一种β-橄榄烯合成酶、基因及其应用

技术领域

本发明属于天然产物生物技术领域，具体涉及β-橄榄烯合成酶基因、构建体及其应用。

背景技术

萜类化合物是一类由异戊二烯结构单元单个或多个聚合构成的庞大天然产物家族，某些萜类具有较好的生理活性，具有十分重要的应用价值。研究和挖掘萜类化合物新的合成酶基因资源对萜类化合物的生物技术合成具有重要的意义。

β-橄榄烯(β-maaliene)属于倍半萜烯类化合物，存在多种植物如黄花蒿、艾草、人参、甘松等的挥发油中，赋予了这类植物独特的风味、香味、药用生理活性等。β-橄榄烯也可用于香精香料行业的原料开发及高级香精香料的调配中，具有重要的经济价值。β-橄榄烯目前主要在植物挥发油中混合存在，由于含量较低精馏获得难度和成本较大，利用生物技术合成β-橄榄烯的研究较少，挖掘β-橄榄烯的新合成酶对其生物合成具有重要研究意义，有进一步开发的价值。

橡胶树中经过功能确证的β-橄榄烯合成酶基因还未见文献报道，通过基因挖掘与功能表征，鉴定橡胶树β-橄榄烯(β-maaliene)合成酶，对拓宽橡胶树除天然橡胶合成外的其他小分子化合物的研究与应用具有重要的价值。

本发明首次从橡胶树中克隆得到β-橄榄烯合成酶基因，可以用于高效合成β-橄榄烯，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对橡胶树中β-橄榄烯合成的基因的空白，为β-橄榄烯的生物技术合成提供了基因元件。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，本发明首先提供了一种酶，是如下a)或b)的酶：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的酶；

b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有橡胶树β-橄榄烯合成酶活性的蛋白质。

其次，本发明还提供了与所述橡胶树β-橄榄烯合成酶相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码橡胶树β-橄榄烯合成酶的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

任选地，所述载体包括pESC酵母表达载体以及转基因植物表达载体；

任选地，所述重组微生物包括工程菌或植物细胞。

本发明提供的重组载体和工程菌可以直接进行培养、扩增和表达得到橡胶树β-橄榄烯合成酶，得到的大量活性橡胶树β-橄榄烯合成酶可以用于生产β-橄榄烯。

优选地，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子：

1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；

2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述酶的cDNA分子或基因组DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述酶的cDNA分子或基因组DNA分子。

其次，本发明还提供了橡胶树β-橄榄烯合成酶在制备β-橄榄烯中的应用。

本发明还提供了上述生物材料在制备橡胶树β-橄榄烯合成酶或构建转基因植物或生产β-橄榄烯中的应用。

另外，本发明还提供了扩增编码橡胶树β-橄榄烯合成酶的核酸分子片段的引物对；

优选地，所述扩增引物对为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物为SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种β-橄榄烯的生产方法，利用上述的橡胶树β-橄榄烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到β-橄榄烯。

本发明还提供了橡胶树β-橄榄烯合成酶或上述生物材料在香精香料的原料开发或高级香精香料的调配中的应用。

最后，本发明还提供了一种用于香精香料的开发或调配的生物合成产品，所述产品包括橡胶树β-橄榄烯合成酶或上述的生物材料。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

(1)本发明首次发现了橡胶树来源的能够高效合成β-橄榄烯的合成酶基因，该基因能够主要合成β-橄榄烯，可作为潜在的芳香化合物应用于香精香料行业。

(2)本发明通过将合成β-橄榄烯的橡胶树β-橄榄烯合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功构建的β-橄榄烯生产菌株，摇瓶产量高达10mg/L，为目前报道的摇瓶最高产量，为β-橄榄烯的工业化应用奠定了重要的基础。

附图说明

图1是本发明构建的工程菌株SRBT5发酵产物的GC-MS检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

DNA聚合酶、限制性内切酶和质粒提取试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA胶回收试剂盒和同源重组试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司；pTOPO-Blunt Simple载体购自北京艾德莱生物科技有限公司，酵母表达质粒pESC购自Novagen公司；特异基因引物对P1/P2由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

β-橄榄烯的检测方法：采用Thermo TRACE GC Ultra系统和TSQ 9000系统进行GC-MS检测。GC检测程序设定如下：初始烘箱温度为50℃，持续1分钟；然后以15℃/分钟的速度升至280℃，保持1分钟；接着以20℃/分钟的速度升至300℃，保持2分钟。挥发性等样品在240℃注入，MS转移温度保持在270℃。化合物通过NIST(National Institute ofStandards and Technology)数据库和保留指数的比较确定。

YPD培养基：培养基组分含有2％葡萄糖(国药公司)，2％胰蛋白胨(安琪酵母)，1％酵母抽提物(安琪酵母)；

酵母菌株YZL141，其构建方法记载在Shi Bin et al.,“Systematic MetabolicEngineering of Saccharomyces cerevisiae for Lycopene Overproduction.”Journalof agricultural and food chemistry vol.67,40(2019):11148-11157.doi:10.1021/acs.jafc.9b04519。

酵母菌株JCR27，其构建方法记载在Siemon,Thomas et al.“Semisynthesis ofPlant-Derived Englerin A Enabled by Microbe Engineering of Guaia-6,10(14)-diene as Building Block.”Journal of the American Chemical Society vol.142,6(2020):2760-2765.doi:10.1021/jacs.9b12940。

橡胶树cDNA：从橡胶树胶乳中提取的RNA，再反转录成cDNA，该过程通常按照常规条件如《分子克隆实验指南(第四版)》(中文版)由科学出版社出版中所说的条件，或按照制造产商所建议的条件，其为本领域技术人员熟知的实验操作，本发明对此并无限定。

橡胶树β-橄榄烯合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的橡胶树β-橄榄烯合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

橡胶树β-橄榄烯合成酶在生产β-橄榄烯中的应用。本发明中橡胶树β-橄榄烯合成酶可以以法尼基焦磷酸为底物，催化合成β-橄榄烯，可应用于香精香料行业。

本发明提供的一种β-橄榄烯的生产方法，可利用本发明的橡胶树β-橄榄烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到β-橄榄烯。

本发明还提供含有橡胶树β-橄榄烯合成酶基因的重组载体，将橡胶树β-橄榄烯合成酶基因重组于表达载体中，构建生物合成模块，可以实现橡胶树β-橄榄烯合成酶基因的简便快速利用，快速大量得到目标基因或目标蛋白。在本发明中，表达载体优选为pESC酵母表达载体。

本发明还提供含有橡胶树β-橄榄烯合成酶基因的工程菌，工程菌包括橡胶树β-橄榄烯合成酶基因和宿主细胞，橡胶树β-橄榄烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将橡胶树β-橄榄烯合成酶基因导入宿主细胞中，可以快速大量得到目标基因和目标蛋白酶，工程菌构成的生物合成模块避免了目标基因使用时需要从橡胶树基因组中PCR扩增的繁琐操作。宿主细胞优选为酵母YZL141菌株或者酵母JCR27菌株。

本发明还提供导入有上述的橡胶树β-橄榄烯合成酶基因的植物细胞或转基因植物，橡胶树β-橄榄烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。如本领域技术人员熟知的技术方法，通过将该橡胶树基因构建植物表达载体，通过农杆菌、原生质体以及基因枪等方法导入到植物细胞和愈伤组织中再生转基因植物合成和生产β-橄榄烯。

实施例1

(1)基因克隆

本申请人对橡胶树的基因组进行了分析，发现了一个橡胶树倍半萜β-橄榄烯合成酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

橡胶树胶乳样品采集于海南省中国热带农业科学院试验场常规割胶的热研7-33-97无性系。利用天根生化科技(北京)有限公司的总RNA提取试剂盒进行提取，随后利用Fermentas cDNA第一链反转录试剂盒合成cDNA。使用引物对P1-P2(见表1)利用RT-PCR从胶乳cDNA模板中进行基因克隆。所用PCR反应体系为(30μL)：水12.5μL，2x PrimerSTAR MaxPermix 10μL，正反向引物(10μM)各1μL，cDNA模板0.5μL。PCR反应体系为：95℃3min,98℃10s，58℃20s，72℃2min，35个循环，72℃10min，16℃保持。然后利用南京诺维赞生物科技有限公司胶回收试剂盒回收DNA片段，连接pTOPO-Blunt Simple载体上，转化DH5α大肠杆菌感受态中进行氨苄青霉素抗性筛选，经菌液PCR验证后送测序公司测序确证，待测序确证后获得目的基因。

表1

(2)重组表达载体构建

测序无误的目的基因载体重新PCR克隆与胶回收后采用南京诺维赞生物科技有限公司同源重组试剂盒与酵母线性化表达载体进行连接(37℃，30min)，转化DH5α大肠杆菌感受态中进行筛选，经菌液PCR验证后即获得含有正确目的基因的酵母表达载体，命名为pHbT1。

(3)工程菌株构建与功能表征

①酵母感受态制备

将酵母YZL141菌株和JCR27菌株过夜培养后转接于50mL新鲜YPD培养基中，30℃培养至OD600约0.6左右，500g离心5min后悬浮于TE/LiAC溶液中，高速离心5min收集菌体重悬于1mL TE/LiAC溶液中即制得感受态。

②酵母感受态转化

将上述表达载体pHbT1通过PEG-LiAc转化方法转入YZL141和JCR27酵母感受态中，放置于30℃静置30min,42℃热激10min，离心5min后涂布于SD-URA筛选平板上，30℃静置培养3d，然后分别利用引物对P1-P2、P3-P4进行菌落PCR验证，将转化YZL141的阳性菌命名为SRBT5。将转化JCR27的阳性菌命名为JSRBT5。

③功能表征

将低温保存的SRBT5菌株接种于50mL SD-URA缺陷培养基中(添加1％半乳糖)，30℃培养3d，4000rpm离心5min收集菌体，萃取后转移至样品瓶中进行GC-MS检测。SRBT5菌株的检测结果如图1所示，主产物经NIST数据库比对鉴定为β-橄榄烯(β-maaliene)，副产物为α-古芸烯(α-gurjunene)，将该SRBT5菌株含有的橡胶树来源的编码基因命名为HbΜaS。

④发酵评价

待确定基因功能后，采用类似的方法将含主产物较高的对应菌株JSRBT5接种于50mLYPD培养基中，加入1％半乳糖，0.5％-1％IPM，30℃培养3d后，4000rpm离心8min收集有机相，制备检测样品进行GC-MS检测定量。JSRBT5的摇瓶产量为10mg/L。

实施例2

为了评价β-橄榄烯作为香料和调味剂的潜在价值，由品香师分析了该分子的香味，β-橄榄烯具有辛香、温和、呼吸道舒适性的香气。当β-橄榄烯被加热时，伴随着增强的气味产生白烟，这表明它有潜力用作香料调配的成分，以及应用于电子香烟等产品。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。