靶向目的基因FISH荧光探针及其自组装放大探针系统

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体而言，涉及一种靶向目的基因FISH荧光探针及其自组装放大探针系统。

背景技术

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种通过荧光标记的核酸序列探针靶向目标基因且原位显示其靶点核酸空间位置信息的方法。结合基因遗传特征和分子细胞生物学技术，可以在细胞水平上检测染色体的数目或结构异常，特别适用于染色体缺失和易位，同时也可初步定性的检测基因表达差异与位置关系。由于其具有一定的特异性、原位可视性等优势，被广泛应用于基因生物基础科学研究和遗传肿瘤病诊断等临床应用。

随着FISH技术的不断发展与优化，目前常见的FISH探针来源主要有；1）化学合成寡核苷酸单链或双链方式获得短片段探针（通常15~30bp），2）质粒、细菌人工染色体（BAC），链接标记信号基团。 3）通过酶切克隆载体或PCR方法扩增或体外转录得到双链或单链探针（通常长度几百或几千bp）。例如安捷伦科技有限公司合成的寡核苷探针（申请号201410045228.2）。

通过PCR方法扩增基因检测基因表达丰度，收集样品混合物，抽提总RNA基因信息，无法确定基因具体来源细胞，无法检测活细胞，无法直接显示基因定位情况。

通过BAC克隆获得长链FISH探针检测或化学合成短链直接标记荧光检测。短链寡核苷酸通过合成多条序列两端标记方式，或通过ZZ或π等方式靶向结合方式进行目标序列结合，专利申请号：202210759816.7。BAC具有以下缺点，不是人类基因组的所有部分都存在BAC克隆。其次，基于天然DNA的BAC包含大量的重复序列，如Alu序列，该富含重复的探针会与基因组杂交，会产生高背景信号。长链检测技术无法检测短序列信息，如miRNA；而且现有Fish探针多以DNA结构为基础结合能力相对较弱，且没有设置具体的封闭方法，导致现有短链寡核苷酸探针背景或非特异性信号较高，相关检测方式通常仅对固定液固定的组织细胞进行鉴定，无法对活细胞相关基因标定检测。

通常随着高通量测序基因信息挖掘，除了DNA染色体上相关基因缺失、异位、突变重组、拷贝数改变等基因变化，同时也有观察检测复杂的细胞和组织环境中基因表达变化的要求，传统的FISH技术经常面临着检测基因单一，多集中于检测基因染色体上的信息变化，对于新挖掘的circRNA， microRNA， LncARNA等基因会出现信号放大能力不足、特异性低，效率低、背景噪音高的挑战，特别是对于短序列、低拷贝数的目标靶分子检测效果相对较差，通过增加靶标探针的数量累积荧光强度，可以在一定程度上提高信号的强度，但是需要更长的核酸序列进行杂交，这极大限制了对短序列如microRNA等基因分子的检测的应用，同时也会额外增加潜在的非特异结合与背景信号。因此，需要开发针对有重要功能的小核酸短序列RNA（small RNA：microRNA、piRNA）、短核酸序列DNA和可变剪切体(alternativesplicing)，如鉴别同源circRNA和母本以及非编码RNA等基因分子检测手段，目前还缺少强的信号，高特异，低背景的FISH检测方法。

因此，综合以上因素需要开发一种可定位，信号强度高、特异性强、背景噪音低、便于操作的原位检测技术，实现对活细胞样品，固定组织样品，细胞爬片或涂片样品中的长、短基因进行区别检测的手段方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种靶向目的基因FISH荧光探针，该荧光探针称为靶向目的基因FISH荧光探针X，所述FISH荧光探针X中间是长度15-65bp的靶向目的基因的线性探针序列，所述线性探针序列左右两端分别连接一个长度5-35bp的颈环序列，当所述线性探针序列与所述靶向目的基因结合时，所述颈环序列形成颈环结构；所述颈环序列在所述线性探针序列左右两端分别形成颈环结构，左右两端颈环序列可以是相同的颈环序列或不同的颈环序列；在每个所述颈环序列末端引入作为RNA酶切割位点的RNA碱基，和在两端的RNA碱基末端分别连接有封闭序列，所述封闭序列长度为5-30bp，左右两端的封闭序列与左右两端的线性探针序列分别特异性结合，所述封闭序列与所述线性探针序列特异性结合后Tm值比所述线性探针序列与所述靶向目的基因特异性结合后Tm值低至少5℃；所述线性探针序列标记了用于FISH荧光检测的荧光基团，标记的荧光基团不影响所述线性探针序列与目的基因特异性结合；所述封闭序列在其游离端标记荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团在所述封闭序列与所述线性探针序列结合的情况下淬灭所述线性探针序列上的荧光基团，从而减少所述FISH荧光探针在未有效结合目的基因时的背景荧光；杂交检测时，所述线性探针序列与所述目的基因结合，左右两端的颈环结构打开，每端的封闭序列与每端的线性探针序列特异性结合也断开，通过加入RNA酶切割所述RNA酶切割位点，释放所述封闭序列，所述荧光淬灭基团不再对所述线性探针序列上的荧光基团具有淬灭作用。

在一种实施方式中，所述线性探针序列连续或间隔进行荧光标记。

在一种实施方式中，所述RNA酶切割位点是核糖核酸酶酶切位点、核糖核酸酶酶切位点、热稳定核糖核酸酶酶切位点。

在一种实施方式中，所述颈环序列长度是5~15bp，选自5'-ATTGATGTATTGTG-3'、5'-TCAAGAG-3'、5'-TTGATATCCG-3'; 5'-TTCAAGAGA-3'或5'-CCACACC-3'。

在一种实施方式中，所述探针系统包括上述的靶向目的基因的FISH荧光探针X，还包括一级级联放大探针Y，所述探针Y包括15~65bp的 Y探针中间序列和Y探针两端侧翼序列，所述Y探针中间序列不与目的基因结合或/和X探针特异性结合，所述Y探针中间序列标记荧光基团，和所述Y探针两端侧翼序列分别靶向X探针两端的颈环序列，两者之间特异性结合。

在一种实施方式中，所述探针系统进一步包括二级级联放大探针Z，所述探针Z包括15~65bp的 Z探针中间序列和Z探针两端侧翼序列，所述Z探针中间序列与所述Y探针中间序列特异性结合，所述Z探针中间序列不与目的基因结合或/和X探针特异性结合，所述Z探针中间序列标记荧光基团；所述Z探针两端侧翼序列分别与下一级Y探针两端侧翼序列互补。

在一种实施方式中，所述X探针与目的基因的结合Tm值，Y探针侧翼序列与X探针两侧的颈环序列结合Tm值，Z探针与Y探针的结合Tm值，这些Tm值之间相差不超过±5℃。

在一种实施方式中，所述X探针与目的基因的结合Tm值，Y探针侧翼序列与X探针两侧的颈环序列结合Tm值，Z探针与Y探针的结合Tm值，这些Tm值之间相差不超过±2℃。

在本发明的技术方案中，设计双锁（双封闭）荧光标记探针时，

1）首先确定目标基因关键靶标区域，该目标区域应该是可以显示疾病或性状（如肿瘤，遗传病，基因丰度高低，碱基突变、缺失、插入等）是特征性，特异性的核酸序列，包括具有上述特征的DNA序列或RNA序列。

2）根据目标基因设计双封闭荧光标记探针：利用生物信息学技术方法，在NCBI等基因数据库中检索目的基因，对比分析目的基因特征性序列，针对该序列设计目标探针，简称为X探针，序列长度为15~65bp，且GC含量30~65%，目标探针序列可以连续或间隔进行应该标记（如CY3，FAM，CY5，FITC等荧光标记物，或生物素、地高辛等间接信号标记），为了增加序列稳定性与结合能力特异性，可以对序列中相关碱基进行修饰（如，2’F、2’MOE、LNA、2’-Ara-F、2’-O-benzyl、UNA、UNG、UNT、UNC、cEt等修饰方式）。

3）封闭序列（Blocking sequence or Locking sequence），该封闭序列长度（5-30bp），在其游离端标记淬灭荧光（或封闭荧光，如标记BHQ1，BHQ2，BHQ3，TAMRA，Eclipse，Dabcyl等淬灭荧光基团，其选择性需要根据目标探针标记荧光而决定），该淬灭荧光可以在锁定序列结合目标探针情况下淬灭目标探针荧光，减少目标探针在未有效结合目的基因时的背景荧光。同时在设计Blocking序列时，需要考虑Blocking序列互补后留有可以在高盐浓度（≥0.3 M）下，RNase A(核糖核酸酶 A，Ribonuclease A)(NEB T3018-2）特异性降解单链 RNA 上的胞嘧啶（C）或尿嘧啶（U）残基。具体来说，切割识别的是由某核苷酸上的 5’-核糖和相邻的嘧啶类核苷酸 3’-核糖上磷酸基团形成的磷酸二酯键，从而使得 2’， 3’-环磷酸水解为对应的 3’-核苷磷酸（比如，pG-pG-pC-pA-pG 经RNase A 切割产生 pG-pG-pCp和 A-pG）；或通过核糖核酸酶If（RNase If）（NEB， M0243）是一种RNA内切酶，它会在所有RNA二核苷酸键上裂解，留下5′羟基和2´、3´环磷酸；或通过热稳定核糖核酸酶H（RNase H）(NEB， M0523）可选择性水解RNA:DNA杂交分子中RNA链的磷酸二酯键，同时保持DNA链完整且在65°C以上具有最佳活性；或通过核糖核酸酶H（Ribonuclease H）（NEB，M0297），能特异性水解与DNA杂交的RNA的磷酸二酯键，不能消化单链或双链DNA。或通过Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体后，该复合物就核酸单链切割活性，并将体系中任意单链DNA切成碎片（称为trans切割） ，使得残基上标记的淬灭荧光基团得到释放，消除对目标探针荧光淬灭影响。同时可以消除样品中未结合的单链RNA。为了增加序列稳定性与结合能力特异性，可以选择性的对序列中相关碱基进行修饰（如，2’F、2’MOE、LNA、2’-Ara-F、2’-O-benzyl、UNA、cEt等修饰方式）。

4）颈环结构：采用5~15bp作为颈环结构（例如：5'ATTGATGTATTGTG3'; 5'TCAAGAG3'；5'TTGATATCCG3'; 5'TTCAAGAGA3'；5'CCACACC3'等具有环状二级结构特征的核酸序列），两侧颈环结构具体序列可以相同也可以不相同，但需要在靶向探针的互补序列作用下形成颈环结构。且与下游放大信号序列颈环结构互补成双链形式。为了增加序列稳定性与结合能力特异性，可以选择性的对序列中相关碱基进行修饰（如，2’F、2’MOE、2’Ome、LNA、2’-Ara-F、2’-O-benzyl、UNA、cEt等修饰方式）。

5）自组装放大探针系统：采用一对5~35bp的侧翼序列互补结合目的探针X两侧的颈环序列，同时侧翼序列中间含有互补放大信号的序列Y；进步放大可以针对Y序列设计互补序列Z，Z序列两侧引出侧翼序列可以再次用于下游放大结合级联，上述序列该序列可以连续或间隔进行应该标记（如CY3，FAM，CY5，FITC等荧光标记物，或Biotin等间接信号标记），为了增加序列稳定性与结合能力特异性，可以对序列中相关碱基进行修饰（如，2’F、2’MOE、LNA、2’-Ara-F、2’-O-benzyl、UNA、cEt等修饰方式）；

6）荧光基团染料：本方法中的所采用的标记物的荧光染料 ( 荧光基团 ) 可以从如下染料中选择一种或几种。荧光团的实例包括， 但不仅限于，荧光染料Alexa Fluor350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 555、Alexa Fluor 561、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL、Coumarin、Cy3、Cy5、Fluorescein (FITC)、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Green、Pacific Orange、PE-Cyanine7、PerCP-Cyanine5.5、Tetramethylrhodamine (TRITC)；Super Bright 和 eFluor 染料eFluor 450、eFluor 506、eFluor 660、PE-eFluor 610、PerCP-eFluor 710、APC-eFluor 780、Super Bright 436、Super Bright 600、SuperBright 645、Super Bright 702、Super Bright 780；DNA 染料DAPI、Propidium Iodide、SYTO 9、SYTOX Green、TO-PRO-3；Qdot 探针Qdot 525、Qdot 565、Qdot 605、Qdot 655、Qdot705、Qdot 800；荧光蛋白标记Allophycocyanin (APC)、R-Phycoerythrin (R-PE)；表达的荧光蛋白Cyan Fluorescent Protein (CFP)、Green Fluorescent Protein (GFP)、RedFluorescent Protein (RFP); BUV 染料Brilliant Ultra Violet Polymer Dyes、Brilliant Ultra Violet 395、Brilliant Ultra Violet 496、Brilliant Ultra Violet563、Brilliant Ultra Violet 615、Brilliant Ultra Violet 661、Brilliant UltraViolet 737、Brilliant Ultra Violet 805、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet480、Brilliant Violet 650、Brilliant Violet 711、Brilliant Violet 786；NovaFluor染料NovaFluor Blue 510 Dye、NovaFluor Blue 530 Dye、NovaFluor Blue 555 Dye、NovaFluor Blue 585 Dye、NovaFluor Blue 610-30S Dye、NovaFluor Blue 610-70S Dye、NovaFluor Blue 660-40S Dye、NovaFluor Blue 660-120S Dye、NovaFluor Yellow 570Dye、NovaFluor Yellow 590 Dye、NovaFluor Yellow 610 Dye、NovaFluor Yellow 660Dye、NovaFluor Yellow 690 Dye、NovaFluor Yellow 700 Dye、NovaFluor Yellow 730Dye、NovaFluor Red 660 Dye、NovaFluor Red 685 Dye、NovaFluor Red 700 Dye、NovaFluor Red 710 Dye；以及其他有机或无机荧光染料如：Texas Red 4- 乙酰胺基 -4'-异硫氰酸芪 -2，2'- 二磺酸 ；吖啶和其衍生物， 如吖啶， 吖啶橙， 吖啶黄， 吖啶红， 和吖啶异硫氰酸酯 ；5-(2’- 氨乙基 ) 氨基萘 -1- 磺酸（EDANS）；4- 氨基 -N-[3- 乙烯砜基 / 苯基 ] 萘酰亚胺 -3，5二磺酸酯 (amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3，5disulfonate)( 荧光黄 VS) ；N-(4- 氨基 -1- 萘酰 ) 马来酰亚胺(N-(4-amino-1-naphthyl)maleimide) ；邻氨基苯甲酰胺 ；亮黄 (Brilliant Yellow) ；香豆素及衍生物， 如香豆素、7- 氨基 -4- 甲基香豆素(AMC， 香豆素 120)， 7- 氨基 -4-三氟甲基香豆素 (Coumaran151) ；花青及衍生物， 如焰红染料 (cyanosine)溴邻苯三酚红）；7- 二乙氨基 -3-(4’- 异硫氰酸苯基 )-4- 甲基香豆素 ；二乙氨基香豆素 ；二亚乙基三胺五乙酸 ；4，4’- 二异硫氰酸二氢 - 芪 -2，2’- 二磺酸 ；4，4’- 二异硫氰酸芪 -2，2’- 二磺酸 ；5-[ 二甲氨基 ] 萘 -1- 磺酰氯（DNS， 丹酰氯） ；4-(4’- 二甲氨基苯偶氮基 ) 苯甲酸 ；4- 二甲氨基苯偶氮基苯基 -4’- 异硫氰酸酯； 曙红及衍生物， 如曙红和曙红异硫氰酸酯 ；藻红及衍生物， 如藻红 B 和藻红异硫氰酸酯 ；乙啡啶 ；荧光素及衍生物， 如 5- 羧基荧光素 (FAM)、5-(4，6- 二氯三嗪 -2- 基 ) 氨基荧光素(DTAF)、2’7’-二甲氧基 -4’5’- 二氯 -6- 羧基荧光素、荧光素异硫氰酸酯、荧光素氯三嗪、 萘基荧光素、 和 QFITC(XRITC) ；荧光胺 ；IR144 ；IR1446 ；丽丝胺 (Lissamine)TM； 丽丝胺罗丹明、 荧光黄 (Lucifer yellow) ； 异硫氰基孔雀石绿 (MalachiteGreenisothiocyanate) ；4- 甲基伞形酮 ；邻甲酚酞 ；硝基酪氨酸；碱性副品红 ；尼罗红；俄勒冈绿；酚红 ；B- 藻红蛋白 ；邻苯二醛；芘及其衍生物， 如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚氨基 -1- 芘丁酸酯 ； 活性红 4(CibacronTM 亮红 3B-A) ；罗丹明及衍生物， 如 6- 羧基-X- 罗丹明、6- 羧基罗丹明 (R6G)、4，7- 二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明 B 磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明 B、罗丹明 123、罗丹明 X 异硫氰酸酯、磺基罗丹明 B、磺基罗丹明 101、磺基罗丹明 101 磺酰氯衍生物 ( 德克萨斯红 )、N，N，N，N- 四甲基 -6- 羧基罗丹明、四甲基罗丹明、和四甲基罗丹明异硫氰酸酯；核黄素 ；玫瑰酸和铽螯合物衍生物 ；氧杂蒽 ；或其组合。也可以使用其它本领域技术人员已知的荧光团或其组合。

7）间接标记基团：刀豆球蛋白A-巯基；PEG; PLGA; PEI， 生物素，羧基、氨基、多肽、HRP-Streptavidin、地高辛、适配体或其他可以通过氢键、化学键、范德华力、结构域、抗原抗体等方式被结合且能标记的功能基团等。

8）探针设计需考虑碱基互补Tm值要求：Tm值是指把核酸双链互补结构在一定反应条件下，热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。在比较高的温度下（70-90℃）会发生变性，核酸双链结构解开为单链，并变成无规则线团。在光学性质上则产生“增色效应”，即紫外吸收（在260毫微米波长处）值升高。通常以增色效应达到最大值的一半时的温度叫DNA的熔解温度（或熔点），以符号Tm表示。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA双链中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系，相同GC含量下通常DNA:DNA

9）靶向目的基因X探针: X序列合成具有形式见附图1，主要含如下关键信息，（1）靶向目的基因的探针序列（范围长度15~65bp，GC含量30~65%，且靶向目的基因的特异性要求100%，可以标记多种荧光基团或间接标记基团，且相关标记不影响与靶基因结合特征）；（2）封闭序列（Blocking sequence，范围长度5~30bp，与靶向目的基因探针两端匹配度75~100%，当封闭序列越短时要求匹配度越高；）；（3）颈环结构（范围长度5~35bp，GC含量20~75%，且靶向目的基因或其他探针区域匹配结合度尽可能低，以保证其自身颈环效应）; 封闭序列和颈环序列之间引入RNA酶切割位点。

10）一级级联放大探针Y: Y序列合成具有形式见附图2，主要含如下关键信息，（1）Y探针中间序列（范围长度15~65bp，GC含量30~65%，且与目的样品、X探针相关基因非特异结合要求低于50%，可以标记多种荧光基团或间接标记基团，且相关标记不影响与靶基因结合特征）（2）Y探针两端侧翼序列需要靶向X探针序列颈环结构（范围长度5~30bp，GC含量20~75%，两端侧翼序列与X探针序列匹配度90~100%，为改变探针稳定性或Tm，可以进行如下修饰中的一种或几种：硫代磷酸PS、糖环2位甲氧基2’Ome、糖环2位氟代、糖环2位甲氧已基2’MOE、锁核酸LNA、cEt等修饰方式）。

11）二级级联放大探针Z:Z序列合成具有形式见附图2，主要含如下关键信息：（1）Z探针中间序列（范围长度15~65bp，GC含量30~65%，Z探针与Y探针中间核心序列互补匹配度要求95~100%，且与目的样品、X探针相关基因非特异结合要求低于50%，可以标记多种荧光基团或间接标记基团，且相关标记不影响与靶基因结合特征）；（2）Z探针两端侧翼序列靶向Y探针两端侧翼序列（范围长度5~30bp，GC含量20~75%，两端侧翼序列与Y探针侧翼序列互补匹配度90~100%，为改变探针稳定性或Tm，可以进行如下修饰中的一种或几种：硫代磷酸(PS)、糖环2位甲氧基(2’Ome)、糖环2位氟代(2’F)、糖环2位甲氧已基(2’MOE)、锁核酸(LNA)、cEt等修饰方式）。

12) 根据实验需求，可以单独使用X探针也可以X:Y:Z探针配套使用。特别是对于丰度较低的基因，Y:Z组合的级联放大信号，能有效增加型号强度，提高检测灵敏度；另外由于本发明自封闭自组装特征，使其具备探针锁定特点，减少与背景基因结合情况，所以背景信号得到有效控制。

在本发明中，针对目前FISH探针检测灵敏度，背景值，特异性等方面，以及部分公司提供的FISH探针多条组合方式，相关组合合成寡核苷酸探针数量通常大约20及以上条，实验成本较高，且针对特殊基因（如microRNA短序列，circRNA区别母本基因序列等）无法检测或检测效果较差，而且尚未发现目前现有的FISH探针序列设计合成与应用上有采用封闭基团消除非特异性或背景荧光的方法策略。为此，本发明通过开发一种新型探针设计修饰标记方式，实现探针结合特异性提高，消除背景能力增强，且可以实现长，短等目标序列有效结合的，显示定位，且本发明的放大信号基团为自主装结构设计，对合成成本有极大的降低。本发明是可定位，信号强度高、特异性强、背景噪音低、便于操作的原位检测技术，实现对活细胞样品，固定组织样品，细胞爬片或涂片样品中的长、短基因进行区别检测的手段方法。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明靶向目的基因FISH荧光探针X；

图2是本发明双锁自主装放大系统FISH探针结合目标基因工作原理示意图；

图3是本发明双锁自主装FISH探针消除淬灭基团实现基因荧光报告示意图；

图4是本发明封闭型探针酶处理实验结果图；

图5是本发明封闭型探针酶处理亮度变化结果图；

图6是本发明放大系统试验20倍物镜观察结果图；

图7是本发明放大系统试验100倍油镜观察结果图；

图8是本发明放大系统酶处理试验荧光亮度值结果图；

图9是本发明封闭型探针酶处理实验荧光强度结果图；

图10是本发明封闭型探针酶处理后加放大系统荧光强度结果图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

在本发明中使用的主要实验仪器设备：

1）荧光显微镜或激光共聚焦显微镜及配套分析软件：所需荧光显微镜的配置包括：10×目镜，10×、40×物镜和100×油镜，显微镜激发光或滤光镜需要涵盖所测荧光波段，可以通过滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细使用与组合情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。配套分析软件可以使用本领域已知的基于计算机与生物信息的图像与数据采集及分析软件执行。评估判断的确定可以人工进行 ( 例如通过检视数据和手动比较识别标志 )、自动进行 ( 例如通过采用特别配置用来匹配光学可检测识别标志的数据分析软件 )， 或组合进行。

2）原位杂交仪：可以根据实验者的设置自动完成变性和杂交过程。可以自动调节温度控制和湿度条件。具备3种程序模式：变性、杂交、变性＋杂交，锁定温度（固定温度）变性温度范围：4ºC to 99ºC；变性时间：0-60 minutes；杂交温度范围:4ºC to 80ºC；杂交时间范围：0-99 hours；加热板温度范围：4ºC to 99ºC；玻片容量：4~24 张；运行时间范围：0-100 hours；可设置程序：4~40个；快速升温功能：1~2分钟内从 4 ºC升至99ºC；快速冷却功能：3~10分钟内从 99下降至 4ºC；温度精确性：±0.5℃。

实施案例一：针对 Homo U6序列设计与标记

1. 设计合成探针，针对内参基因U6（从NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得homo U6目标序列Gene ID: 26827）设计检测探针组合，探针合成由上海百力格生物技术有限公司合成，Homo U6 探针序号合成序列如下序列中的一种或几种，优选（U6-SEQ1，2，3），分别含有结合区和封闭区及颈环区，可以选择性的对序列中相关碱基进行修饰（如，2’F、2’MOE、LNA、2’-Ara-F、2’-O-benzyl、UNA、cEt等，改变序列结构、结合能力、抗酶解能力等不同修饰方式）；选择颈环结构可以是如下序列中的一种或多种序列5'ATTGATGTATTGTG3'（SEQ ID No.1）; 5'TCAAGAG3'（SEQ ID No.2）；5'TTGATATCCG3'（SEQ ID No.3）; 5'TTCAAGAGA3'（SEQ ID No.4）；5'CCACACC3'（SEQ ID No.5）等具有环状二级结构特征的核酸序列。核苷酸序列优选了Int Cy3 dT进行荧光修饰；核酸序列5’端本实验优选了5'CY5，核酸序列3’端优选了5'BHQ2修饰。在序列中引入RNase A切割位点xy代表为核糖核酸rCrA，rCrU，rCrC，rCrG一种组合或几种组合，具体序列参见表1。

表1

阴性对照探针中间加粗小写的序列即为核心阴性对照核心序列，以排除实验过程中非特异结合，用于试剂buffer，杂交问题等条件优化。通常阴性对照荧光效果较目的探针弱，且有明显差异，具体参见表2。

表2

。

如图1-3所述，根据图1设计针对目标基因的靶标序列X，如针对homo U6 基因设计的U6-SEQ1，其中包括红色标记的序列是直接靶向目的基因的，红色序列的两侧的蓝色序列是颈环序列，xy代表的两个RNA碱基用于RNA酶进行酶切，序列两端的黑色是封闭序列（即blocking序列，接上封闭荧光基团即可启动淬灭效应）。

根据图2显示，将靶标序列X互补结合目的基因（黑色序列代表），同时加入一级放大探针Y序列（含荧光标记），Y序列两侧的侧翼序列与X序列两侧的颈环序列互补结合，同时再加入二级放大探针Z序列（含荧光标记），Z序列中间的序列与Y序列中间序列进行碱基互补，同时Z序列两侧的侧翼序列与下一级Y序列两侧测序序列互补，实现自主装放大。

根据图3，将探针组合系统通过加入RNA酶进行切割链接封闭探针及封闭基团的2个RNA碱基（由xy代表），使得封闭序列和整体探针系统分离，释放封闭基团后实现荧光信号增强放大，在图3中使用了如下探针X、Y和Z序列，具体参见表3。

表3

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实施案例二：荧光显微镜验证荧光自封闭探针酶解效果

1. 实验步骤

1.1. 选择96孔板，分别设置试验组（分别A-E代表U6-SEQ1酶解前后荧光图，B-F代表U6-SEQ2酶解前后荧光图，C-G代表U6-SEQ3酶解前后荧光图）、细胞对照组（D-H代表正常培养空白细胞酶解前后荧光背景图）；

1.2. 探针和酶均用 2× SSC 缓冲液溶解，试验组1加入封闭探针0.5 μM 的U6-SEQ1和0.5mg/mL的RNA 酶共100 μL，试验组2加入U6-SEQ2和0.5mg/mL的RNA 酶共100 μL，试验组3加入U6-SEQ3和0.5mg/mL的RNA 酶共100 μL。对照组1加入100 μL 0.5 μM 的封闭探针U6-SEQ1，对照组2加入100 μL U6-SEQ2，对照组3加入100 μL U6-SEQ3，空白组1加入100 μL 2× SSC 缓冲液，空白组2加入2× SSC 缓冲液和0.5mg/mL RNA 酶共100μL上述各组均做三个重复；

1.3. 将96 孔板避光处理在37ºC 培养箱中孵育 20 min后于荧光显微镜下观察亮度变化。

2. 实验结果

实验结果如图4所述，利用imageJ软件分别识别各图亮度数值，并整理分析见下表4和图5，各探针酶处理后荧光亮度均出现了提升，且空白组无亮度变化，说明封闭型探针在酶处理后，如预期水解了RNA结构及其携带的淬灭基团，但是由于探针序列不同，封闭效果不一致，各组亮度提升不一致。

表4 封闭型探针酶处理试验荧光亮度值

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实施案例三：荧光显微镜验证荧光自封闭探针放大效果

1. 实验步骤

1.1. 实验分4组：实验组1，实验组2，对照组1，对照组2；按照 1×104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于12孔板（孔内提前放入已处理好的且大小合适的盖玻片）中于培养箱中培养过夜；

吸弃培养基，PBS 洗两次，每次 5 min；

吸弃 PBS，每孔加入 200 μL，4%多聚甲醛，室温固定 15 min

吸弃 4%多聚甲醛，每孔加入200 μL 0.1% Triton-100（现用现配）室温处理细胞15 min;

吸弃 0.1% Triton-100，PBS 洗两次，每次 5 min；

吸弃 PBS，每孔加入 200 μL 2× SSC，37ºC 培养箱放置 30 min；

杂交缓冲液提前在73ºC 水浴锅孵育 30 min，至澄清透亮，分别用杂交缓冲液将封闭探针组合U6-SEQ1、U6-SEQ2稀释到0.5 μM；

吸弃 2× SSC，实验组1每孔加入0.5 μM封闭型探针U6-SEQ1和0.5 μM放大系统X/Y共200 μL，实验组2每孔加入0.5 μM封闭型探针U6-SEQ2和0.5 μM放大系统X/Y共200 μL；对照组1每孔加入200 μL 0.5 μM封闭型探针U6-SEQ1，对照组2每孔加入200 μL 0.5 μM 封闭型探针U6-SEQ2；阴性对照加入200 μL杂交缓冲液；采取避光措施后置于 37ºC培养箱中杂交过夜；

杂交16 h 后，将样本从 37ºC 培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入 200 μL0.5mg/ml的RNA酶 37ºC 培养箱孵育 20 min；RNA酶用 2× SSC稀释；

吸弃RNA酶溶液，每孔加入 200 μL 42ºC 预热的0.1% Tween 20 洗涤 5 min；

吸弃 0.1% Tween 20，每孔加入200 μL 42ºC 预热的的 2× SSC洗涤 5 min；

吸弃 2× SSC，每孔加入 200 μL 42ºC 预热的 1× SSC 洗涤 5 min；

吸弃洗涤液，每孔加入 200 μL 稀释后的 DAPI 工作液，室温避光孵育15min;

吸弃 DAPI 工作液，PBS 洗涤 2 次，每次 5 min；

滴加抗淬灭剂于干净的载玻片，将细胞爬片的细胞面朝下盖在载玻片上于荧光显微镜下观察。

2. 实验结果

实验结果如图6和7所述，利用imageJ软件分别识别单纯探针组和加入放大系统的探针组酶处理后亮度数值变化，并整理分析见表5和图8。酶处理后，加入放大系统的探针组荧光亮度比单纯探针组亮度高，说明在酶处理后，放大系统结合到探针上，显著增强了荧光亮度，同时提示在设计不同序列的探针上表现不同。

表5 放大系统酶处理试验荧光亮度值

实施例四：多功能酶标仪验证封闭酶解荧光强度效果

1. 实验步骤

选择96孔黑色酶标板，分别设置实验组和阴性对照组，组内每种做6个重复（去掉最高值与最低值）；

实验组探针稀释体系：实验分为3组，第一组为阴性对照（只加杂交液无探针）；第二组为加封闭探针不加RNA A酶组（未酶解）；第三组为加封闭探针加RNA A酶组（酶解后），每组为6个平行孔，各孔分别加入探针稀释体系100 μL。封闭探针分组为：U6-SEQ1、U6-SEQ2和U6-SEQ3。第二组具体探针稀释体系：根据封闭探针分组，每组封闭探针可在1.5mL离心管中加入597ul杂交液，分别加各组封闭探针1:1至总体积3ul，即总体系中的封闭探针的浓度为0.5 μM；最终各组封闭探针分别至总体积为600ul。各孔分别加入100 μL 0.5 μM 的封闭探针U6-SEQ1、U6-SEQ2和U6-SEQ3，一组为6个平行孔。第三组具体探针稀释体系：根据封闭探针分组，每组封闭探针可在1.5mL离心管中加入594ul杂交液，加3ul初始浓度为100mg/ml的RNA A酶，即总体系中的RNA A酶的浓度为0.5ug/uL；分别加各组封闭探针1:1至总体积3ul，即各封闭探针组总体系中的封闭探针的浓度为0.5 μM；最终各组封闭探针分别至总体积为600ul。各孔分别加入100 μL含0.5ug/uL的RNA A酶和0.5 μM 的封闭探针组合的封闭探针U6-SEQ1、U6-SEQ2和U6-SEQ3，一组为6个平行孔。

将96 孔黑色酶标板在37ºC 培养箱中孵育 20 min后于酶标仪中进行荧光强度检测。

2. 实验数据统计与分析

利用酶标仪软件分别识别各图酶处理前后荧光强度数值变化，并整理分析见表6和图9，各探针组合酶处理后荧光亮度均出现了提升，且阴性对照组无亮度变化，说明封闭性探针在酶处理后，如预期水解了RNA结构及其携带的淬灭基团，但是由于探针序列不同及盐浓度影响，各组亮度提升不一致。

表6 封闭型探针酶处理试验荧光强度

实施例五：多功能酶标仪验证放大系统检测荧光强度效果

1.实验步骤：

1) 选择96孔黑色酶标板，分别设置实验组和阴性对照组，组内每种做6个重复（去掉最高值与最低值）；

2) 实验组探针稀释体系：实验分为3组，第一组为阴性对照（只加杂交液无探针）；第二组为加封闭探针加RNA A酶组（酶解后）；第三组为加封闭探针加RNA A酶组加SEQY+SEQZ（Y:Z=1:1）放大体系后，每组为6个平行孔，各孔分别加入探针稀释体系100 μL。封闭探针分组为：U6-SEQ1、U6-SEQ2和U6-SEQ3。第二组具体探针稀释体系：根据封闭探针分组，每组封闭探针可在1.5mL离心管中加入594ul杂交液，加3ul初始浓度为100mg/ml的RNA A酶，即总体系中的RNA A酶的浓度为0.5ug/uL；分别加各组封闭探针1:1至总体积3ul，即各封闭探针组总体系中的封闭探针的浓度为0.5 μM；最终各组封闭探针分别至总体积为600ul。各孔分别加入100 μL含0.5ug/uL的RNA A酶和0.5 μM 的封闭探针组合的封闭探针U6-SEQ1、U6-SEQ2和U6-SEQ3，一组为6个平行孔。第三组具体探针稀释体系：根据封闭探针分组，每组封闭探针可在1.5mL离心管中加入591ul杂交液，加3ul初始浓度为100mg/ml的RNA A酶，即总体系中的RNA A酶的浓度为0.5ug/uL；分别加各组封闭探针1:1至总体积3ul，即各封闭探针组总体系中的封闭探针的浓度为0.5 μM；然后分别加SEQY+SEQZ封闭系统1:1至总体积3ul（例如1.5ul SEQZ + 1.5ul SEQY），即放大体系中的封闭系统的浓度为0.5 μM；最终各组封闭探针放大系统分别至总体积为600ul。各孔分别加入100 μL含0.5ug/uL的RNA A酶和0.5 μM 的封闭探针及放大系统组合的封闭探针酶解放大系统U6-SEQ1+ SEQY+ SEQZ、U6-SEQ2+ SEQY+ SEQZ和U6-SEQ3+ SEQY+ SEQZ，一组为6个平行孔。

3)将96 孔黑色酶标板在37ºC 培养箱中孵育 16h后于酶标仪中进行荧光强度检测。

2.实验数据统计与分析

利用酶标仪软件分别识别各图酶处理前后荧光强度数值变化，并整理分析见下表7和图10，各探针组合酶处理后加入SEQY+ SEQZ放大系统后用酶标仪检测荧光强度均出现了提升，且阴性对照组无亮度变化，说明封闭性探针在酶处理后，放大系统结合到探针上，显著增强了荧光亮度，放大系统组荧光强度比单纯探针组酶解后高10倍左右，不过在不同序列探针的表现不同。

表7 封闭型探针酶处理加放大系统后检测荧光强度

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适用本发明检测样品：血液病、遗传疾病、实体肿瘤（包括骨髓活检）等相关组织或体液中所携带的细胞样品：如骨髓的染色体或间期细胞、外周血、羊水、绒毛、胎儿脐带血制备的染色体，尿液、体液（如胸水、腹水、唾液）等含有足够癌细胞或DNA的组织、细胞或体液标本。

本发明适用检测多种疾病或功能改变中基因变化类型包括但不限于如下情况：

1）DNA染色体上相关基因变化：例如基因重排、倒置、缺失、突变、断链、插入和易位等基因信息及位置改变，根据经临床验证与疾病或功能关系知识的条件下对染色体上相关DNA基因改变进行精细定位。在一些实施方案中，一组或多组探针与靶染色体的杂交可以提供多颜色模式，通过预期染色体上目标基因与标记的探针组结合， 杂交，洗脱，通过荧光显色或底物反应显色，对探针的结合并反馈的结果模式进行分析，表明相关染色体基因组上是否发生了基因重排、倒置、缺失、突变、断链、插入和易位等基因信息及位置改变。

2）各类型RNA表达与位置变化：针对例如miRNA、lncRNA、mRNA、circRNA、piRNA、snRNA、tRNA等各类型RNA或有外源导入细胞内的各种RNA或DNA靶标序列。根据经临床验证与疾病或功能关系知识的条件下对内源表达或外源导入的RNA基因改变进行精细定位或定量分析。在一些实施方案中，一组或多组探针与靶染色体的杂交可以提供多颜色模式，通过预期RNA上目标基因与标记的探针组结合， 杂交，洗脱，通过荧光显色或底物反应显色，对探针结合的目标RNA反馈的结果模式进行分析，

3）本发明可以用于多种临床或非临床诊断以及生物学基因检测、基因功能研究与分析等研究目的，特别地， 上述方法可用于诊断或研究各种类型的遗传异常、 癌症和其它哺乳动物疾病， 包括但不限于，肿瘤与癌症：如前列腺癌 、肺癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌、口腔癌、食道癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌、白血病 、淋巴瘤、胰腺癌胆管癌，胶质瘤、皮肤癌等；帕金森氏病 ； 阿尔茨海默氏病 ；癫痫；肌萎缩侧索硬化 ；多发性硬化 ；卒中；自闭症 ；猫叫综合征；Patau 综合征； 1p36 缺失综合征；爱德华氏综合征； Angelman 综合征；Klinefelter 综合征；Prader-Willi 综合征；特纳综合征；唐氏综合征；腭心面综合征等疾病。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。