一种草酸青霉原生质体的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种草酸青霉原生质体制备方法。

背景技术

草酸青霉

原生质体指细胞通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质，包括细胞膜、细胞质和细胞核，换言之原生质体就是除去细胞壁的被细胞膜包围的“裸露细胞”。真菌原生质体由于失去了细胞壁的包被，使其更易接受外源DNA等物质，是进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作等方面的研究的理想材料。

丝状真菌高效遗传转化体系的构建一般通过农杆菌介导或者聚乙二醇/CaCl

综上，如何提供一种操作简单、成本低、可重复性好、制备原生质体活力高的草酸青霉原生质体制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种草酸青霉原生质体制备方法。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种草酸青霉原生质体制备方法，包括以下步骤：

（1）菌株活化；

（2）孢子悬浮液的制备：将活化好的草酸青霉SG-4接种到PDA斜面培养基上，培养后收集孢子并制备成孢子悬浮液；

（3）将所述孢子悬浮液涂布于贴合PDA培养基的玻璃纸上，待孢子萌发并培养适当时间；

（4）使用转化溶液I溶解溶壁酶配制所需的裂解酶液I，利用裂解酶液I裂解玻璃纸上的菌丝体；

（5）以渗透压缓冲液溶解纤维素酶配制所需的裂解酶液Ⅱ，利用裂解酶液Ⅱ继续裂解菌丝体；

（6）过滤裂解后菌丝溶液；

（7）离心并去上清收集原生质体；

作为一个实施方案，步骤（1）中菌株活化：将在-80℃条件下保存的草酸青霉SG-4菌株接种到PDA培养基，28℃条件下黑暗培养4d。

作为一个实施方案，步骤（2）中培养条件为28℃黑暗培养4d。

作为一个实施方案，步骤（2）中制备的孢子悬浮液的浓度为1×10

作为一个实施方案，步骤（3）中，使用制备好的孢子悬浮液涂布于灭菌的紧贴PDA培养基的玻璃纸上，菌丝体培养条件为28℃黑暗培养12h。

作为一个实施方案，步骤（4）中转化溶液I是利用D-山梨醇 109.3 g，磷酸二氢钾6.8 g配制成pH 5.6的500 mL 转化溶液I，裂解酶液I是利用转化溶液I溶解溶壁酶（质量浓度为3‰）配制而成。

作为一个实施方案，步骤（4）中，向灭菌的空玻璃皿中加入裂解酶液I，然后加入一张长有菌丝体的玻璃纸，每张带有菌丝体的玻璃纸对应使用3mL裂解酶液I。菌丝体裂解条件为30℃裂解2h。

作为一个实施方案，步骤（5）中，渗透压缓冲液是浓度为1M的山梨醇溶液，裂解酶液Ⅱ是利用预冷的渗透压缓冲液溶解纤维素酶（m/v，2‰）配制而成。

作为一个实施方案，步骤（5）中，菌丝体酶解混合液中加入预冷的裂解酶液Ⅱ，裂解条件为30℃30min。

作为一个实施方案，步骤（6）中，使用灭菌后的三层擦镜纸对菌丝体酶解混合液进行过滤。

三层擦镜纸能将原生质体和未被充分裂解的菌丝体和草酸青霉的孢子过滤分离，得到原生质体溶液。

作为一个实施方案，步骤（7）中，首次离心条件为4℃下2500rpm离心10min，离心完成后操作都于冰上进行，去上清后加入预冷的转化溶液Ⅱ，进行第二次离心，条件为4℃下2500rpm离心5min，去上清收集原生质体。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果有：

1)本发明利用新鲜的孢子悬浮液进行菌丝体的培养，利用培养一定时间的幼嫩的菌丝体为材料，节省菌丝体的酶解时间；

2）本发明考虑到草酸青霉是一种真菌，真菌细胞壁的主要组成成分是几丁质和纤维素，于是选用溶壁酶裂解草酸青霉的细胞壁（溶壁酶是细胞溶解酶的简称，对大多数真菌都有很好的脱壁效果，对担子菌和子囊菌效果最好，而草酸青霉属于子囊菌），在纤维素酶的辅助下，进行菌丝体的分步酶解。与其他混合酶系的组合相比，在节省制备原生质体时间的同时能更好的掌握菌丝体裂解的程度，能较容易、可重复地获取优质且数量足够的原生质体；

3）本发明通过不同的酶解时间、不同的混合酶系以及是否采用分步酶解的对照组合探索了制备原生质体的效果，建立了高效的草酸青霉原生质体制备体系；该体系酶解效率高且能够获得优质足够的草酸青霉原生质体；

4）本发明利用灭菌的擦镜纸来过滤收集原生质体，去除了未裂解完成的细胞和草酸青霉孢子以及破碎的细胞碎片，分离纯化后的原生质体细胞完整，呈球形，活力良好。

5）本发明通过在冰上处理离心纯化后的原生质体，温度适合保存草酸青霉，使得原生质体存活率提高。

6）在本发明的基础上，可进行原生质体培养、遗传转化等操作，对草酸青霉遗传转化体系的建立以及基因功能的研究具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明中的实施方案，通过以下附图对非限制性实施例或现有技术中的技术方案进行详细描述，本发明的特征、目的与优点将会表现的更清楚。

图1为实施例1中裂解酶液I裂解玻璃纸上的菌丝体的初始状态；

由图1可以明显观察到幼嫩的菌丝体，利用此状态的菌丝体进行裂解，菌丝体的细胞壁也较为幼嫩，裂解效率高；

图2为实施例1中最优条件下制备的草酸青霉的原生质体；

在菌丝体培养时间一定的条件下，利用裂解酶液Ⅰ裂解时间为2h 时最有利于原生质体的制备，原生质体的数量足够且原生质体均一分散，形态良好。

图3为酶解时间对原生质体再生率的影响。

图4酶解时间对原生质体再生率的影响。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地详细说明。以下实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，同时实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在不脱离本发明构思的前提下，做出的若干调整和改进，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用试剂与药品为常规实验用品，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

（1）菌株活化：将在-80℃条件下保存的草酸青霉SG-4菌株接种到PDA培养基，28℃条件下黑暗培养4d，本步骤及以下操作均在超净台进行；

（2）孢子悬浮液的制备：将步骤（1）中活化好的草酸青霉SG-4接种到PDA斜面培养基上，28℃条件下黑暗培养4d培养后用无菌水将孢子洗下并制备成浓度为1×10

（3）将步骤（2）中获取的新鲜孢子悬浮液涂布100μL于贴合PDA培养基的玻璃纸上，此类玻璃纸一次实验使用10张，28℃条件下黑暗培养12h；

（4）使用转化溶液I溶解溶壁酶配制所需的裂解酶液I：利用D-山梨醇 109.3 g，磷酸二氢钾 6.8 g配制成pH 5.6的500 mL 转化溶液I，裂解酶液I是利用转化溶液I溶解溶壁酶（质量浓度为3‰）配制而成；利用裂解酶液I裂解玻璃纸上的菌丝体：向灭菌的空玻璃皿中加入裂解酶液I，按照每张带有菌丝体的玻璃纸使用3mL裂解酶液，将步骤（3）中长有菌丝体的玻璃纸放入装有裂解酶液I的空平板中。最后，将裂解酶液中的玻璃纸之间的气泡赶出，使菌丝与裂解酶液充分接触，以达到良好的裂解效果。在30℃条件下裂解，酶解时间设置为1、1.5、2、2.5、3h；此时裂解结束后镜检，可以观察到有未裂解的菌丝体以及细胞碎片；

（5）以渗透压缓冲液溶解纤维素酶配制所需的裂解酶液Ⅱ：渗透压缓冲液是浓度为1M的山梨醇溶液，裂解酶液Ⅱ是利用预冷的10mL渗透压缓冲液溶解20mg纤维素酶（m/v，2‰）配制而成；利用裂解酶液Ⅱ继续裂解菌丝体：向步骤（5）中的菌丝体酶解混合液中加入预冷的裂解酶液Ⅱ，继续在30℃条件下裂解30min；

此时裂解结束后镜检，可以观察到少量的原生质体和细胞碎片；

（6）过滤裂解后菌丝溶液：使用灭菌后的三层擦镜纸对步骤（5）中的菌丝体酶解混合液进行过滤，用预冷的50mL离心管收集原生质体滤液；

（7）离心并去上清收集原生质体：将步骤（6）中收集到的原生质体滤液进行离心，首次离心条件为4℃下2500rpm离心10min，离心完成后操作都于冰上进行，去上清后加入4mL预冷的转化溶液Ⅱ将原生质体重悬，目的是漂洗原生质体去除裂解酶液。然后进行第二次离心，条件为4℃下2500rpm离心5min，最后去上清，剩余200μL，轻轻混匀并收集原生质体。此时进行镜检，由于经过分离纯化，可以观察到数量足够的原生质体，无细胞碎片和菌丝体。

表1酶解时间对原生质体产量的影响

由表1结果可知，酶解2h，原生质体产量最高，原生质体数量达到2.4×10

图1附图为实施例1中裂解酶液I裂解玻璃纸上的菌丝体的初始状态；

由图1附图可以明显观察到幼嫩的菌丝体，利用此状态的菌丝体进行裂解，菌丝体的细胞壁也较为幼嫩，裂解效率高。

图2附图为实施例1中最优条件下制备的草酸青霉的原生质体。

在菌丝体培养时间一定的条件下，利用裂解酶液Ⅰ裂解时间为2h 时最有利于原生质体的制备，原生质体的数量足够且原生质体均一分散，形态良好。

图3为酶解时间对原生质体再生率的影响，由图3结果可知，随着酶解时间的加长，原生质体的再生率降低，原因是裂解酶液中的蛋白酶会对原生质体膜造成不可逆的损伤，影响其细胞稳定性导致原始字体破裂死亡。

对比案例1

（1）菌株活化：将在-80℃条件下保存的草酸青霉SG-4菌株接种到PDA培养基，28℃条件下黑暗培养4d，本步骤及以下操作均在超净台进行；

（2）孢子悬浮液的制备：将步骤（1）中活化好的草酸青霉SG-4接种到PDA斜面培养基上，28℃条件下黑暗培养4d培养后用无菌水将孢子洗下并制备成浓度为1×10

（3）将步骤（2）中获取的新鲜孢子悬浮液取2 mL接种于200 mL CM液体培养基中，28℃，180 rpm培养至孢子萌发的菌丝长度为孢子直径4-5倍时为宜，28℃条件下黑暗培养10、12、14、16h。其中CM培养基（1.0 L）：分别量取50.0 mL 20×硝酸盐溶液、1.0 mL微量元素混合溶液和分别称取10.0 g葡萄糖、2.0 g蛋白胨、1.0 g酵母提取物、1.0 g酸水解酪蛋白溶于去离子水中，混匀后调pH至6.5，定容至1.0 L，115℃，灭菌25 min；

（4）将CM混合液收集至4个无菌的50 mL离心管中，4℃，4500 rpm，离心20 min；

（5）弃上清，加入30 mL灭菌水，充分混匀后 4℃，4500 rpm，离心15 min，弃上清，重复步骤5操作一次

（6）配制细胞壁酶解液：分别称取0.2 g溶菌酶Lysozyme、0.3 g裂解酶PectinLyase、0.3 g蜗牛酶Snailase溶于 50.0 mL OM缓冲液（pH 5.8）中，于28℃，180 rpm充分混匀后4℃，4500 rpm离心30 min，取上清液过滤除菌后待用。磷酸盐缓冲液（0.5 L）：称取147.6g七水硫酸镁、0.6 g磷酸二氢钠溶于去离子水后 混匀，用1 M磷酸氢二钠溶液调pH至5.8，定容至0.5 L后121℃，灭菌20 min；

（7）向步骤4得到的沉淀中加入50 mL步骤6现处理好的酶解液，充分打散混匀后于28℃，180 rpm，反应3 h，镜检至菌丝体胞壁完全降解变成一个个细胞膜包裹的圆球后，将50 mL含原生质体的酶解液平均分装于4个无菌50 mL离心管中，将其 置于冰上并沿管壁缓慢地滴加2倍体积的Trapping缓冲液，于4℃，3500 rpm，离心30 min，至此以下步骤全在冰上操作。Trapping缓冲液（0.5 L）：称取36.4 g山梨醇、6.1 g Tris溶于去离子水后混匀，用 稀盐酸溶液调pH至7.0，定容至0.5 L后121℃，灭菌20 min，后于4℃保存备用；

（8）离心后可见到分层，用无菌巴氏吸管小心地从两层液面交界处吸取中层的无杂质原生质体溶液至新的无菌50 mL离心管中；

（9）向所得的原生质体溶液中加入2倍体积的1 M山梨醇溶液，用巴氏吸管轻轻吸打混匀，漂洗原生质体，于4℃，3500 rpm，离心10 min；弃上清，加入适量1 M山梨醇溶液继续漂洗一次；

（10）弃上清，加入适量 STC溶液漂洗原生质体2次并轻轻吸打混匀，每次于4℃，3500 rpm，离心10 min。STC溶液（0.5 L）：称取91.1 g山梨醇、6.1 g Tris、5.6 g氯化钙溶于去离子水后混 匀，用稀盐酸溶液调pH至8.0，定容至0.5 L后121℃，灭菌20 min，后于4℃保存备用。尽量弃除多余的上清液，加入适量的（使最后每管的原生质体量约为1×10

表2菌龄对草酸青霉原生质体产量的影响

对比案例1中使用实验方法为三种酶组合的混合酶系裂解菌丝体，以此获取原生质体。结果显示菌丝体培养时间12h时原生质体产量最高，为0.3×10

对比案例2

（1）菌株活化：将在-80℃条件下保存的草酸青霉SG-4菌株接种到PDA培养基，28℃条件下黑暗培养4d，本步骤及以下操作均在超净台进行；

（2）孢子悬浮液的制备：将步骤（1）中活化好的草酸青霉SG-4接种到PDA斜面培养基上，28℃条件下黑暗培养4d培养后用无菌水将孢子洗下并制备成浓度为1×10

（3）将步骤（2）中获取的新鲜孢子悬浮液涂布100μL于贴合PDA培养基的玻璃纸上，此类玻璃纸一次实验使用10张，28℃条件下黑暗培养12h；

（4）使用转化溶液I溶解溶壁酶及纤维素酶配制所需的裂解酶液：利用D-山梨醇109.3 g，磷酸二氢钾 6.8 g配制成pH5.6的500 mL 转化溶液I，裂解酶液是利用转化溶液I溶解溶壁酶（质量浓度为3‰）和纤维素酶（质量浓度为2‰）配制而成；利用裂解酶液裂解玻璃纸上的菌丝体：向灭菌的空玻璃皿中加入裂解酶液，按照每张带有菌丝体的玻璃纸使用3mL裂解酶液，将步骤（3）中长有菌丝体的玻璃纸放入装有裂解酶液的空平板中。最后，将裂解酶液中的玻璃纸之间的气泡赶出，使菌丝与裂解酶液充分接触，以达到良好的裂解效果。在30℃条件下裂解，酶解时间设置为1、1.5、2、2.5、3h；

（5）过滤裂解后菌丝溶液：使用灭菌后的三层擦镜纸对步骤（4）中的菌丝体酶解混合液进行过滤，用预冷的50mL离心管收集原生质体滤液；

（6）离心并去上清收集原生质体：将步骤（5）中收集到的原生质体滤液进行离心，首次离心条件为4℃下2500rpm离心10min，离心完成后操作都于冰上进行，去上清后加入4mL预冷的转化溶液Ⅱ将原生质体重悬，目的是漂洗原生质体去除裂解酶液。然后进行第二次离心，条件为4℃下2500rpm离心5min，最后去上清，剩余200μL，轻轻混匀并收集原生质体。

表3酶解时间对原生质体产量的影响

由表3结果可知，使用溶壁酶和纤维素酶混合进行酶解1h时，原生质体产量最高，原生质体数量达到0.6×10

图4酶解时间对原生质体再生率的影响。利用培养一定时间的幼嫩的菌丝体为材料，在此状态下裂解菌丝体的细胞壁可以节省菌丝体的酶解时间；在制备草酸青霉原生质体时，由于真菌细胞壁的主要组成成分是几丁质和纤维素，所以选用溶壁酶和纤维素酶的组合；利用预冷的离心管盛放原生质体滤液以及在冰上处理离心纯化后的草酸青霉原生质体，都是由于此温度适合保存草酸青霉的原生质体，使得原生质体存活率提高。

实施例1和对比案例1的结果对比显示，利用灭菌的擦镜纸来过滤收集原生质体，去除了细胞壁未裂解完全的细胞和草酸青霉孢子以及破碎的细胞碎片，分离纯化后的原生质体细胞完整，呈球形，活力良好，同时制备草酸青霉原生质体使，使用分步酶解法相比于混合酶系酶解菌丝体具有可重复性好、较容易操作，原生质体产量高的优点。

由实施例1和对比案例2的结果对比显示，使用分步酶解法获取原生质体可以很好的控制菌丝体的裂解过程，显著提高原生质体的产率；同时在原生质体的质量方面，实施例1和对比案例2的结果显示，在使用的酶的组合一定的情况下，分步酶解制备的原生质体活力即再生率较高。

以上对本发明公开的具体实施例进行了描述，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。需要理解的是，本发明并不限制于以上所述的特定实施方式，本领域技术人员在权利要求的范围内做出各种变形或修改并不影响本发明的实质内容。