的辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的基因片段序列如SEQ ID NO.2。以牙龈卟啉单胞菌的基因组为模板，以F3：5’-CGCGCTGCAGATGAAGCTTCTTAAACTTGCGCCA-3’以及R3：5’-CGCGGTTAACCGCGCGGTACAGTTTTTTATAAG-3’为引物进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中的辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的基因片段。克氏梭菌中的辅酶A依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的基因片段序列如SEQ ID NO.3。

(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pZA33-sucCD-sucD-4HBd。

(4)质粒的转化。取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒pZA33-sucCD-sucD-4HBd进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。

实施例6

本实施例构建表达4-羟基丁酸COA转移酶和醛醇脱氢酶的质粒。

(1)表达质粒的线性化。在pZE13s质粒(商业产品)上的EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点以及NheⅠ和AvrⅡ上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。

(2)扩增过表达的目的基因。以克氏梭菌的基因组为模板，设计引物F4：5’-cgcggaattcatggaatgggaagaaatatataaggagaa-3’；R4：5’-cgcgtctagagaagcgtttcttaaactcgttcataag-3’；F5：5’-aataataaaaatacatgtatcatggaatgggaag-3’；R5：5’-aacaaaggcgtagtattgaggtctagaggtcttaaa-3’；进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中的4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因片段cat2和丙酮丁醇梭菌中的醇醛脱氢酶基因片段adhE2。克氏梭菌中的4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因片段cat2和丙酮丁醇梭菌中的醇醛脱氢酶基因片段adhE2序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID No.5。

(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段cat2和adhE2与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pZE-cat2-adhE2。获得表达4-羟基丁酸COA转移酶和醛醇脱氢酶的质粒。

实施例7

本实施例构建表达4-羟基丁酸COA转移酶和PHA聚合酶的质粒。

(1)表达质粒的线性化。在pBBR1MCS2质粒(商业产品)上的ScaⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点以及EcoRⅠ和HindⅢ上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。

(2)扩增过表达的目的基因。以克氏梭菌的基因组为模板，设计引物F6：5’-cgcggagctcatggaatgggaagaaatatataaggagaa-3’；R6：5’-cgcgtctagagaagcgtttcttaaactcgttcat-3’；进行PCR扩增，可获得克氏梭菌中4-羟基丁酸辅酶a转移酶cat2基因片段。克氏梭菌中4-羟基丁酸辅酶a转移酶cat2基因片段序列如SEQ ID NO.4。以富养罗尔斯通氏菌的基因组为模板，设计引物F7：5’-cgcggaattcgccttcgaggttgggcg-3’；R7：5’-cgcgaagcttgtgatggtggtggtgatgctgc-3’进行PCR扩增，可获得富养罗尔斯通氏菌中PHA聚合酶phaC基因片段。富养罗尔斯通氏菌中PHA聚合酶phaC基因片段序列片段列如SEQ ID NO.6。

(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段cat2、phaC依次与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pBBR1MCS2-cat2-phaC。

实施例8

本实施例构建表达4-羟基丁酸COA转移酶、醛醇脱氢酶和PHA聚合酶的质粒。

(1)表达质粒的线性化。在pBBR1MCS2质粒(商业产品)上限制性酶切位点上用SacⅠ和XbaⅠ、XhoⅠ和ApaⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。

(2)扩增过表达的目的基因。以克氏梭菌的基因组为模板，设计引物F8：5’-cgcggagctcatggaatgggaagaaatatataaggagaa-3’；R8：5’-cgcgtctagagaagcgtttcttaaactcgttcat-3’；

扩增过表达的目的基因。以丙酮丁醇梭菌的基因组为模板，设计引物F9：5’-cgcgctcgagatgaaagtgaccaaccaaaaggaact-3’；R9：5’-cgcggggccccgcgaaaacttttaatatagatgtctttc-3’；扩增过表达的目的基因。以富养罗尔斯通氏菌的基因组为模板，设计引物F10：5’-cgcggaattcgccttcgaggttgggcg-3’；R10：5’-cgcgaagcttgtgatggtggtggtgatgctgc-3’。

(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pBBR-cat2-adhE2-phaC。

实施例9

本实施例构建工程菌。

构建产1,4-丁二醇的工程菌。取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌DH5α感受态细胞，加入质粒pZA33-sucCD-sucD-4HBd、pZE-cat2-adhE2进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验，菌株命名为E1-E4。

构建产聚4-羟基丁酸酯的工程菌。取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒pZA33-sucCD-sucD-4HBd、pBBR1MCS2-cat2-phaC进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验，菌株命名为E5-E8。

构建同时产1,4-丁二醇和聚4-羟基丁酸酯的工程菌。取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒pZA33-sucCD-sucD-4HBd、pBBR-cat2-adhE2-phaC进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验，菌株命名为E8-E12。

实施例10

本实施例利用实施例9构建的工程菌进行发酵测试。

发酵提取工艺

1.培养基：

(1)LB培养基：酵母浸粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、甘油28g、pH7.8；

(2)MgSO

(3)CaCl

(4)5×M9盐溶液：Na

(5)葡萄糖溶液20％:葡萄糖4g加入双蒸水20mL；

(6)M9培养基：5×M9盐溶液200mL、1M的MgSO

(7)R培养基：胰酪蛋白胨5.0g、酵母浸粉2.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、乳糖10.0g、氯化钠2.5g、pH 7.1；

2.采用液-液萃取法从发酵液中提取丁二酸

先将发酵液进行预处理，再与萃取剂进行液液萃取，待萃取分层分离后，将萃取相通入蒸馏塔，并将水通入蒸馏塔中进行蒸馏反萃取塔顶得到酯类溶剂经冷却后作为萃取剂循环使用，塔底得到的丁二酸水溶液经结晶得到丁二酸。

3.产1,4丁二醇大肠杆菌工程菌发酵

直接产生BDO，在加入N

4.产聚4-羟基丁酸酯大肠杆菌工程发酵

培养温度均为37℃，接种量均为10％。摇床培养时，300mL三角瓶中装50mLM9培养基，摇床转速为280r/min，培养48h。发酵罐培养时，采用5L搅拌式不锈钢发酵罐，初始装3LM9培养基，补料溶液含60％葡萄糖，2％硫酸镁和4％酵母提取物。当培养基中葡萄糖浓度低于0.5％时，补加1％的葡萄糖。当培养基中4HB的浓度低于0.05％时，用20％的4HB贮液向培养基中补加0.4％的HB。通气量为1～2vm，搅拌速度为600～1000r/min，以控制溶氧度在20％以上。酸碱双向调控维持pH6.8-7.1。

样品处理及检测:1mL发酵液12000rpm离心，上清液沸水浴10min、12000rpm离心半小时，上清液经用0.22uM的膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)分析。

5.产1,4丁二醇和聚4-羟基丁酸酯的工程菌发酵

在加入N

工程菌检测

分析程序：采用HPLC、LCMS/MS和GCMS来分析细胞培养物和发酵试样。两种技术之间的良好相关性(变异在10％内)提供方法交叉验证且确保数据精确性。

1.发液中生物量的测定

将发酵液稀释至一定范围，以纯净水为对照，采用可见光分光光度计测定650nm波长下的吸光光度值来表征菌体生物量。发酵液一般稀释至OD650nm示数为0.2-0.6为宜。

2.4HB浓度的测定

在与安捷伦1200HPLC界面连接的API3200三相四极系统上利用基于电喷雾电离和MRM的获取方法进行LCMS/MS分析。以正电离模式监测内标(将C同位素标记类似物分别用于各分析物,以补偿基质效应并确保线性度)。使用负电离来定量酸性分析物4HB。

3.1,4-丁二醇测定

通过配备有二极管阵列和折射率(RI)检测器的HPLC使用离子排除Carbomix H-NP5管柱(epax)以5mM硫酸作为移动相在0.6mL/min流速和55℃管柱温度下测量BDO。在210nm下的UV吸收与折射率二者的检测器中监测有机酸,同时仅使用RI来测量BDO。所有化学品和试剂都来自西格玛奥德里奇。在与安捷伦1200HPLC界面连接的API3200三相四极系统,上利用基于电喷雾电离和MRM的获取方法进行LCMS/MS分析。示例性展示检测结果如图2所示。

4.聚4-羟基丁酸酯检测

聚4-羟基丁酸酯分析方法采用气相色谱分析方法。产物转化率的具体计算方法包括：产率＝产物产量/产物物质的量×底物物质的量/底物量。

表1

表2

表3

各工程菌检测结果如表1-表3所示，表1为4组产1,4-丁二醇工程菌平行实验发酵结果，可见，改造后的工程菌可将葡萄糖转化成丁二酸并在一系列酶的作用下转化成4HB，再通过酶促反应生成BDO，并在发酵液中积累；表2为4组产聚4-羟基丁酸酯工程菌平行实验发酵结果，可见，改造后的工程菌可将葡萄糖转化成丁二酸并在一系列酶的作用下转化成4HB，再通过酶促反应生成P(4HB)并在发酵液中积累；表3为4组产1,4-丁二醇和聚4-羟基丁酸酯工程菌平行实验发酵结果，可见，改造后的工程菌可将葡萄糖转化成丁二酸并在一系列酶的作用下转化成4HB，再通过醛醇脱氢酶以及PHA聚合酶反应生成BDO和P(4HB)。

综上所述，在乙醇脱氢酶、甲酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶敲除的基础上，通过构建表达载体，过表达大肠杆菌中的琥珀酰辅酶A合成酶，表达克氏梭菌中的辅酶依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，牙龈卟啉单胞菌中的4HB脱氢酶获得4HB生成路径质粒，进一步地，构建BDO合成载体质粒，表达克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶，丙醇丁醇梭菌的醇醛脱氢酶，能够合成BDO，或者，构建P(4HB)合成载体质粒，表达克氏梭菌中的4-羟基丁酸COA转移酶，富养罗尔斯通氏菌的PHA聚合酶，能够合成P(4HB)，或者构建同时表达4-羟基丁酸COA转移酶、醇醛脱氢酶和PHA聚合酶的载体质粒，实现同时合成P(4HB)和BDO。