一种使用流式细胞仪分选植物组织细胞核的方法

技术领域

本发明属于单细胞分选技术领域，具体涉及一种使用流式细胞仪分选植物组织细胞核的方法。

背景技术

随着单细胞测序技术的突破和发展，该项技术已广泛应用于人和动物的各类组织测序。受限于技术——微流控管道只允许40μm以下颗粒通过——而原生质体大多超过这个范围，同时原生质体的制备也面临相对的困难。因此，植物单细胞测序还是一片蓝海。

为了解决以上问题，大量研究者在原生质体制备以外，开始着手于植物细胞核制备。植物组织裂解可以相对容易的得到分散的细胞核，但随之而来的是大量细胞壁、细胞器、细胞碎片等杂质的干扰，使得植物细胞核制备也难以得到满足单细胞测序要求的细胞核悬液。而目前有的通用植物细胞核制备方法都难以根本解决以上问题。

发明内容

针对目前所存在的技术问题，本发明提供了一种使用流式细胞仪分选植物组织细胞核的方法，该方法可适用于通用的植物细胞核制备，使用流式细胞仪在大量碎片杂质中分离、纯化完好的植物细胞核。

为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：

一种使用流式细胞仪分选植物组织细胞核的方法，包括如下步骤：

S1、将植物组织冰冻研磨成粉末状，裂解释放细胞核；此处，裂解释放细胞核的方法不限于裂解液裂解，任何可以获得植物细胞核的方法均可；

S2、向裂解后的植物组织悬液中加入PI染料溶液，混匀后避光孵育4-6min，孵育结束后过细胞筛得到上样悬液；由于488nm激光照射绿体时，叶绿体的发射光谱集中在大于637nm的波段，峰值在681nm处。因此，采用PI染料，其发射光峰值在610nm左右，和叶绿体有很好的区分，当分离带有叶绿体的植物组织的单细胞核时，通过这一特性可以很好地排除叶绿体的干扰；

S3、调节流式细胞仪的参数：FSC通道电压50-150，SSC通道电压250-350，PerCP-CY5.5通道电压400-600，PE-Taxes Red通道电压400-600；鞘液气压20；优选地，FSC通道电压120，SSC通道电压290，PerCP-CY5.5通道电压500，PE-Taxes Red通道电压500；鞘液气压20；然后将上样悬液上样到流式细胞仪的样本管中，调节好流速；

S4、在FSC和SSC通道下，通过FSC-SSC散点图选择FCS-A在40-200之间的区域建立分选门；

S5、在PerCP-CY5.5通道下以S4中建立的分选门为模板建立PerCP-CY5.5-SSC散点图，选择阴性细胞群区域建立分选门；

S6、在PE-Taxes Red通道下选择强信号建立分选门，对分选门选中区域进行分选，收集管中得到的即为细胞核。

进一步地，步骤S2中，细胞筛为35-45μm细胞筛。

进一步地，步骤S2中，PI染料溶液的浓度为1mg/mL。

进一步地，步骤S3中，流式细胞仪的喷嘴直径为85-100μm。

进一步地，步骤S3中，流式细胞仪流速调节范围1-11。

更进一步地，还包括镜检步骤：取收集管中的细胞核溶液，染色后显微镜下观察细胞核形态。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种使用流式细胞仪分选植物组织细胞核的方法，可适用于通用的植物细胞核制备，使用该流式细胞仪法可大量碎片杂质中分离、纯化出完好的植物细胞核，该方法简单高效，一般情况下，几分钟内即可获得大量的细胞核。同时，该方法精准度高，对前期样本制备的要求较低，在难以制备大量完好且高纯度的单细胞核的前提下，仍能分离出完好的细胞核。获得的纯净的植物细胞核悬液可用于单细胞测序及其他类型的研究。

附图说明

图1示出细胞核悬液的FSC-SSC散点图；

图2示出细胞核悬液的PerCP-CY5.5-SSC散点图；

图3示出细胞核悬液的PE-Taxes Red-SSC散点图；

图4示出烟草叶细胞核分选前后的镜检图；

图5示出棉花茎细胞核分选前后的镜检图；

图6示出烟草叶细胞核经70μm喷嘴分选后的镜检图。

其中，图4和图5中，A为分选前，B为分选后。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1

(1)将1×10

(2)流式细胞仪使用100μm孔径的喷嘴，鞘液气压设置为20，涉及使用的流式4通道的电压设置如下：

流式细胞仪参数设置好后，将(1)中得到的样本向样本管中上样分选，流速1。

(3)在FSC和SSC通道下，根据悬液中颗粒的信号位置，通过FSC-SSC散点图选择FCS-A在40-200之间的区域，画P1门，如图1所示，大致选定细胞核所在区域，小于40的区域一般为碎片，因此画门优先选择FSC-A大于40的区域。

(4)在PerCP-CY5.5通道下，以前面步骤中建立的分选门为模板建立PerCP-CY5.5-SSC散点图，选择阴性细胞群区域建立分选门，如图2所示，此时PerCP-CY5.5-SSC散点图的作用是排除叶绿体，在有叶绿体的情况下，叶绿体在PerCP-CY5.5通道下会被检测到很强的信号，可清晰地分出阴阳性群，阴性细胞群含细胞核。

(5)在PE-Taxes Red通道下，选择强信号建立分选门，如图3所示，对分选门选中区域进行分选，收集管中得到的即为细胞核。此通道下，弱信号的部分为碎片、杂质；强信号的部分则为完整的细胞核。细胞核在散点图中表现为聚群，排除均匀零散分布的信号，选择聚集的区域进行分选，即可获得完好的细胞核。

(6)收集分选后细胞核悬液，取9μL细胞核悬液滴加1μL 0.4％的台盼蓝染色，显微镜下观察细胞核形态。

实施例2

(1)将烟草叶冰冻研磨成粉末状，使用裂解液在冰上裂解3min，裂解液包括下列组分：MES-KOH 25mM，氯化钠50mM，氯化钾100mM，氯化镁10mM，EDTA 4mM，Spermidine 0.4mM，Spermine 0.25mM，DTT 0.5mM，采用无核酸酶水配制。

(2)烟草叶组织裂解后取500μL裂解后溶液，加入PI溶液，PI终浓度为1mg/mL，混匀后避光孵育5分钟，孵育结束后过40μm细胞筛后得到上样悬液，取上样悬液显微镜下观察烟草叶细胞形态，如图4A所示。

(3)采用与实施例1相同的方法进行流式细胞仪上样分选，得到烟草叶细胞核悬液。

(4)收集分选后烟草叶细胞核悬液，取9μL细胞核悬液滴加1μL 0.4％的台盼蓝染色，显微镜下观察烟草叶细胞核形态，如图4B所示。

实施例3

(1)将棉花茎冰冻研磨成粉末状，使用裂解液在冰上裂解3min，裂解液包括下列组分：MES-KOH 25mM，氯化钠50mM，氯化钾100mM，氯化镁10mM，EDTA 4mM，Spermidine 0.4mM，Spermine 0.25mM，DTT 0.5mM，采用无核酸酶水配制。

(2)棉花茎组织裂解后取500μL裂解后溶液，加入PI溶液，PI终浓度为1mg/mL，混匀后避光孵育5分钟，孵育结束后过40μm细胞筛后得到上样悬液，取上样悬液显微镜下观察棉花茎细胞形态如图5A所示。

(3)采用与实施例1相同的方法进行流式细胞仪上样分选，得到棉花茎细胞核悬液。

(4)收集分选后棉花茎细胞核悬浮液，取9μL悬液滴加1μL 0.4％的台盼蓝染色，显微镜下观察棉花茎细胞核形态，如图5B所示。

对比例1

在实施例2的基础上，裂解后溶液稀释2倍后，取500μL稀释的裂解溶液，将流式细胞仪的喷嘴换成70μm喷嘴分选，其他操作步骤一致。最后在台盼蓝染色条件下，显微镜下观察烟草叶细胞核形态如图5所示。

结果显示：实施例2中，烟草叶细胞核经100μm喷嘴分选所得的细胞核形态完整，边缘清晰。对比例1中烟草叶细胞核经70μm喷嘴分选所得的细胞核，染色不清晰，形状不规则，表明细胞核已经破损。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。