一种无饲养层体外高效扩增NK细胞培养基及其方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种无饲养层体外高效扩增NK细胞培养基及其方法。

背景技术

NK细胞，即自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。自然杀伤细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，由于NK细胞的杀伤活性无主要组织相容性复合体(MHC)限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤细胞。

以NK细胞为基础的过继性免疫治疗是一种细胞生物治疗方法，通过向肿瘤患者回输经体外诱导培养的NK细胞，使其在机体中发挥直接或间接杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。以NK细胞为基础的过继性免疫治疗需要大量的细胞，其应用范围为患者每公斤体重需1E6～8E7CD3-CD56+NK细胞，一个80kg的成人需要至少8E7 NK细胞，并需多次回输。此外，NK细胞在外周血中所占比例很低(5～15％)，因此在用于过继性免疫治疗之前，有必要对其进行扩增。

NK细胞的“动态平衡”主要受细胞表面多种受体蛋白的调控，包括NK细胞活化受体(KAR)和抑制受体(KIR)。NK细胞的活化状态，执行细胞的脱粒、细胞因子释放和细胞杀伤功能是抑制信号和活化信号综合的结果。NK细胞活化受体包括NKG2D(CD314)、CD16、NKp30(CD337)、NKp44(CD336)和NKp46(CD335)等。现有技术中有采用抗NKp46(CD335)和/或抗CD16用于NK细胞的体外增殖培养的活化激活。

目前，已经报道了多种体外扩增NK细胞的方法，从而达到更高的细胞治疗剂量，并增强活性和体内增殖潜力。例如滋养层法和因子法，滋养层法是加入肿瘤细胞系，如K562细胞等，其释放的外泌体可促进正常的造血干细胞转化，从而刺激NK细胞的增殖，但可能在NK回输治疗过程中导致肿瘤细胞发生的风险；因子法是加入促进NK细胞分化及增殖的相关因子，如白介素-2(IL-2)、白介素15(IL-15)等，可增强NK细胞活性，维持NK细胞长期生长，且不引入风险，安全性较高。

NK细胞具有抗肿瘤作用，在临床应用上越来越受到重视。临床应用回输时，NK细胞需要达到一定量的细胞数和较高的细胞纯度，因此在体外扩增脐血NK细胞时如何获得更高的细胞治疗剂量和较高的纯度成为肿瘤治疗的关键。

目前NK细胞临床试验大多数还处于比较早期的阶段，未来需要在现有技术的基础上，不断提高NK细胞治疗的有效性和安全性，优化生产工艺，降低成本，缩短生产周期，扩大治疗范围。因此，进一步研究一种耗时短、易制备、低成本的体外NK细胞扩增的培养基和培养方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无饲养层体外高效扩增NK细胞培养基及其方法。

本发明提供了一种NK细胞体外扩增培养基，所述培养基包含NK包被液、NK刺激培养基、NK扩增培养基；

所述包被液的组分为：终浓度为0.1ug/ml-10ug/ml的anti-NKp46抗体，终浓度为0.1ug/ml-10ug/ml的anti-CD16抗体，终浓度为0.1ug/ml-10ug/ml的anti-NKG2D抗体，0.1ug/ml-10ug/ml anti-CD137抗体中的任意两种或以上；其余为DPBS磷酸缓冲液；

所述NK刺激培养基的组分为：终浓度为200-2000IU/ml的IL-2；终浓度为10-500ng/ml的IL-18；终浓度为10-500ng/ml的IL-15；终浓度为10-500ng/ml的IL-21；终浓度为100-500ng/ml的IFN-γ；谷氨酰胺含量为1％，其余为NK无血清基础培养基；

扩增培养基的组分为：终浓度为200-2000IU/ml的IL-2；其余为NK无血清基础培养基。

进一步地，所述NK包被液的组分为：终浓度为5ug/ml的anti-CD16抗体和终浓度为3ug/ml的anti-NKG2D抗体，其余为DPBS磷酸缓冲液。

进一步地，所述NK刺激培养基的组分为：终浓度为1000IU/ml的IL-2；终浓度为10ng/ml的IL-18；终浓度为10ng/ml的IL-15；终浓度为10ng/ml的IL-21；终浓度为100ng/ml的IFN-γ；谷氨酰胺含量为1％，其余为NK无血清基础培养基。

进一步地，

体外扩增培养基所述NK扩增培养基的组分为：终浓度为800IU/ml的IL-2；其余为NK无血清基础培养基。

本发明还提供了一种应用上述NK细胞体外扩增培养基的NK细胞扩增培养方法，所述的培养方法步骤包括如下步骤：

1)采血，分离人外周血单个核细胞，或者使用冻存外周血单个核细胞；

2)将所述分选的NK细胞群置于预先被上述的NK包被液包被1-2天的培养器中接种外周血单个核细胞，接种量为0.5E6/mL-4E6/mL，添加NK刺激培养基培养4-7天，得激活的NK细胞群；

3)将所述激活的NK细胞群置于上述扩增培养基培养12-18天，即得。

进一步地，步骤2)中包被天数为1天，NK刺激培养基培养天数为5天；所述外周血单个核细胞接种量为2E6/mL。

进一步地，步骤3)中培养天数为16天。

进一步地，步骤2)中，刺激方法为：接种当天记为第0天，从第3天开始，每1-2天补加上述的NK刺激培养基0.5～1倍，控制NK细胞密度在0.5～4E6/mL之间；优选培养5天。

进一步地，步骤3)中，培养第6天将细胞取出离心，用NK扩增培养基重悬使细胞浓度维持在0.8E6/mL-1E6/mL，后每隔1天对细胞进行计数并补加NK扩增培养基使细胞浓度维持在0.8E6/mL-1E6/mL。

实验结果表明，本发明提供了一种无饲养层体外高效扩增NK细胞培养基及其方法。本发明培养方法采用NK特异活化受体的单抗包被以刺激NK细胞，经过刺激和扩增阶段，培养至21天，本发明的NK细胞总数量扩增至5.7E9，扩增倍数为1439倍。本发明在扩增阶段更低浓度的IL-2，降低成本同时满足大规模扩增NK的需求。本发明无需分选，用全部的单个核细胞进行培养，简化操作的程序；本发明无需饲养层细胞、血清以及血替代，规避了饲养层细胞和外来血带来的风险，安全性能高。本发明过程操作简单，成本低，简便了实验流程，同时还获得大量的NK细胞。本发明实现了体外高效扩增培养，便于满足临床使用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1和对照例1的CD3/CD56流式结果图；

图2为实施例1和对照例1的NK细胞的扩增总数(图2A)和扩增倍数折线图(图2B)。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

anti-NKG2D抗体，NK细胞受体2D，一种在人类天然杀伤细胞、CD56+和CD8+T细胞表面表达的激活性受体，购买自近岸生物有限公司。

anti-CD16抗体属于Ig超家族成员，购买自瑞德有限公司RD。

NK无血清基础培养基，购买自杭州中赢，货号货号ZY-NKJ-1000。

本发明表示细胞密度时使用的指数方式计数法，如细胞密度在5E7/ml时表示细胞密度在5*10

实施例1、本发明无饲养层体外高效扩增NK细胞培养基

一、实验方法(一)首先配制NK包被液、NK刺激培养基和NK扩增培养基

1、包被液：

包被液包含两种抗体，分别是终浓度为5ug/ml的anti-CD16抗体NKp46和终浓度为3ug/ml的anti-NKG2D抗体，溶剂为DPBS磷酸缓冲液。

2、刺激培养基：

在NK无血清基础培养基中，加入终浓度为1000IU/ml的IL-2、终浓度为10ng/ml的IL-18、终浓度为10ng/ml的IL-15、终浓度为10ng/ml的IL-21、终浓度为100ng/ml的IFN-γ，同时保持谷氨酰胺含量为1％。

3、扩增培养基：

在NK无血清基础培养基中加入IL-2，使IL-2终浓度达到800IU/ml。

(二)实验步骤

1、分离外周血PBMC及冻存

将新鲜采集的外周血(健康的志愿者提供)置于含无菌肝素钠得采血管中，按照1：1的比例将全血缓慢加入到淋巴分离液中，利用密度梯度离心的方法进行PBMC的分离，尽量保证分层清晰。分离后，吸取白膜层，收集单个核细胞PBMC，使用红细胞裂解液重悬细胞，轻柔混匀，去除PBMC中残留的红细胞。处理后的PBMC按照5E7/ml的密度进行冻存。

2、包被阶段

提前一天使用包被液包被孔板在4℃包被1天；

3、刺激阶段

复苏冻存的PBMC，细胞计数后调整细胞密度为2E6/mL。将PBMC细胞加入到预先用实施例1NK包被液包被的孔板中，接种体积为2mL。在37℃、5％CO

4、扩增阶段

第6天将细胞取出离心，用扩增培养基重悬，接种于新的培养瓶中，至细胞浓度为0.8E6/mL-1E6/mL。从第6天开始，隔1天对细胞进行计数并补加扩增培养基使细胞浓度维持在0.8E6/mL-1E6/mL。

扩增阶段共培养16天。

对照例1、仅使用扩增培养基培养NK细胞

一、实验方法

(一)首先配制NK扩增培养基

在NK无血清基础培养基中加入IL-2，使IL-2终浓度达到800IU/ml。

(二)实验步骤

1、分离外周血PBMC及冻存

同实施例1中分离外周血PBMC及冻存的内容。

2、扩增阶段

复苏冻存的PBMC，细胞计数后调整细胞密度为2E6/mL，接种体积为2mL，在37℃、5％CO

实验例1、本发明培养方法NK细胞培养倍数

1、实验方法

(1)细胞流式检测

培养第21天，通过流式细胞仪对实施例1和对照例1进行检测，测量其NK(CD3-CD56+)细胞纯度。

(2)NK细胞扩增倍数和扩增总数检测

通过通过countstar细胞计数仪检测实施例1和对照例1NK细胞扩增倍数和扩增总数。

2、实验结果

(1)细胞流式检测结果

实施例1和对照例1的CD3/CD56流式结果图(横坐标表示CD56，纵坐标表示CD3),对照例1的NK(CD3-CD56+)细胞纯度结果为46.8，实施例1的NK(CD3-CD56+)细胞纯度结果为79.4％。

实验结果表明，本发明培养方法，可以提升NK细胞纯度，且NK细胞浓度达到79.4％。

(2)扩增总数和扩增倍数检测结果

实施例1和对照例1的NK细胞的扩增总数和扩增倍数折线图如图2所示，从图2A可以看出，总培养时间21天时，实施例1NK细胞总数量扩增至5.7E9，扩增倍数为1439倍，显著高于对照例1。

本发明提供了一种无饲养层体外高效扩增NK细胞培养基及其方法。本发明培养方法采用NK特异活化受体的单抗包被以刺激NK细胞，经过刺激和扩增阶段，培养至21天，本发明的NK细胞总数量扩增至5.7E9，扩增倍数为1439倍。本发明在扩增阶段更低浓度的IL-2，降低成本同时满足大规模扩增NK的需求。本发明无需分选，用全部的单个核细胞进行培养，简化操作的程序；本发明无需饲养层细胞、血清以及血替代，规避了饲养层细胞和外来血带来的风险，安全性能高。本发明过程操作简单，成本低，简便了实验流程，同时还获得大量的NK细胞。本发明实现了体外高效扩增培养，便于满足临床使用。