一种制剂中酒石酸泰万菌素含量的鉴定方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种制剂中酒石酸泰万菌素含量的鉴定方法。

背景技术

酒石酸泰万菌素(C

含酒石酸泰万菌素的制剂出厂前需要对其酒石酸泰万菌素含量进行进一步鉴定。现有抗生物微生物检定法操作步骤复杂，实验过程中不确定因素较多，包括试验设计、稀释步骤、菌悬液浓度，样品加样量等，该方法操作步骤繁杂、影响因素较多，准确度和重复性与高效液相色谱法(HPLC)等化学方法相比较差，近些年有逐渐被HPLC等其他方法替代的趋势。但对由生物发酵制得的多组分抗生素，因其组分比较复杂，生物活性成分的比例不稳定，各组分的抗菌效力不同等因素，无法由理化方法替代。

因此，提供一种能够提高实验的准确度、减少实验误差、重复性好、检测结果准确率高、稳定性好、可快速准确的鉴定制剂中酒石酸泰万菌素标示量的方法是至关重要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种制剂中酒石酸泰万菌素含量的鉴定方法。本发明通过对菌苔生理盐水洗脱量、带菌培养基菌液添加量、标准品溶液与供试品溶液的加样量进行改进，能够得到清晰地抑菌圈，可使标准品溶液高浓度所致的抑菌圈直径稳定在18～22mm之间；本发明所得的实验结果有效，能准确地检测出酒石酸泰万菌素制剂的含量。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种制剂中酒石酸泰万菌素含量的鉴定方法，包括以下步骤：

(S1)分别制备高剂量制剂溶液、低剂量制剂溶液、高剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液和低剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液；

(S2)将传代后的藤黄微球菌的经生理盐水洗脱，得到菌悬液；然后将菌悬液加入培养基中，得到含菌培养基；

(S3)在平底双碟中由底层至顶层依次铺设纯培养基层、步骤(S2)制备得到的含菌培养基层，然后在含菌培养基层上方设置分别容纳步骤(S1)得到的高剂量制剂溶液、低剂量制剂溶液、高剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液和低剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液的牛津杯，后处理后培养；

(S4)步骤(S3)结束后，根据得到的抑菌圈大小鉴定制剂溶液中酒石酸泰万菌素的标定值是否准确。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S1)中，高剂量制剂溶液与高剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液的酒石酸泰万菌素的剂量相同；

低剂量制剂溶液与低剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液的酒石酸泰万菌素的剂量相同。

在本发明的一个实施方式中，高剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液中酒石酸泰万菌素的剂量为低剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液中酒石酸泰万菌素的剂量的2倍。

在本发明的一个实施方式中，高剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液中酒石酸泰万菌素的剂量为5IU/mL～10IU/mL。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S2)中，传代后的藤黄微球菌为传代至2代的藤黄微球菌。

在本发明的一个实施方式中，生理盐水洗脱量为3mL～5mL。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S2)中，所述培养基为抗生素检定培养基Ⅱ号；

菌悬液与培养基的体积比为1.2～3：100。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S3)中，牛津杯等距设置。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S3)中，牛津杯中加样量为250μL～270μL。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S3)中，培养过程中，温度为35℃～37℃，时间为16h～18h。

在本发明的一个实施方式中，步骤(S4)中，当高剂量制剂溶液的抑菌圈直径与高剂量酒石酸泰万菌素标准品溶液的抑菌圈直径的可信限率低于5％时，判定制剂中酒石酸泰万菌素的标示量准确；

否则，判定制剂中酒石酸泰万菌素的标示量不准确。

本发明通过对菌苔生理盐水洗脱量的控制，得到浓度相对稳定的菌悬液。带菌培养基中菌悬液添加量在0.3毫升以上就可以有清晰的抑菌圈，但抑菌圈不在实验所规定的18～22mm范围内；通过实验进一步发现，带菌培养基中菌悬液加入量在1.2～3mL，且牛津杯内加样量在250μL～270μL时，可使抑菌圈直径稳定在18～22mm之间。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过确定菌苔生理盐水的洗脱量为3～5mL，将菌悬液浓度控制在一定范围内，保证由此浓度范围内的菌悬液配制成的带菌培养基在平板上能成片生长，避免单菌落的形成；

(2)本发明通过确定带菌培养基中菌悬液添加量为1.2～3mL，保证实验能得到清晰地抑菌圈，减少抑菌圈直径测量所带来的误差；

(3)本发明通过将标准品溶液与供试品溶液滴装量由牛津杯容积定量改为用微量移液器定量，加样量均低于牛津杯的上沿，使每个牛津杯内溶液的张力一致，可得到标准品溶液高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm范围内最佳。

(4)本发明将制作完成的双碟置于水平台上静置半小时，使样品溶液能够更均匀的分散，确保形成的抑菌圈为规则圆。

(5)本发明的一种制剂中酒石酸泰万菌素含量的鉴定方法改进试验中的不确定因素，提高实验的准确度，减少实验误差，重复性好，检测结果准确率高，稳定性好，可快速准确的鉴定酒石酸泰万菌素的含量，为相关兽药制剂的质量把控及高效利用提供理论依据。

附图说明

图1为鉴定酒石酸泰万菌素含量的过程中牛津杯位置设置示意图；

图中标号：SH、高剂量标准品溶液；TH、高剂量制剂溶液；TL、低剂量制剂溶液；SL、低剂量标准品溶液。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂，所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。

下述实施例中，磷酸盐缓冲液(pH8.0)、培养基(pH7.8～8.0)、标准品储备液以及待测供试品储备液的制备如下：

磷酸盐缓冲液(pH8.0)的制备：取磷酸氢二钾9.8g、磷酸二氢钾0.2g加水至1000mL容量瓶定容，过滤，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用；

培养基(pH7.8～8.0)的制备：取抗生素检定培养基Ⅱ号(pH7.8～8.0)8.25g制成300mL培养基，并分装成100mL的培养基，置于115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至50℃～55℃备用。

标准品储备液的制备：精密称取酒石酸泰万菌素标准品(822IU/mg，批号K0691908)30.41mg置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇溶液制成1000IU/mg的储备液，4℃保存备用。

制剂储备液的制备：精密称取制剂1000mg置于50mL容量瓶中，加入70％甲醇溶液制成1000IU/mg的制剂储备液，4℃保存备用。

实施例及对比例

一种制剂中酒石酸泰万菌素含量的鉴定方法，包括以下步骤：

(S1)标准溶液的制备：利用磷酸缓冲液稀释(容量瓶定容稀释)酒石酸泰万菌素标准品储备液至浓度为5IU/mL，得到低剂量标准品溶液；以及10IU/mL，得到高剂量标准品溶液；

(S2)制剂溶液(依照制剂中酒石酸泰万菌素标示量进行配置)的制备：利用磷酸缓冲液稀释(容量瓶定容稀释)待测制剂储备液至浓度为5IU/mL，得到低剂量制剂溶液；以及10IU/mL，得到高剂量制剂溶液；

(S3)菌悬液的制备：将藤黄微球菌(CMC28001)接种于营养琼脂斜面上，26℃培养24h，传代至2代，取出；然后生理盐水将菌苔洗下，置于4℃冰箱备用(储存时间不超过7天)；

(S4)带菌培养基的制备：在50～55℃培养基中加入步骤(S3)制备得到的菌悬液，摇匀备用。

(S5)双碟的制备与培养：取平底双碟8个，分别加入培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层；再加入5mL步骤(S4)制备得到的带菌培养基，摊布均匀，作为菌层。冷却后在每一双碟中等距离安置牛津杯4个，放置8min，双碟中对角的2个牛津杯分别滴装高剂量标准品溶液及低剂量标准品溶液，其余2个牛津杯分别滴装高剂量制剂溶液及低剂量制剂溶液。静置半小时后用陶瓦盖覆盖，在37℃恒温培养箱中培养16小时。

(S6)标准品和供试品加样顺序依次为高剂量标准品溶液SH、高剂量制剂溶液TH、低剂量制剂溶液TL、高剂量标准品溶液SL(如图1所示)。

(S7)使用先驱威锋ZY～300I多功能微生物自动测量仪(二剂量法)处理实验结果，计算得出酒石酸泰万菌素的含量(如表2所示)。

其中，生理盐水洗脱量、菌悬液加入量、牛津杯内样品加样量按照表1实行：

表1生理盐水洗脱量、菌悬液加入量、牛津杯内样品加样量汇总表

抑菌圈情况如表2所示：

表2实施例1～7得到的抑菌圈情况汇总表

《中国兽药典》抗生素微生物检定法：检测结果经计算所得的效价，含酒石酸泰万菌素(C

准确度试验(回收率试验)：

精密称取酒石酸泰万菌素标准品适量，按规格加入辅料，制成浓度相当于标示量80％、100％、120％的供试品溶液。根据上述实施例的方法进行鉴定，计算回收率(如表3所示)。

表3加样回收率结果

通过表3可以发现，标示量为80％、100％、120％的样品回收率在98％～101％范围内，平均回收率为99.68％，RSD为0.86％，结果符合2020版《中国兽药典》附录9101兽药质量标准分析方法鉴定指导原则，表明本方法准确度较好。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的解释，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。