一种基因插入促进大豆根瘤菌与大豆共生结瘤的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基因插入促进大豆根瘤菌与大豆共生结瘤的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

大豆的种植中水肥的合理管理对大豆的增产有重要作用，因此每年要消耗包括氮肥在内的化肥，化肥的大量使用不仅提升了大豆的种植成本，降低了农民的种植积极性，而且会造成土壤板结，肥力下降等问题。合理使用化肥，通过生物法增加肥效越来越受到重视，其中大豆根瘤菌剂的使用就是一类很好地实践。

大豆根瘤菌是一种活的微生物制剂根瘤内的根瘤菌与豆科植物互利共生：豆科植物通过光合作用制造的有机物，一部分供给根瘤菌；根瘤菌通过生物固氮制造的氨，则供给豆科植物。促进大豆增产的大豆慢生根瘤菌已经推广应用，然而大豆根瘤菌菌剂仍存在结瘤率低、固氮效率低等问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基因插入促进大豆根瘤菌与大豆共生结瘤的方法。本发明通过将来源于弗氏中华根瘤菌FG-486的nod基因插入大豆慢生根瘤菌DG-688基因组，获得改造工程菌株，提高大豆慢生根瘤菌与大豆共生后的的结瘤能力、固氮能力。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

第一方面，本发明提供了一种基因插入促进大豆根瘤菌与大豆共生结瘤的方法，包括：

将弗氏中华根瘤菌FG-486的nod基因插入到大豆慢生根瘤菌DG-688中，即得；

所述大豆慢生根瘤菌DG-688的保藏号为CCTCC NO：M20231152，所述弗氏中华根瘤菌FG-486的保藏号为CCTCC NO：M20231153，所述弗氏中华根瘤nod基因的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。

优选的，将弗氏中华根瘤菌FG-486的nod基因插入到大豆慢生根瘤菌DG-688中的具体步骤包括：

扩增弗氏中华根瘤nod序列片段、大豆慢生根瘤菌nod基因上游序列nod-U片段及nod基因下游序列nod-D片段；

以nod片段、nod-U片段和nod-D片段作为模板扩增nod融合片段nod-UD；

将nod-UD片段与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-nod-UD；

将重组质粒pk18-nod-UD导入大肠杆菌S17-1(λ)，与大豆慢生根瘤菌DG-688进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆。

进一步优选的，所述nod融合片段nod-UD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步优选的，扩增nod-U片段的引物F1和R1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO.4所示。

进一步优选的，扩增nod片段的引物F2和R2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO.6所示。

进一步优选的，扩增nod-D片段的引物F3和R3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO.8所示。

进一步优选的，扩增nod融合片段nod-UD时，nod片段、nod-U片段和nod-D片段的比例为1:1:1，扩增引物F1和R3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO.8所示。

第二方面，本发明提供了一种基因插入的大豆根瘤菌DG-688nod:FGnod，通过将弗氏中华根瘤菌FG-486的nod基因插入到大豆慢生根瘤菌DG-688获得；

所述大豆慢生根瘤菌DG-688的保藏号为CCTCC NO：M20231152，所述弗氏中华根瘤菌FG-486的保藏号为CCTCC NO：M20231153，所述nod基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

第三方面，本发明提供了一种菌剂，包括如第二方面所述的大豆根瘤菌DG-688nod:FGnod。

优选的，所述菌剂中还包括所必需的辅料。

优选的，所述菌剂的剂型为液体剂、粉剂、颗粒剂或片剂。

第四方面，本发明提供了一种提高大豆产量的方法，包括以下步骤：

将如第二方面所述的大豆根瘤菌DG-688nod:FGnod或如第三方面所述的菌剂与大豆拌种，并将大豆种植。

上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

经过测量两种根瘤菌拌种后的大豆，发现相对已野生株DG-688拌种后的大豆，DG-688nod:FGnod拌种后，大豆的植株平均结瘤数上升27.15％，根瘤干重基本不变，大豆产量提升6.55％。

保藏信息

大豆慢生根瘤菌DG-688（Bradyrhizobium japonicum DG-688）已于2023年06月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 20231152，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

弗氏中华根瘤菌FG-486（Sinorhizobium fredii FG-486）已于2023年06月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 20231153，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为突变质粒pK18-nod-UD构建电泳图，其中(A)为nod上下游同源臂及nod基因扩增：1为nod上游同源臂nod-U扩增，2为nod下游同源臂nod-D扩增，3为DNALadder DL5000，4为nod基因扩增；(B)为nod-UD融合片段扩增：1为nod-UD融合片段，2为nod-UD融合片段，3为DNALadder DL5000；

图2为nod基因插入株株PCR验证，其中外部引物检测：1为空白对照，2为野生株基因组为模板扩增片段，3为DNALadder DL5000，4为nod基因插入株为模板扩增片段；内部引物检测：1为nod插入株DG-688nod:FGnod为模板扩增片段，2为野生株DG-688基因组为模板扩增片段，3为DNA Ladder DL5000，4为空白对照；

图3为野生株DG688及工程株DG-688nod:FGnod拌种后大豆每株结瘤数；

图4为野生株DG688及工程株DG-688nod:FGnod拌种后大豆每个根瘤平均干重；

图5为野生株DG688及工程株DG-688nod:FGnod拌种后大豆产量。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

将大豆慢生根瘤菌DG-688、弗氏中华根瘤菌FG-486分别接种进YMB(A

在已经测序的弗氏中华根瘤菌FG-486基因组数据中搜索nod基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)及其基因上下游序列，利用弗氏中华根瘤菌FG-486基因组为模板，以F2(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)/R2(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)作为引物扩增nod序列片段。

以F1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)/R1(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，F3(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)/R3(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)为引物，以大豆慢生根瘤菌DG-688基因组为模板分别扩增nod上游同源臂nod-U及nod下游同源臂nod-D片段。

将扩增获得的nod、nod-U、nod-D片段按照1:1:1的比例放入PCR体系，作为模板，以F1/R3作为引物扩增nod融合片段nod-UD(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。将融合片段nod-UD通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-nod-UD。如图1所示，nod融合片段nod-UD被成功扩增，重组质粒pk18-nod-UD被成功构建

将重组质粒pk18-nod-UD通过热击转化的方式导入大肠杆菌S17-1(λ)。将大肠杆菌S17-1(λ)与大豆慢生根瘤菌DG-688进行双亲杂交培养，将重组质粒pk18-nod-UD导入大豆慢生根瘤菌DG-688。通过蔗糖平板筛选、影印筛选获得基因突变株。通过PCR验证的方法验证DG-688nod基因插入株DG-688nod:FGnod。如图2所示，DG-688nod:FGnod中成功插入nod基因。

将DG-688及DG-688nod:FGnod拌种大豆品种-菏豆33，并将大豆种植。大豆种植期间进行合理的水肥管理，在大豆种植70-80天时随机采集大豆根系，测量每株大豆的根系结瘤数，发现工程菌株DG-688nod:FGnod相对野生株DG-688结瘤数提高数上升27.15％(如图3所示)，根瘤干重基本不变(如图4所示)。在大豆种植100-110天间收取大豆，并测量换算产量，发现工程菌株DG-688nod:FGnod相对野生株DG-688拌种的大豆产量提升6.55％(如图5所示)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。