颅内钙化的药物靶标及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地涉及颅内钙化的药物靶标及其应用。

背景技术

颅内钙化是一类以大脑中发生钙化为主要病理特征的神经退行性疾病。目前在临床上，通过神经影像学[主要又以计算机断层扫描(CT)技术]诊断发现，颅内钙化的发病率非常高，且随着年龄的增长而升高，在年轻人中发病率约为1％，在老年人中发病率高达20％。

随着颅内钙化的加重，常诱发患者各种各样的锥体外系临床症状，从偶尔的偏头痛到严重的运动障碍(如肌张力障碍、共济失调和帕金森病样症状等)和神经精神障碍(如记忆力下降、情感障碍、精神错乱和痴呆等)，也可能患者一生无临床症状。

至今，颅内钙化的治疗研究进展中，国内外依旧没有找到任何有效的治疗方法，这与颅内钙化的发病机制研究缓慢、没有已知的颅内钙化药物靶标等原因具有很大的关系。因此，有关颅内钙化的致病机理和药物靶标筛选研究非常迫切。

发明内容

本发明的目的在于研究颅内钙化的致病机理和与之对应的药物靶标，具体地本发明提供了一组可以用于检测颅内钙化疾病的药物靶标，所述靶标选自：骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、骨保护素(OPG)、肌球蛋白重链15(MYH15)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、β-肌动蛋白(ACTB)、磷脂酶C(PLCG2)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、整合素β2(ITGB2)、死亡相关蛋白激酶(DAP)、Maestroheat-like repeat家族成员7(MROH7)、细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)、或其组合。

本发明第一方面提供了一种标志物或其检测试剂的用途，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于(a)检测颅内钙化疾病，和/或(b)评估颅内钙化疾病治疗效果；

其中，所述的标志物选自下组：

(Z1)骨桥蛋白(OPN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z2)骨钙蛋白(OCN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z3)碱性磷酸酶(ALP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z4)骨保护素(OPG)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z5)肌球蛋白重链15(MYH15)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z6)天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z7)禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z8)β-肌动蛋白(ACTB)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z9)磷脂酶C(PLCG2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z10)丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z11)整合素β2(ITGB2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z12)死亡相关蛋白激酶(DAP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z13)Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z14)细胞色素p450家族成员(CYP2J13)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z15)趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z16)c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z17)IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：引物、探针、抗体、核酸适配体、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述颅内钙化疾病包括由遗传因素、多种先天性综合征、病毒感染、外伤、毒素、生理性伤害、甲状旁腺功能减退、钙磷代谢异常等因素引起的病理性颅内钙化，以及由于年龄老化引起的生理性颅内钙化。

在另一优选例中，所述检测试剂包括：

(a)标志物Z1-Z17中的一种或多种的特异性抗体、特异性结合分子；和/或

(b)特异性扩增标志物Z1-Z17中的一种或多种的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片(如核酸芯片或蛋白质芯片)。

在另一优选例中，所述的诊断包括早期诊断、辅助性诊断。

在另一优选例中，所述标志物Z1-Z17来源于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括灵长动物(如人)。

在另一优选例中，所述标志物Z1-Z17来源于人。

在另一优选例中，所述标志物Z1-Z17来源于被诊断患有颅内钙化疾病的患者或颅内钙化疾病疑似患者。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述的离体样本包括：组织样本、脑脊液和血液。

在另一优选例中，所述的样本为分离自脑组织的样本。

在另一优选例中，所述检测是检测脑组织中标志物Z1-Z17中的一种或多种的表达量。

在另一优选例中，所述的检测试剂偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针，所述的特异性寡核苷酸探针包括与标志物Z1-Z17中的一种或多种的多核苷酸(mRNA或cDNA)特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体，所述的特异性抗体包括抗标志物Z1-Z17中的一种或多种的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，当所述标志物基因的表达水平恢复到正常人群的水平，则提示颅内钙化疾病的防治效果较好或基本治愈了颅内钙化疾病或抑制住了颅内钙化疾病的恶化。

在另一优选例中，所述的试剂为PCR引物。

在另一优选例中，所述的引物为用于扩增标志物Z1-Z17的引物。

在另一优选例中，所述的引物包含如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示的引物对。

在另一优选例中，所述的引物包含如SEQ ID No:5、SEQ ID No:6所示的引物对。

在另一优选例中，所述的引物包含如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的引物对。

在另一优选例中，所述的标志物在诊断试剂盒作为标准品(或质控品)。

在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于对脑脊液样品进行检测。

本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测选自下组的标志物：

(Z1)骨桥蛋白(OPN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z2)骨钙蛋白(OCN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z3)碱性磷酸酶(ALP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z4)骨保护素(OPG)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z5)肌球蛋白重链15(MYH15)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z6)天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z7)禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z8)β-肌动蛋白(ACTB)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z9)磷脂酶C(PLCG2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z10)丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z11)整合素β2(ITGB2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z12)死亡相关蛋白激酶(DAP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z13)Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z14)细胞色素p450家族成员(CYP2J13)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z15)趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z16)c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z17)IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有标志物Z1-Z17的一种或多种作为对照品或质控品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(a)检测颅内钙化疾病，和/或(b)评估颅内钙化疾病治疗效果。

在另一优选例中，所述的试剂为PCR引物。

在另一优选例中，所述的引物为用于扩增标志物Z1-Z17的引物。

在另一优选例中，所述的引物包含如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示的引物对。

在另一优选例中，所述的引物包含如SEQ ID No:5、SEQ ID No:6所示的引物对。

在另一优选例中，所述的引物包含如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的引物对。

在另一优选例中，所述的标志物浓度包括蛋白浓度、mRNA浓度、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于(a)检测颅内钙化疾病，和/或(b)评估颅内钙化疾病治疗效果。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当各标志物基因(或其组合)的表达水平或各标志物蛋白(或其组合)的表达量或各标志物的浓度恢复到正常对照人群中的水平，则提示颅内钙化疾病的防治效果较好或基本治愈了颅内钙化疾病或抑制住了颅内钙化疾病的恶化。

本发明第三方面提供了一种检测方法，包括步骤：

(a)提供一检测样本，所述检测样本为分离自脑组织的样本；

(b)检测所述检测样本中标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或标志物Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度，记为E1；和

(c)将所述标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或标志物Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度E1与对照参比值E0进行比较。

在另一优选例中，所述的样本来自一检测对象。

在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，如果标志物Z1-Z4、Z7-Z17的一种或多种基因的表达水平或标志物Z1-Z4、Z7-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z4、Z7-Z17的一种或多种的浓度E1高于对照参比值E0，则该对象患有颅内钙化疾病的几率大于一般人群(正常对照人群)。

在另一优选例中，如果标志物Z5-Z6的一种或多种基因的表达水平或标志物Z5-Z6的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z5-Z6的一种或多种的浓度E1低于对照参比值E0，则该对象患有颅内钙化疾病的几率大于一般人群(正常对照人群)。

在另一优选例中，所述的对照参比值E0为所述正常对照人群的相同样本中或非颅内钙化疾病的脑部疾病患者人群的相同样本中或该检测对象在接受颅内钙化疾病药物治疗前自身的相同样本中的标志物Z1-Z17的一种或多种的表达水平或表达量或浓度。

在另一优选例中，当标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或标志物Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度E1恢复到对照参比值E0，则提示颅内钙化疾病的防治效果较好或基本治愈了颅内钙化疾病或抑制住了颅内钙化疾病的恶化。

在另一优选例中，通过RT-PCR、原位杂交或转录组测序检测样品中标志物Z1-Z17一种或多种的RNA的表达水平，免疫印迹或免疫组织化学检测样品中的标志物Z1-Z17一种或多种蛋白的表达水平。

在另一优选例中，用Elisa试剂盒、蛋白质免疫印迹、蛋白质组学等方法检测标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

本发明第四方面提供了一种诊断颅内钙化疾病的方法，包括步骤：

a)提供一来自待测对象的测试样本，所述的测试样本包括脑组织；

b)检测所述测试样本中脑组织中标志物Z1-Z17的一种或多种的基因的表达水平或蛋白的表达量或浓度，记为E1；和

c)将所述的标志物Z1-Z17的一种或多种的基因的表达水平或蛋白的表达量或浓度E1与对照参比值E0进行比较，

其中所述样本中标志物Z1-Z4、Z7-Z17的一种或多种基因的表达水平或标志物Z1-Z4、Z7-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z4、Z7-Z17的一种或多种的浓度E1高于对照参比值E0，则该对象患有颅内钙化疾病的几率大于一般人群(正常对照人群)；或

如果标志物Z5-Z6的一种或多种基因的表达水平或标志物Z5-Z6的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z5-Z6的一种或多种的浓度E1低于对照参比值E0，则该对象患有颅内钙化疾病的几率大于一般人群(正常对照人群)。

在另一优选例中，所述的诊断包括早期诊断、辅助性诊断、或其组合。

在另一优选例中，所述的待测对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的普通人群包括健康人群或未患有颅内钙化疾病的人。

在另一优选例中，所述的对象为颅内钙化疾病患者或疑似患者。

另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述利用定量PCR检测标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平，并进行数据处理，所述数据处理根据所述待测对象的标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平确定所述待测对象是否为颅内钙化疾病患者。

本发明第五方面提供了一种评价颅内钙化疾病治疗效果的方法，包括步骤：

(a)提供一检测样本，所述检测样本为分离自一对象的脑组织样本、脑脊液或血液，其中所述对象为颅内钙化疾病治疗之中或之后的患者；

(b)检测所述检测样本中脑组织、脑脊液或血液中标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度，记为E1；和

(c)将所述标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度E1与对照参比值E0进行比较，其中，如果标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度E1恢复到对照参比值E0，则提示颅内钙化疾病的防治效果较好或基本治愈了颅内钙化疾病或抑制住了颅内钙化疾病的恶化。

在另一优选例中，所述方法还包括：将所述表达水平或表达量或浓度E1与E2进行比较，其中所述E2为该检测对象在接受颅内钙化疾病药物治疗前自身的相同样本中的标志物Z1-Z17的一种或多种基因的表达水平或Z1-Z17的一种或多种蛋白的表达量或标志物Z1-Z17的一种或多种的浓度。

本发明第六方面提供了一种标志物的用途，用作诊断颅内钙化疾病和/或评价颅内钙化疾病治疗效果的标志物，其中，所述的标志物选自下组：

(Z1)骨桥蛋白(OPN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z2)骨钙蛋白(OCN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z3)碱性磷酸酶(ALP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z4)骨保护素(OPG)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z5)肌球蛋白重链15(MYH15)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z6)天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z7)禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z8)β-肌动蛋白(ACTB)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z9)磷脂酶C(PLCG2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z10)丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z11)整合素β2(ITGB2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z12)死亡相关蛋白激酶(DAP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z13)Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z14)细胞色素p450家族成员(CYP2J13)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z15)趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z16)c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；

(Z17)IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

本发明第七方面提供了一种诊断颅内钙化疾病的系统，所述系统包括：

(a)特征接收模块，所述特征接收模块用于接收脑组织样本、脑脊液或血液特征数据；所述的特征数据包括：脑组织样本、脑脊液或血液中的标志物的表达水平或表达量或浓度，所述的标志物选自下组：

(Z1)骨桥蛋白(OPN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z2)骨钙蛋白(OCN)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z3)碱性磷酸酶(ALP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z4)骨保护素(OPG)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z5)肌球蛋白重链15(MYH15)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z6)天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z7)禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z8)β-肌动蛋白(ACTB)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z9)磷脂酶C(PLCG2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z10)丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z11)整合素β2(ITGB2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z12)死亡相关蛋白激酶(DAP)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z13)Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z14)细胞色素p450家族成员(CYP2J13)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z15)趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z16)c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z17)IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)基因、或其mRNA、或其cDNA、或其蛋白；和/或

(Z18)(Z1)～(Z17)组合；

(b)数据处理模块，将所述脑组织样本、脑脊液或血液中的标志物的表达水平或表达量或浓度与标准值进行比较，从而得出颅内钙化疾病的判断结果；和

(c)结果输出模块，所述输出模块用于接收并输出判断结果。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述标准值为所述正常对照人群的相同脑组织样本、脑脊液或血液中或非颅内钙化疾病的脑部疾病患者人群的相同脑组织样本、脑脊液或血液中的标志物Z1-Z17的一种或多种的表达水平或表达量或浓度。

在另一优选例中，所述脑组织样本、脑脊液或血液中的标志物的表达水平或表达量或浓度高于标准值，则表明所述对象患有颅内钙化疾病。

在另一优选例中，所述的特征接收模块包括样本采集仪、特征信号输入端。

在另一优选例中，所述的数据处理模块包括一处理器，以及一储存器，其中所述的储存器中存储有颅内钙化疾病的阈值信息。

在另一优选例中，所述的输出模块包括任何终端，优选显示器、打印机、平板电脑(PAD)、智能手机。

在另一优选例中，所述的各模块通过有线或无线方式连接。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为钙化相关基因的mRNA表达量。如图1所示，与野生型(WT)丘脑相比，颅内钙化模型(Slc20a2-Ki纯合)小鼠丘脑中的Spp1(A)、Mgp(B)和Col4a2(C)在mRNA水平的表达量显著增加。WT和Slc20a2-Ki纯合小鼠的数量分别是5只；Error bars以mean±s.e.m表示；**表示p值小于0.01；p值由秩和检验计算得出。

图2为Slc20a2-Ki纯合小鼠脑组织中的骨调素(OPN)检查。如图2所示，(A)为免疫荧光检测OPN，细胞核以DAPI染色。(B)为HE染色法染钙化。(A'-B')是(A-B)图中虚线框中的放大图。(A)和(B)是连续切片。观察OPN与颅内钙化的关系，发现在颅内钙化结节的位置，有明显的OPN聚积，表明OPN与颅内钙化的形成有关，且是颅内钙化的有机成分之一。(A-B)中Slc20a2-Ki纯合小鼠实验数量为3只；(A-B)和(A'-B')中比例尺的长度分别为250μm和25μm。

图3为各实验组别WT+H

图4为各实验组别WT+H

图5为Slc20a2-Ki纯合小鼠脑组织中的碱性磷酸酶(ALP)检查。如图5所示，观察ALP与颅内钙化的关系，发现钙化结节内部具有大量的ALP累积，表明ALP与颅内钙化的形成有关，且是钙化结节的有机成分之一。ALP染色，阳性颜色为黑色，细胞核以苏木素染色。黑色箭头所指位置为钙化位点；Slc20a2-Ki纯合小鼠实验数量为3只；比例尺的长度为25μm。

图6为Slc20a2-Ki纯合小鼠脑组织中的骨保护素(OPG)检查。如图5所示，观察OPG与颅内钙化的关系，发现钙化结节内部具有大量的OPG累积，表明OPG与颅内钙化的形成有关，且是钙化结节的有机成分之一。免疫组化染色OPG，阳性颜色为棕色，细胞核以苏木素染色。黑色箭头所指位置为钙化位点；Slc20a2-Ki纯合小鼠实验数量为3只；比例尺的长度为25μm。

图7为LJY-001浸膏溶液给药后恢复至WT水平基因的热图分析。如图7所示，可以看出与Ki+H

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现一组可以用于检测颅内钙化疾病的药物靶标，在此基础上，完成了本发明。

具体地，本发明研究发现脑脊液中的骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨保护素(OPG)等和丘脑中肌球蛋白重链15(MYH15)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、β-肌动蛋白(ACTB)、磷脂酶C(PLCG2)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、整合素β2(ITGB2)、死亡相关蛋白激酶(DAP)、Maestro heat-likerepeat家族成员7(MROH7)、细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)的表达量可以作为检测颅内钙化的靶标。在本发明的实施例中发现，在颅内钙化型小鼠的脑脊液中，桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨保护素(OPG)的表达量明显升高，在颅内钙化型小鼠的丘脑中，肌球蛋白重链15(MYH15)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、β-肌动蛋白(ACTB)、磷脂酶C(PLCG2)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、整合素β2(ITGB2)、死亡相关蛋白激酶(DAP)、Maestro heat-likerepeat家族成员7(MROH7)、细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)的表达量明显改变。因此这一组靶标或其组合可以用于制备检测颅内钙化疾病的诊断试剂或诊断试剂盒，和/或评估颅内钙化疾病治疗效果的诊断试剂或诊断试剂盒。

术语

如本文所用，“本发明的药物靶标”、“一组可以用于检测颅内钙化疾病的药物靶标”等可以互换使用，均指的是选自下组的脑脊液中的物质：

(Z1)骨桥蛋白(OPN)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z2)骨钙蛋白(OCN)、或其mRNA、或其cDNA、

(Z3)碱性磷酸酶(ALP)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z4)骨保护素(OPG)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z5)肌球蛋白重链15(MYH15)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z6)天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z7)禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z8)β-肌动蛋白(ACTB)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z9)磷脂酶C(PLCG2)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z10)丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z11)整合素β2(ITGB2)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z12)死亡相关蛋白激酶(DAP)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z13)Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z14)细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z15)趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z16)c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z17)IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)、或其mRNA、或其cDNA；(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

如本文所用，“LJY-001药液”是本发明人研究所得的，一种能够有效治疗颅内钙化的中药组合，所述中药组合的配方在专利申请CN202011504122.6中公开。

颅内钙化

1850年Delacour首次对颅内钙化进行了描述，随后Bamberger等也报道一位患有智障和癫痫发作的女性患者颅内钙化，从病理学上证实了颅内钙化的存在。

颅内钙化可分为生理性钙化和病理性钙化两种类型，若钙化只局限于苍白球，不涉及脑内其他部位，且患者40岁后仍未表现出神经病学症状，也无钙代谢异常疾病，则可视为颅内生理性钙化；而病理性钙化可由许多因素引起，如遗传因素、年龄老化、自身免疫、TORCH综合症、病毒感染、外伤、毒素、生理性伤害、甲状旁腺功能减退等，此外还有多种先天性综合征也可伴发脑钙化，如Aicardi-Goutières综合征、Cockayne综合征、I型Kenny-Caffey综合征、Krabbe病等。

尽管颅内钙化的诱发因素有很多，但各类颅内钙化也存在着共性特点，其病理学特征相似，多呈双侧对称性，好发于苍白球，此外，齿状核、丘脑、小脑皮质及大脑其他部位等也可被钙化涉及，钙化在脑部呈渐进性地发展；颅内钙化的物质成分包含无机物和有机物，其中无机物的主要成分为羟基磷灰石。

特发性基底节钙化

特发性基底节钙化(Idiopathic basal gangl ia calcification，IBGC)是一种由遗传因素引起的颅内钙化，发病率为0.21-2％，其稳定遗传的颅内钙化表型，使其成为颅内钙化疾病发病机制、药物靶标及其防治研究的可靠研究对象。

IBGC的主要特征是基底节及大脑其他部位发生对称性钙化，俗称Fahr病。患者多在30-60岁之间发病，由于钙化常伴随帕金森样症状、共济失调、肌张力障碍、痴呆、记忆力下降、精神错乱、情感障碍、癫痫和偏头痛等症状，患者苦不堪言。IBGC疾病常见的钙化部位有尾状核、齿状核、脑白质、丘脑、皮质、中脑、脑桥等，研究其病理过程发现钙盐颗粒在血管壁及其外周分布广泛。

但IBGC患者血清生化指标如血磷、血钙、甲状旁腺激素(PTH)、碱性磷酸酶、1,25(OH)2D、成纤维生长因子23(FGF23)等均正常。该病在1850年由Delacour首次报道，2012年之前其致病机制未知，我们从家系入手，通过遗传分析首次克隆并报道了第一个IBGC的致病基因SLC20A2，功能分析发现该基因突变影响细胞对无机磷转运，导致细胞外基质中无机磷(Pi)积累而致病。目前研究发现，50％左右的IBGC患者是由SLC20A2基因突变引起的。因此，我们构建了Slc20a2基因突变(p.S602W)的小鼠，经鉴定该小鼠具有明显的颅内钙化表型，是一个很好的颅内钙化模型小鼠；同时，我们发现了一种对颅内钙化具有明显抑制作用的中药组合物LJY-001，这些研究为颅内钙化的药物靶标筛选工作奠定了基础。

骨桥蛋白(OPN)

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)由Spp1基因编码，又称骨调素，是一种分泌型磷蛋白，为细胞基质蛋白的小整合素结合配体N-连接糖蛋白(SIBLING)家族成员，参与多种生物活动。OPN在骨代谢和体内平衡中发挥作用。OPN不仅是神经元介导和内分泌调节骨量的重要因素，而且参与多种骨相关细胞的增殖、迁移、粘附等生物活动，包括骨髓间充质干细胞、造血干细胞、破骨细胞、成骨细胞。OPN与许多骨相关疾病的发生发展密切相关，如骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨肉瘤等。

骨钙蛋白(OCN)

骨钙蛋白(Osteocalcin，OCN)由Mgp基因编码，又称骨钙素，是骨细胞外基质的重要组成部分，为骨中含量最丰富的非胶原蛋白。OCN可以与钙离子结合，并含有三个高度保守的谷氨酰基(Glu)，可以被维生素k依赖的γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)羧化，导致构象变化，稳定蛋白质的α-螺旋部分的同时，也赋予钙离子和羟基磷灰石更大的亲和力。因此，OCN在骨骼发育中起着至关重要的作用，是骨形成和重塑的标志。

碱性磷酸酶(ALP)

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)由ALPL基因编码，是膜结合的糖蛋白，在高pH值条件下水解各种单磷酸盐酯。ALP是动物骨骼中存在的一种丰富的酶，广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织，它能迅速将己糖磷酸水解成磷酸，在人骨矿化中发挥着重要作用，许多低磷酸酶病例证实低磷酸酶是一种由ALPL基因突变引起的罕见代谢性遗传疾病。

骨保护素(OPG)

骨保护素(osteoprotegerin，OPG)由TNFRSF11B基因编码，是TNF受体超家族的成员。OPG是骨代谢的重要调节因子，在血管系统中也有一定的作用。研究表明，OPG是一种重要的动脉钙化抑制剂，在某些病理条件下，如糖尿病、慢性肾病和其他代谢疾病，内皮细胞会释放OPG，保护其生存。

肌球蛋白重链15(MYH15)

肌球蛋白重链15由MYH15基因编码，是一种慢收缩肌球蛋白。它在2002年首次被克隆出来，目前相关的功能研究非常少。最近研究发现肌球蛋白重链15的基因改变是肌萎缩性脊髓侧索硬化症的风险因子，MYH15可以调节扩张G

天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)

天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)由AGA基因编码，是糖蛋白中n-寡糖分解代谢的关键酶。AGA基因突变会导致体内AGA底物积累，引起一种常染色体隐性溶酶体储存病——天冬氨酸氨基葡萄糖尿症(AGU)。

禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)

禽肉瘤病毒17假定转化基因(JUN)由JUN基因编码，是一种致癌基因。小鼠中Jun缺乏会导致胚胎在妊娠中期和妊娠后期死亡，表现为肝生成受损、胎儿肝红细胞生成改变和全身水肿。JUN在肿瘤发展的早期阶段，可以通过拮抗p53活性来阻止细胞凋亡。

β-肌动蛋白(ACTB)

β-肌动蛋白(ACTB)由ACTB基因编码，是许多细胞质功能所必需的，如调节细胞形状、迁移、核功能、基因表达、细胞分裂和增殖等。

磷脂酶C(PLCG2)

磷脂酶C(PLCG2)由PLCG2基因编码，是激动剂诱导的钙离子进入细胞的必需酶类。PLCG可以催化磷脂水解生成甘油二酰基和脂头基的水溶性磷酸化衍生物，并对磷酸肌苷具有特异性。

丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)

丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)由MAP3K14基因编码，又称核因子-κB(NF-κB)诱导激酶，可以活化NF-κB，参与调节控制细胞增殖和凋亡基因以及对炎症和免疫反应作出应答基因的表达。

整合素β2(ITGB2)

整合素β2(ITGB2)由ITGB2基因编码，又称CD18，是一种白细胞粘附分子，属于细胞膜糖蛋白。β2-整合素主要参与伤口愈合，它是在细胞信号和微血管反应的帮助下实现的，这些反应包括去除病原体或细胞碎片等；β2-整合素还可以介导治疗感染关键过程中的白细胞粘附和爬行。

死亡相关蛋白激酶(DAP)

死亡相关蛋白激酶(DAP)，由DAP基因编码，是γ-干扰素(IFNG)诱导的程序性细胞死亡的阳性介质。DAP表达失活可降低HeLa细胞中IFNG诱导的凋亡的敏感性。

Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)

Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)由MROH7基因编码，MROH7与下游基因四三肽重复结构域蛋白4(TTC4)在缺乏血清和FGF-2的血管内皮细胞中充当凋亡抑制因子。

细胞色素p450家族成员(CYP2J13)

细胞色素p450家族成员(CYP2J13)由CYP2J13编码，没有确切的蛋白功能研究，预测有血红素结合活性、异构酶活性和单加氧酶活性，参与环氧合酶P450途径、亚油酸代谢过程以及异源代谢过程。

趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)

趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)由CXCL10基因编码，也称IP10，作为α趋化因子家族的成员，IP10抑制骨髓集落形成，在体内具有抗肿瘤活性，是人类单核细胞和T细胞的趋化剂，并促进T细胞与内皮细胞的粘附。IP10还是体内血管生成的有效抑制剂，可能参与炎症和肿瘤发生过程中血管生成的调节。

c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)

c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)由CLEC7A基因编码，是一种由髓系吞噬细胞(巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞)表达的模式识别受体，可识别真菌和植物细胞壁中多种β-1,3-连接和β-1,6-连接的葡聚糖，并触发直接的细胞抗菌活性，包括吞噬和活性氧的产生。

IV型胶原蛋白的α-2亚基(Collagen alpha-2(IV)，Col4a2)

IV型胶原蛋白的α-2亚基(Collagen alpha-2(IV))由Col4a2基因编码，是IV型胶原蛋白的组成部分。IV型胶原蛋白与层粘连蛋白、巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖相关，形成片状基底膜，将上皮细胞与结缔组织分开，是血管基底膜的标志性蛋白之一。研究发现IV型胶原蛋白在肾结石中大量累积，是肾结石钙化基质的有机成分之一。

引物

引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补。

在本发明中，为了提高检测体系的灵敏度，预先扩增检测体系中对应基因片段，因而设计了对应于突变所在序列的引物。

在一个优选例中，针对磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)的cDNA，设计了检测磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)的最优的引物对为SEQ ID No:1和2。

在另一优选例中，针对Spp1(OPN)的cDNA，设计了检测Spp1(OPN)的最优的引物对为SEQ ID No:3和4。

在另一优选例中，针对Mgp(OCN)的cDNA，设计了Mgp(OCN)的最优的引物对为SEQID No:5和6。

在另一优选例中，针对Col4a2的cDNA，设计了Col4a2的最优的引物对为SEQ IDNo:7和8。

探针

在本文中，“探针”是指一段带有检测标记且顺序已知的、与目的基因(在本文中指的是)互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理；②应带有容易被检测的标记。核酸探针可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。本发明中，所述的探针也指一种修饰引物，所述修饰引物的两端或中间带有化学修饰基团，这些化学修饰具有特殊功能包括但不限于：信号指示作用，增强与反应物的连接作用等。

试剂盒

基于在颅内钙化疾病小鼠模型的脑脊液样品中，本发明的药物靶标表达量明显变高，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含选自下组的标志物或其检测试剂：

(Z1)骨桥蛋白(OPN)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z2)骨钙蛋白(OCN)、或其mRNA、或其cDNA、

(Z3)碱性磷酸酶(ALP)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z4)骨保护素(OPG)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z5)肌球蛋白重链15(MYH15)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z6)天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z7)禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z8)β-肌动蛋白(ACTB)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z9)磷脂酶C(PLCG2)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z10)丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z11)整合素β2(ITGB2)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z12)死亡相关蛋白激酶(DAP)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z13)Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z14)细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z15)趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z16)c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、或其mRNA、或其cDNA；

(Z17)IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)、或其mRNA、或其cDNA；(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

(Z18)(Z1)～(Z17)组合。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次发现了小鼠脑脊液中骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨保护素(OPG)的表达水平以及丘脑中肌球蛋白重链15(MYH15)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、β-肌动蛋白(ACTB)、磷脂酶C(PLCG2)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、整合素β2(ITGB2)、死亡相关蛋白激酶(DAP)、Maestroheat-like repeat家族成员7(MROH7)、细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)的表达量与颅内钙化疾病的关系。

(b)本发明发现，患有颅内钙化疾病后，骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨保护素(OPG)表达增加，在颅内钙化型小鼠的丘脑中，肌球蛋白重链15(MYH15)、天冬氨酰氨基葡糖苷酶(AGA)、禽肉瘤病毒17假定转化基因(Jun)、β-肌动蛋白(ACTB)、磷脂酶C(PLCG2)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAP3K14)、整合素β2(ITGB2)、死亡相关蛋白激酶(DAP)、Maestro heat-like repeat家族成员7(MROH7)、细胞色素p450家族成员(CYP2J13)、趋化因子CXC基序配体10(CXCL10)、c型凝集素结构域家族7成员a(CLEC7A)、IV型胶原蛋白的α-2亚基(COL4A2)的表达量明显升高。因此这一组靶标可以用于制备检测颅内钙化疾病的诊断试剂或诊断试剂盒，和/或评估颅内钙化疾病治疗效果的诊断试剂或诊断试剂盒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本实施例中需要用到的实验模型的建立如下所述：

颅内钙化疾病的模型小鼠(slc20a2-p.S602W Ki小鼠)

在本发明之前，我们构建了颅内钙化疾病的模型小鼠(slc20a2-p.S602W Ki小鼠)。将小鼠slc20a2基因[Ensembl Gene ID:(ENSMUSG00000037656)]cDNA(Transcript:slc20a2-201(ENSMUST00000067786))第1805-1806位的碱基CC突变为GG，从而使第602位密码子TCC突变为TGG，编码的丝氨酸变为色氨酸(p.S602W)，分别获得野生型(WT)、杂合型(slc20a2

通过表型分析，我们确定了纯合型小鼠与人类颅内钙化疾病有极其相似的表型，纯合型小鼠脑部出现随着年龄的增加呈渐进性发展的钙化表型及其它症状，如运动平衡能力、焦虑行为、学习与记忆以及抑郁行为出现异常。机制研究发现，与野生型小鼠CSF的Pi浓度相比，纯合型小鼠CSF的Pi浓度显著增加，表明Slc20a2纯合突变破坏了小鼠脑内的正常Pi稳态，这个结果与SLC20a2突变引起人类IBGC患者脑内局部Pi稳态失衡的结果一致。因此，我们将上述纯合型小鼠作为颅内钙化模型小鼠。

实施例中所需要的用到的各种检测方法罗列如下：

1、蛋白质组学

iTRAQ技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术，能够得到：一般500至600种蛋白，以及不同样品间蛋白质表达的差异。iTRAQ试剂盒包括八种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。具体步骤如下：

(1)分布取雄性野生型小鼠和颅内钙化模型小鼠各3只，取新鲜大脑组织，并提取蛋白；

(2)分别对6份蛋白质进行蛋白酶水解；

(3)采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合；

(4)使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱；

(5)6个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰。

(6)对加入标记的肽段进行二级质谱，这时，平衡基团从报告基团上脱落；

(7)二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生6个报告离子信号，其强度分别代表6个标记的样品的同一个肽段；

(8)报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值；

(9)对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。

2、实时定量PCR实验

通过http://asia.ensembl.org/index.html查找磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)、骨调素(Spp1)、骨钙素(Mgp)和IV型胶原蛋白α-2亚基(Col4a2)基因序列信息，用GeneTool2.0软件和Oligo v7.56软件分别分析和设计上述基因的引物，引物设计原则主要包括：引物跨两个外显子、荧光定量产物片段大小在100-200bp之间。引物序列信息如表A：

表A本实施例中的序列

提取小鼠新鲜的脑组织，分离丘脑，将其放入事先装有1mL TRIzol裂解液的匀浆器中，研磨均匀，室温静置5-15min，使组织完全裂解。匀浆液转移至2mL的EP管中，加入200μL氯仿，涡旋振荡混匀后，静置2min，然后4℃12000rpm离心15min。取溶有RNA的上清溶液至新的EP管中，加入0.5mL异丙醇使RNA沉淀，室温静置10min，4℃12000rpm离心5-10min。去上清，再加入0.5mL 75％的乙醇，上下摇晃数次，4℃12000rpm离心5-10min。去掉上清，室温干燥RNA5-15min，加入适量DEPC水溶解，测定浓度。根据浓度吸取适量体积RNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测提取的RNA是否具有降解情况。根据RNA浓度，在计算好所需RNA模板的体积后，按照第一链cDNA合成的反转录试剂盒说明书进行操作，配置10μL体系，合成第一链cDNA，作为后续实时定量PCR实验中的DNA模板。按照荧光定量PCR试剂盒(

3、免疫组织化学染色

(1)石蜡切片的制作

取目的小鼠，麻醉处死后，快速分离新鲜脑组织，将脑组织置于4％多聚甲醛中，固定过夜(超过12h)。将固定好的脑组织取出，清水冲洗数次，根据所需切片形状修块。将脑组织依次放入75％酒精(3-4h)、85％酒精(1.5-2.5h)、90％酒精(1-2h)、95％酒精(1h)、无水乙醇I(0.5h)和无水乙醇II(0.5h)进行脱水，而后分别用醇苯(无水乙醇：二甲苯＝1：1)、二甲苯I和二甲苯II对脑组织进行透明7-10min，以脑组织中心部位透明为标准。以70℃的石蜡溶液对脑组织浸蜡3次，每次1h，而后进行包埋。最后进行切片，按照需求切取4-12μm厚度的切片。

(2)苏木素-伊红(HE)染色

石蜡切片需先用二甲苯和梯度酒精进行脱蜡，将切片依次放入二甲苯Ⅰ7-10min、二甲苯Ⅱ7-10min、无水乙醇5-10min、95％酒精5min、85％酒精5min、70％酒精5min和蒸馏水2min。冰冻切片无需脱蜡，只需将其从冰箱中取出，37℃放置30min后，即可进行后续染色。

将切片置于苏木素染液中，对细胞核染色3min，取出后流水冲洗1min，再以1％的盐酸酒精分化5-10sec，流水冲洗1min，用1％氨水返蓝30sec，流水冲洗1min。将切片置于伊红染液中，对细胞质染色1min，取出后依次放入无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、二甲苯Ⅰ5min和二甲苯Ⅱ5min中脱水，取出切片晾干后，用中性树胶封片。最后，通过显微镜观察并采集图片。

(3)免疫荧光染色

取切片，按实验方法(2)中的HE染色步骤，先对石蜡切片进行染色前的处理。蒸馏水清洗完成后，组织切片置于EDTA抗原修复液(pH＝8.0)中，通过微波炉加热进行抗原修复，中低火10min，室温自然冷却后，用PBS缓冲液清洗3次，每次5min。3％的BSA溶液封闭组织切片30min。封闭完成后，轻轻甩去封闭液，在组织切片表面滴加配制好的一抗溶液，放在湿盒中，4℃孵育过夜(12h左右)。次日将一抗溶液轻轻甩去后，用PBS缓冲液清洗3次，每次5min，洗净后轻轻甩干，滴加配制好的二抗溶液，孵育50min。然后用PBS缓冲液清洗3次，每次5min，洗净后轻轻甩干，滴加DAPI染液，对细胞核进行复染，室温避光5-10min。再用PBS缓冲液清洗3次，每次5min，洗净后轻轻甩干，用抗荧光淬灭封片剂封片。最后，在荧光显微镜下观察并拍照。

4、无机磷(Pi)浓度检测

孔雀石绿法检测小鼠CSF中Pi浓度。其反应原理为：孔雀石绿染料能与Pi在钼酸溶液中形成的磷钼酸盐作用，在酸性条件下产生磷钼酸盐络合物起呈色反应，溶液从棕色转变为绿色。

所需试剂：KH

取1微升脑脊液稀释至50微升，先后加入75微升孔雀石绿溶液和25微升钼酸铵溶液，混合后加入到96孔板中，酶标仪检测650纳米处溶液的吸光值，并根据标准曲线得出溶液中的无机磷浓度。每个样品测3次取平均值。

5、OPN浓度检测

Elisa试剂盒(Mouse Osteopontin ELISA Kit，Bosterbio，USA)检测OPN浓度，具体步骤如下：首先，加样品和标准品，37℃反应90分钟。再加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1×洗涤缓冲液洗涤3次。然后加亲和素-过氧化物酶复合物，37℃反应30分钟。1×洗涤缓冲液洗涤5次。接着加TMB显色液37℃反应25-30分钟。最后加入TMB终止液，通过酶标仪450纳米检测吸光度。

6、转录组测序(RNA-seq)

转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合主要包括mRNA和非编码RNA。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。转录组测序(RNA-seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。RNA-seq技术具体过程如下：

(1)分别提取每个丘脑样品的总RNA，并精确检测RNA完整性和含量。

(2)取1微克的总RNA作为文库构建的起始RNA，通过磁珠富集带有多聚腺苷酸尾的mRNA，而后用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，分别合成cDNA第一条链和第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加腺苷酸尾并连接测序接头，筛选出370～420个碱基大小的cDNA，进行聚合酶链反应(PCR)扩增和PCR产物纯化，最终获得文库。

(3)文库进行质量检测，合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行测序。测序的基本原理是边合成边测序，在测序的流动池中加入四种荧光标记的脱氧核苷酸混合物、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的脱氧核苷酸混合物就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

(4)对测序结果进行数据可视化分析，以热图分析的形式呈现结果。

实施例1确立OPN为防治颅内钙化疾病的一个药物靶标

1.1.蛋白质组学筛选颅内钙化靶标

本发明取颅内钙化形成初期的3月龄野生型(WT)和颅内钙化模型(Slc20a2-Ki纯合)小鼠各5只，提取新鲜的脑组织，通过同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)对小鼠脑部组织进行蛋白质组学分析，发现了多个可能与钙化相关的蛋白表达量上调：骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)和IV型胶原蛋白的α-2亚基等蛋白表达量如表1所示。

表1 3月龄WT和Slc20a2-Ki纯合小鼠脑组织蛋白质组学实验差异蛋白分析

1.2 mRNA水平上验证颅内钙化靶标

通过实时定量PCR实验，在mRNA水平验证OPN、OCN和IV型胶原蛋白等蛋白的表达情况。分别取3月龄的WT和Slc20a2-Ki纯合小鼠各5只，考虑到Slc20a2-Ki纯合小鼠初始钙化区域为丘脑，分别提取各小鼠新鲜的脑组织，分离丘脑，迅速提取RNA，进行后续的实时定量PCR实验。在实时定量PCR实验中，以Gapdh作为内参基因，分别检验OPN(Spp1)、OCN(Mgp)和IV型胶原蛋白α-2亚基(Col4a2)基因的表达情况。结果显示，与WT丘脑相比，Slc20a2-Ki纯合丘脑中的Spp1、Mgp和Col4a2在mRNA水平的表达量显著增加(图1A-C)，这与蛋白质组学中的变化趋势一致。

进一步对OPN在颅内钙化形成过程中扮演的角色进行探索，取3只6月龄的Slc20a2-Ki纯合小鼠，全部取脑后制作成5μm厚度的连续切片。取两张连续的切片，其中一张以OPN的抗体进行免疫荧光染色；另外一张进行HE染色，将颅内钙化染成深紫色。观察OPN与颅内钙化的关系，发现在颅内钙化结节的位置，有明显的OPN聚积，表明OPN与颅内钙化的形成有关，且是颅内钙化的有机成分之一(图2A-B、A’-B’)。

由于OPN还是一种分泌蛋白，因此我们推测在小鼠脑脊液(CSF)中，OPN可能是颅内钙化形成的一种早期生物标志蛋白，可以作为潜在的颅内钙化药物靶标。

1.3活体实验验证OPN为颅内钙化疾病靶标

基于上述研究，本实施例以WT和Slc20a2-Ki纯合小鼠为研究对象，分别设计以灭菌水为WT小鼠饮用水的WT+H

结果发现，与WT+H

实施例2确立OCN为防治颅内钙化疾病的一个药物靶标

我们发现在实施例1中，通过蛋白质组学(表1)和实时定量PCR(图1B)检测发现在Slc20a2-Ki纯合小鼠脑中表达上调的OCN，也是一种分泌蛋白，以实施例1的方法进行小鼠实验，抽取小鼠CSF，检查CSF中OCN浓度。

结果发现，与WT+H

实施例3确立ALP为防治颅内钙化疾病的一个药物靶标

根据实施例1中的研究结果发现，与钙化形成相关的OPN、OCN和IV型胶原蛋白都是骨形成相关蛋白，基于此，我们推测颅内钙化的形成与脑内成骨样环境的出现有关。因此我们检测了成骨细胞标志蛋白碱性磷酸酶(ALP)在脑内的表达情况，ALP染色发现，Slc20a2-Ki纯合小鼠脑中的钙化结节内部具有大量的ALP累积，表明ALP与颅内钙化的形成有关，且是钙化结节的有机成分之一(图5A-C)。ALP作为一种分泌蛋白，在CSF中也有丰富的含量，以实施例1的方法进行小鼠实验，抽取小鼠CSF，检查CSF中ALP浓度。结果发现，与WT+H

实施例4确立OPG为防治颅内钙化疾病的一个药物靶标

根据实施例1中的研究结果发现，与钙化形成相关的OPN、OCN和IV型胶原蛋白都是骨形成相关蛋白，基于此，我们推测颅内钙化的形成与脑内成骨样环境的出现有关。因此我们检测了在血管钙化形成过程中扮演重要角色的骨保护素(OPG)在脑内的表达情况，免疫组织化学染色发现，Slc20a2-Ki纯合小鼠脑中的钙化结节内部具有大量的OPG累积，表明OPG与颅内钙化的形成有关，且是钙化结节的有机成分之一(图6A-C)。OPG作为一种分泌蛋白，在CSF中也有丰富的含量，以实施例1的方法进行小鼠实验，抽取小鼠CSF，检查CSF中OPG浓度。

结果发现，与WT+H

实施例5转录组测序(RNA-seq)筛选出13个颅内钙化靶标

本实施例以WT和Slc20a2-Ki纯合小鼠为研究对象，以灌胃的方式进行给药，分别设计以灭菌水为WT小鼠给药的WT+H

将3轮RNA-seq数据进行可视化分析，热图分析发现，与Ki+H

讨论：

在本发明之前，我们还发现了一种对颅内钙化具有明显抑制作用的中药组合物LJY-001。利用颅内钙化模型小鼠给以LJY-001，从出生后第4周开始，持续给药27周后，取颅内钙化模型小鼠脑部制作石蜡切片，发现颅内钙化模型小鼠给药后颅内钙化得到明显抑制；从第21.5周龄开始，持续给药8.5周后，取颅内钙化模型小鼠脑部制作石蜡切片，发现颅内钙化模型小鼠给药后颅内钙化也得到明显抑制。颅内钙化患者服用LJY-001后，也发现能明显减少脑内钙质沉积，减缓临床症状(参见中国专利申请号：CN202011504122.6)。

本发明设计了野生型和颅内钙化模型小鼠的给灭菌水组以及给LJY-001组。从小鼠出生后第4周开始，持续给药10周后，抽取小鼠脑脊液，用Elisa试剂盒检测OPN、OCN、ALP和OPG等含量。结果显示与给灭菌水的野生型小鼠相比，给灭菌水的颅内钙化模型小鼠脑脊液中OPN、OCN、ALP和OPG等含量显著增高，而给LJY-001药物的颅内钙化模型小鼠脑脊液中OPN、OCN、ALP和OPG等含量显著减低，与野生型小鼠相比无显著差异。并且，本发明还设计了野生型和颅内钙化模型小鼠的灌胃给灭菌水组以及给LJY-001浸膏溶液组，先后完成3轮重复实验以保证实验数据的可靠性。实验从小鼠9周龄开始进行，持续4周后，提取新鲜丘脑，进行RNA-seq分析。结果显示，与灌胃灭菌水的野生型小鼠相比，灌胃灭菌水的颅内钙化模型小鼠丘脑中Myh15、Aga、Jun、Col4a2、Actb、Plcg2、Map3k14、Itgb2、Dap、Mroh7、Cyp2j13、Cxcl10、Clec7a等13个基因的表达异常，而灌胃LJY-001浸膏溶液的颅内钙化模型小鼠丘脑中Myh15、Aga、Jun、Col4a2、Actb、Plcg2、Map3k14、Itgb2、Dap、Mroh7、Cyp2j13、Cxcl10、Clec7a等13个基因的表达量恢复至灌胃灭菌水野生型组小鼠的水平。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。