一种贝莱斯芽孢杆菌GH9、以及基于其的菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种贝莱斯芽孢杆菌GH9、以及基于其的菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

铁参与了细胞中的多条代谢途径，例如作为辅因子参与DNA的复制和修复、细胞呼吸、生物降解和生物合成以及转录调控，是生物体内必需的重要元素。此外，卟啉中的铁对植物的光合作用非常重要。由于铁的溶解度很低，而植物对铁的生物利用率很低，所以缺铁症状在植株中非常普遍。

铁载体是一类对Fe(Ⅲ)具有高亲和力的低分子螯合剂，铁载体可以帮助生物体从多种含铁化合物中获取铁，除了难溶性的氢氧化物，还包括可溶性的柠檬酸铁、磷酸铁，甚至与有机物结合的铁，例如铁转运蛋白等。铁载体产生菌在植物根际定殖，影响植物对铁的吸收利用，从而促进植物生长。此外，铁载体产生菌还能够通过与不能产生铁载体的病原微生物竞争铁元素来抑制病原微生物的生长。

贝莱斯芽孢杆菌最早是在西班牙南部马赫拉分离得到的，早期认为是枯草芽孢杆菌的一个亚种，直到2008年被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体。贝莱斯芽孢杆菌主要用在生物防治上，近年来发现该种的微生物具有植物促生长特性，Bacillus velezensisBAC03能产生吲哚乙酸和NH3，促进甜菜、胡萝卜、黄瓜、胡椒、马铃薯、萝卜、南瓜、番茄和萝卜等9种蔬菜的生长。由于植物促生菌与宿主植物具有一定的共生特异性，研究者多将植物促生菌用作原宿主植物。

高粱是世界上第五大谷类作物，在平原、山丘、涝洼、盐碱地均可种植，具有食用、酿酒、饲用、能源、青贮等多种用途，具有很大的开发潜力。由于我国1/3以上的土壤为石灰性土壤，pH偏高，可溶性亚铁浓度远低于植物生长水平。因此，研究高粱内生铁载体产生菌对高粱生长具有重要意义。

发明内容

本发明意在提供一种贝莱斯芽孢杆菌GH9、以及基于其的菌剂及其制备方法和应用，以解决我国石灰性土壤可溶性亚铁浓度远低于植物生长水平低的问题。

贝莱斯芽孢杆菌GH9，所述贝莱斯芽孢杆菌GH9于2023年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M20231774，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

本方案的工作原理及其有益效果：贝莱斯芽孢杆菌菌剂具有铁载体生产功能，使用于石灰性土壤中可调节PH，提高可溶性亚铁浓度，有助于植物生长。

进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis GH9分离自高粱根。能够在CAS培养基上形成橙色透明圈，使用CAS检测液进行测定，GH9产生噬铁素的相对含量为25.6％。

一种微生物菌剂包括贝莱斯芽孢杆菌GH9。

贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：在LB平板上形成的贝莱斯芽孢杆菌GH9的单菌落接种到LB液体培养基上；

步骤二：在28℃，150rpm摇床中培养48h；

步骤三：8000rpm离心10min收集菌体；

步骤四：用无菌水制成OD

贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂在促进高粱种子萌发方面的应用。

进一步，用贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂浸泡高粱种子6～8h。高粱种子发芽势提高了7.68％，高粱种子的发芽率提高了7.21％。

贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂在促进高粱生长方面的应用。

进一步，将贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂接种到高粱根部。具有铁载体产生功能的贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂能够促进高粱种子萌发和高粱生长，其促进机制主要为调节高粱的氨基酸代谢等代谢途径并促进高粱对氮素和磷素的吸收。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌GH9在CAS培养基上形成的透明圈；

图2为对照组和接种GH9菌剂高粱代谢组中含量排名前20的代谢物堆积图；

图3为PLS-DA代谢物重要性图；

图4为对照组和接种GH9菌剂高粱代谢组差异代谢物显著富集的代谢通路图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

本发明的实施案例1：贝莱斯芽孢杆菌GH9的铁载体产生能力测定

所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis GH9分离自高粱根，于2023年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M20231774，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis GH9分离自高粱根。

所述贝莱斯芽孢杆菌GH9的铁载体产生能力是通过以下方法测定的：

(1)铁载体产生能力的定性检测

将贝莱斯芽孢杆菌GH9点接在CAS固体培养基上，28℃培养72h，观察到菌落周围形成橙色透明圈，表明贝莱斯芽孢杆菌GH9具有铁载体产生能力。见图1。

(2)铁载体产生能力的定量测定

将贝莱斯芽孢杆菌GH9接种到CAS液体基础培养基中，28℃、180r/min摇床培养2-3d，10000r/min离心10min。取5mL上清液，加入等量的CAS检测液，黑暗中静置30min，测630nm处的吸光值(As)，以双蒸水为对照调零。另取空白培养基与CAS检测液等体积混合，以其吸光值作为参比值Ar。根据公式[(As-Ar)/As]*100％计算噬铁素的相对含量为25.6％。

本发明的实施案例2：贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将在LB平板上形成的贝莱斯芽孢杆菌GH9的单菌落接种到LB液体培养基上；

步骤二：置于恒温摇床中，28℃，150rpm培养48h；

步骤三：8000rpm离心10min收集菌体；

步骤四：用无菌水清洗菌体2～3次，除去LB液体培养基；用无菌水重新悬浮菌体，制备菌悬液，用无菌水将菌悬液进行稀释至OD

本发明的实施案例3：贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂对高粱种子萌芽的影响

(1)种子预处理

挑选颗粒饱满、无霉变、无虫害的高粱种子，先用70％乙醇浸泡2分钟，倒掉乙醇后用5％次氯酸钠浸泡5分钟，倒掉次氯酸钠后再用70％乙醇浸泡2min，用无菌水冲洗3～5次。

(2)浸种

向处理好的种子中加入100ml贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂，室温静置6～8h，倒掉菌液，用无菌水冲洗2～3遍。对照组用100ml的无菌水，室温静置6～8h，倒掉无菌水。

(3)种子萌发

将处理好的种子，平铺在水琼脂(琼脂含量为1.4％)平板上，倒置在培养箱中，培养箱的温度设置为28℃。

(4)数据统计

分别于第3天和第7天统计发芽的高粱种子数量，根据公式计算高粱种子的发芽势和发芽率。

对照组高粱种子的发芽势为60.67％，经贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂处理的高粱种子发芽势为65.33％，与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂处理的高粱种子发芽势增长了7.68％。对照组高粱的发芽率为64.67％，经贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂处理的高粱种子发芽率为69.33％，与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂处理的高粱种子发芽势增长了7.21％。

本发明的实施案例4：贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂对高粱生长的影响

具体步骤：

(1)种子催芽

按照本发明的实施案例3(1)种子预处理中的步骤对高粱种子进行预处理，将高粱种子平铺在水琼脂平板上，28℃倒置培养24～36h。

(2)高粱种植

将珍珠岩和蛭石按照1:4的比例混合均匀，装在花盆(高度17.5cm×底径11.5cm×口径16.5cm)中，121℃灭菌30min。将发芽的高粱种子均匀种植在花盆中，每盆种植的高粱种子为20～25颗。

(4)接种贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂

吸取贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂，接种到高粱幼苗根部，每个花盆的接种量为10mL贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂。

(5)取样

接种30天后，用镊子将高粱幼苗从基质中挖出来，抖掉高粱根上附着的基质，用流水冲洗干净。测定高粱植株的株高、根长、干重、全氮、全磷以及基质有效氮、有效磷等指标。将高粱植株用液氮速冻后，送至深圳微科盟科技集团有限公司进行植物代谢组测定。

(6)实验结果

①贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂对高粱生物量的影响

分别从对照组和实验组中选取30棵高粱幼苗，测量幼苗的株高和根长。对照组高粱的平均株高为15.89cm，实验组高粱的平均株高为16.05cm，与对照组相比，实验组高粱的株高增加了1％。对照组高粱的平均根长为15.79cm，实验组高粱的平均根长为15.93cm，与对照组相比，实验组高粱的根长增加了0.88％。

分别从对照组和实验组中选取10棵高粱幼苗，用锡纸包裹后，放入烘箱中，70℃烘干至恒重，做三个重复。对照组高粱的平均干重为0.412g/10株，实验组高粱的平均干重为0.644g/10株，与对照组相比，实验组高粱的干重增加了56.3％。

②贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂对营养元素的影响

对照组高粱的全氮含量为17.1321g/kg植株，实验组高粱的全氮含量为19.5014g/kg，与对照组相比，实验组高粱的全氮含量增加了13.83％。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂促进了高粱对氮素的吸收。

对照组高粱的全磷含量为6.2522g/kg植株，实验组高粱的全磷含量为6.7624g/kg，与对照组相比，实验组高粱的全磷含量增加了8.16％。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂促进了高粱对磷素的吸收。

③植物代谢组

含量排名前20的代谢物

如图2所示，接种贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂30天后处理红缨子高粱植株与空白组红缨子高粱植株中含量最高的20种代谢产物分别为：磁性(MAG(18:3))、异阿魏酸(Isoferulic acid)、1H-茚-3-甲酰胺(1H-indene-3-carboxamide)、DL-色氨酸(DL-Tryptophan)、软脂酸(Palmitic Acid)、吲哚-3-丙烯酸(Indole-3-acrylic acid)、黄豆苷元(Daidzein)、白屈菜酸(Chelidonic acid)、胆碱(Choline)、毛地黄黄酮(Luteolin)、甜菜碱(Betaine)、紫杉叶素(Taxifolin)、去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiareticacid)、l-酪氨酸(L-Tyrosine)、芒柄花素(Formononetin)、2-羟基肉桂酸(2-Hydroxycinnamic acid)、腺苷(Adenosine)、水苏碱(Stachydrine)、苯乙醛酸(Phenylglyoxylic acid)乳糖(Lactose)。其中，空白组和实验组的苯乙醛酸(Phenylglyoxylic acid)、芒柄花素(Formononetin)、棕榈酸(Palmitic Acid)、腺苷(Adenosine)、1H-茚-3-甲酰胺(1H-indene-3-carboxamide)的含量在20种代谢产物中均最高。

差异代谢物

如图3所示，接种贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂30天后的产物校正后P值小于0.05，V-IP大于1的代谢物有27种，它们有4-甲硫基-2-氧丁酸钠(alpha-Keto-gamma-(methylthio)butyric acid)、1-肉豆蔻基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇(Lysope14:0)、尿酸(Uricacid)、脂肪酸乙醇酰胺(Linoleoyl Ethanolamide)、对甲氧基苯甲醛(p-Anisaldehyde)等。

差异代谢物显著富集的代谢通路

如附图4所示，接种贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂30天后的代谢途径有：糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(Valine,leucine andisoleucine degradation)、氰基氨基酸代谢(Cyanoamino acid metabolism)、氨基酰-tRNA生物合成(Aminoacy-tRNA biosynthesis)、核苷酸代谢(Nucleotide metabolism)、类苯丙酸生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism)等。

在高粱幼苗根部接种所述贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂30天后，在对照组和实验组的高粱代谢组中，有4-甲硫基-2-氧丁酸钠等27种代谢物的含量存在显著性差异。差异代谢物富集的代谢通路主要为糖酵解/糖异生、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、氰基氨基酸代谢、氨基酰-tRNA生物合成、核苷酸代谢、类苯丙酸生物合成和嘧啶代谢通路等。

综上所述，本发明所述具有铁载体产生功能的贝莱斯芽孢杆菌GH9菌剂能够促进高粱种子萌发和高粱生长，其促进机制主要为调节高粱的氨基酸代谢等代谢途径并促进高粱对氮素和磷素的吸收。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。