一株发酵产高透明型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株发酵产高透明型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用。

背景技术

黄原胶（Xanthan gum）是一种由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）以碳水化合物为主要原料经好氧发酵产生的一种水溶性微生物胞外多糖，又称黄胶、汉生胶，是目前世界上生产规模最大的微生物多糖。黄原胶由于其大分子特殊结构和胶体特性，具有优良的理化特性，例如悬浮性、乳化性、增稠性、假塑性、热稳定性等，可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、凝胶剂、浸润剂、膜成型剂等广泛应用于各个领域，是性能最为优越的生物胶之一。黄原胶具有长链高分子的一般性能，但它比一般高分子含有较多的官能团，在特定条件下会显示独特性能。黄原胶的分子侧链末端含有丙酮酸基团的多少，对其性能有很大影响。

国内黄原胶工业产量总值上虽具优势，但相比于国外的黄原胶工业化生产技术仍存在不足之处，比如产胶率较低、发酵所得黄原胶水溶液的透光率不理想。有国内外研究表明，通过菌种改造选育的方式提高黄原胶产品产量和质量效果最好，在工业生产上最具应用价值，黄原胶发酵工业中培养基成分的选择固然重要，但对菌种的选择同样需要慎重考虑，菌种是生物发酵产业的“芯片”，是产品产量和质量的决定性因素，能够显著影响经济效益、社会效益和生态效益。可见，寻求好的菌株，对于黄原胶工业进一步提高产胶率和发酵所得黄原胶水溶液的透光率，是极为重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一株发酵产高透明型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用，以解决现有黄原胶工业产胶率较低、发酵所得黄原胶水溶液的透光率不理想的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一株发酵产高透明型黄原胶的野油菜黄单胞菌，所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestris F417-6，并于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63459，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

更优地，其筛选过程如下：

（1）将原始Xanthomonas campestris菌的菌液解冻，用接种环蘸取菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使原始菌恢复原有活性；

（2）将活化完成的原始菌株按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；

（3）取生长至对数期的原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris菌液，用涡旋仪混匀成均一的菌悬液；将制备好的菌悬液取1mL在35mm辐照小皿中，用封口膜密封好，利用

（4）观察不同辐照剂量下菌落的形态和大小，分别挑取较大较光滑透亮的菌落点种到筛选培养基上，并进行编号，37℃恒温培养72 h；待菌落长出后，在筛选培养基上滴加卢戈氏碘液，观测菌落周围透明圈；测量菌落直径C和透明圈直径H，计算H/C值；H/C值较大的菌株接入液体培养基，温度30℃、180 r/min恒温摇床培养72 h，这些菌种为初筛菌种；

（5）将初筛菌种进行编号，培养至对数期后按10%接种量分别接入75 mL发酵培养基中，37℃、180 r/min恒温摇床培养96 h，发酵结束后，测定其产胶率和发酵产物黄原胶水溶液的透光率；比较初筛菌株的产胶率和水溶液透光率，选择最优菌株，为复筛菌株，并对复筛菌株进行遗传稳定性测试，最终选取产胶率和水溶液透光率以及遗传稳定性测试最好的菌株为目标菌株。

本发明还提供了上述野油菜黄单胞菌在作为发酵菌种发酵制备黄原胶中的应用。

具体地，上述应用包括以下步骤：

（1）菌种活化：将含有保藏编号为GDMCC NO：63459的野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使野油菜黄单胞菌恢复原有活性；

（2）液体种子培养：将活化完成的野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；

（3）发酵培养：将生长至对数期的野油菜黄单胞菌种子液以5~20%的接种量接种至发酵培养基中，发酵温度30~40℃，180 r/min摇床恒温培养96h；

（4）采用乙醇沉淀法提取发酵液中的黄原胶。

进一步地，步骤（1）中所述平板培养基包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂2%，平板培养基的pH为6.5-7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30 min，平板培养时间为72 h。

进一步地，步骤（1）和步骤（2）中，所述液体种子培养基中均包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.3%、氯化钠0.2%，液体种子培养基的pH值为7.0。

进一步地，步骤（3）中的接种量为15%。

进一步地，步骤（3）中的发酵温度为40℃。

进一步地，步骤（3）中的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且发酵培养基的pH值为7.0。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC NO：63459），黄原胶产胶率相比于原始菌株提升15%~30%，发酵所得黄原胶水溶液的透光率相比于原始菌株提升30~50%。

2、本发明对保藏编号为GDMCC NO：63459的野油菜黄单胞菌进行遗传稳定性分析，进行连续传代培养，每隔 2 次传代测定黄原胶的产胶率，可以看出，本发明提供的野油菜黄单胞菌在连续传代12次后的黄原胶产胶率和胶品质变化幅度不显著，证明其稳定性良好，可以作为工业生产菌株进行高透明型黄原胶的放大化生产。

附图说明

图 1为原始菌株的生长曲线图；

图2为原始菌株的致死率与辐照剂量的关系折线图；

图3为原始菌株的正突变率与辐照剂量的关系折线图；

图4为复筛菌株产胶率柱状分析图；

图5为复筛菌株发酵产物黄原胶水溶液的透光率柱状分析图；

图6为本发明所得野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC NO：63459）产胶率遗传稳定性柱状分析图。

具体实施方式

下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

实施例

本发明所得野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC NO：63459）通过重离子束辐照诱变技术，对出发菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris进行辐照诱变，再通过筛选选育得到。本实施例中所涉及到的实验材料均为市购，例如可溶性淀粉、葡萄糖、玉米淀粉、氯化钠购自天津市红岩化学试剂厂；蛋白胨、大豆蛋白购自广东环凯微生物科技有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾购自天津市永晟精细化工有限公司；七水硫酸镁购自天津市百世化工有限公司；牛肉膏购自北京博奥星生物技术责任有限公司。

具体的诱变技术筛选过程如下：

1、菌种培养

将原始Xanthomonas campestris菌液解冻，用接种环蘸取少量菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，接种至液体种子培养基中，温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使其恢复原有活性。该原始菌株是从十字花科植物甘蓝叶片中分离得到。

平板培养基为可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂2%，平板培养基的pH为6.5-7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30 min。

2、液体种子培养

将活化完成的原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养。

液体种子培养基为可溶性淀粉2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.3%、氯化钠0.2%。种子液培养基的pH为7.0。装液量为100mL/250mL。

3、生长曲线测定

将重复传代2-3次的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris菌液按1%接种量接种到100 ml液体种子培养基中，温度30℃，180 r/min摇床恒温培养，测定接种0 h的种子培养基在600 nm波长处的吸光值，后续每隔2 h取一次样，测定原始菌株Xanthomonascampestris在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、54 h、60 h和72 h的OD

野油菜黄单胞菌属于革兰氏阴性病原菌，专性好氧，通常为杆状，带有一根极性鞭毛，适宜生长温度区间在25-30℃，野油菜黄单胞菌分泌的胞外多糖被称为黄原胶，是一种性能优越的生物胶，能够广泛应用于多个行业，市场前景巨大。原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的发酵周期大致为36-72 h，在 36 h之前主要是菌体的生长和富集，在36 h之后进入产胶期。原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在液体培养基中的生长曲线如图1所示。由图可知，原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris的生长曲线符合“S”型曲线，符合微生物正常生长繁殖的特征。在0-8 h为菌种的生长延迟期，在 8-24 h内菌种以指数形式迅速增长，在24 h时OD

4、重离子辐照诱变

取生长至对数期的原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris菌液，用涡旋仪混匀成均一的菌悬液。将制备好的菌悬液取1mL在35mm辐照小皿中，用封口膜密封好，利用兰州重离子诱变研究装置（HIRFL）产生的

5、计算致死率

将辐照剂量为0 Gy、20 Gy、40 Gy、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy、140 Gy、160 Gy、180 Gy、200 Gy的菌液进行梯度稀释后取40 μL菌悬液涂布在固体培养基上，37℃、180 r/min恒温摇床培养96 h，每组3个平行实验，然后记录不同辐照剂量时平板上的活菌数量，辐照后的菌落数除以空白对照的菌落数，计算得到致死率，以辐照剂量为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。

本试验重离子束流控制在稳定范围内，以相对辐照剂量为横坐标，致死率为纵坐标，计算致死率，制作致死率曲线，不同辐照剂量下原始菌株Xanthomonas campestris的致死率如表 1和图 2 所示。由图2可以看出，在

表1 致死率计算

6、计算正突变率

将不同辐照剂量下诱变处理的原始菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris菌悬液进行适当稀释，吸取0.1mL涂布于固体培养基上，37℃培养48 h，观察不同辐照剂量下菌落的形态和大小，分别挑取较大的菌落点种到筛选培养基上，37℃恒温培养72 h。待菌落长出后，在筛选培养基上滴加卢戈氏碘液，观测菌落周围透明圈。测量菌落直径（C）和透明圈直径（H），按照下方的公式计算正突变率。以辐照时间为横坐标，正突变率为纵坐标，绘制正突变率曲线。选取菌落周围透明圈较大的菌株接入液体培养基，37℃、180r/min恒温摇床培养24 h后进行保存，以备下一步发酵筛选。

根据透明圈直径与菌落直径之比计算原始菌株Xanthomonas campestris诱变的正突变率，以相对辐照剂量为横坐标，正突变率为纵坐标，计算正突变率，制作正突变率曲线，不同辐照剂量下野油菜黄单胞菌的正突变率如表2和图 3所示。由图3可以看出，在

表2 正突变率计算

7、诱变菌株的初筛

观察不同辐照剂量下菌落的形态和大小，分别挑取较大较光滑透亮的菌落点种到筛选培养基上，并进行编号，37℃恒温培养72 h。待菌落长出后，在筛选培养基上滴加卢戈氏碘液，观测菌落周围透明圈。测量菌落直径（C）和透明圈直径（H），计算H/C值。H/C值较大的菌株接入液体培养基，温度30℃、180 r/min恒温摇床培养72 h，这些菌种为初筛菌种。

原始菌株Xanthomonas campestris在不同辐照剂量下挑取的菌落点种后的H/C值结果见表3所示。

表3 原始菌株

菌株F-0-1至F-0-12的H/C值为原始菌株Xanthomonas campestris的H/C值，由表3可知，原始菌株Xanthomonas campestris经重离子辐照诱变后，多数菌落的透明圈变大，H/C 值增大，说明其利用淀粉能力提高，一部分菌落的H/C值减小，为负突变，通过比较 H/C值的大小，初筛一共得到23株菌株，并按菌株辐照剂量进行命名，分别命名为F-20-1、F-20-7、F-20-12、F-40-4、F-60-5、F-60-11、F-60-12、F-80-2、F-100-11、F-120-1、F-120-4、F-140-3、F-140-12、F-160-9、F-160-11、F-180-1、F-180-5、F-180-11、F-200-3、F-200-4、F-200-5、F-200-8、F-200-12。将23株突变菌株培养至对数期，以5%的接种量接种至发酵培养基中，37℃，180 r/min摇床恒温培养96 h，测定黄原胶产胶率，将发酵产物黄原胶溶于去离子水中，配置成浓度为2.0 g/L的溶液，测定水溶液的透光率，测得的黄原胶产胶率和水溶液透光率结果如表4所示。

表4 初筛结果

8、诱变菌株的复筛

将初筛菌种进行编号，培养至对数期后按10%接种量分别接入75 mL发酵培养基中，温度37℃、180 r/min恒温摇床培养96 h，发酵结束后，测定其产胶率和发酵产物黄原胶水溶液的透光率。比较初筛菌株的产胶率和水溶液透光率，选择最优菌株，为复筛菌株，并对复筛菌株进行遗传稳定性测试。

其中菌株黄原胶的提取、产胶率和水溶液透光率的计算过程为：

黄原胶的提取：当液体种子的OD

液体发酵培养基为玉米淀粉6.0%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白2.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，液体发酵培养基的pH为7.0，装液量为75 mL/250mL。

计算产胶率：将提取的黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。

计算透光率：将发酵产物黄原胶溶于去离子水中，配置成浓度为2.0 g/L的溶液，8000 rpm离心10 min以除去气泡。以去离子水为空白对照，利用紫外可见分光光度计在600nm下测定水溶液的吸光度值，每组3个平行实验，记录数据，按照下方公式计算发酵产物黄原胶水溶液的透光率：

A——样品的吸光度；

T——样品的透光度。

经过初筛比较初筛菌株的产胶率和透光率后确定6株复筛突变菌株为F-20-12、F-40-4、F-140-3、F-160-9、F-160-11、F-180-1，通过发酵测定产胶率和透光率，结果如表5和图4、图5所示。由图4和图5可知，原始菌株Xanthomonas campestris的产胶率为3.31%，水溶液透光率为 65.87%；F-160-9的产胶率为4.20%，相比原始菌株Xanthomonas campestris提高了26.89%；水溶液透光率为98.41%，相比于原始菌株Xanthomonas campestris提高了49.40%；经过重离子辐照诱变后野油菜黄单胞菌的黄原胶产胶率和水溶液透光率显著提高，与初筛结果相比，H/C值与黄原胶产胶率有一定的正相关性，说明初筛结果可靠。通过对比6株复筛菌株的产胶率和透光率，最终确定F-160-9为最终筛选得到的突变菌株。说明利用重离子束对原始菌株Xanthomonas campestris提进行诱变可以得到产胶率更高、黄原胶水溶液透光率更强的生产黄原胶的诱变菌株，经重离子辐照诱变再进行培养的诱变菌株发生正突变。对突变菌株F-160-9进行保藏，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris F-160-9的分类学名称为Xanthomonas campestris，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63459，保藏日期为2023年05月12日。

表5 复筛结果

9、遗传稳定性测定

对筛选到的诱变菌株进行遗传性能稳定性测试，在相同的培养条件下连续传代培养12次，观察其传代后的黄原胶产胶率和水溶液透光率，确定其是否具有遗传稳定性。

相同条件下将突变菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris（保藏编号为GDMCC NO：63459）连续传代12次，每隔两代接种至液体发酵培养基中，测定产胶率（图6）和黄原胶水溶液透光率（表6），并且在标准偏差的分析下，其产胶率和透光率的差异不大。说明这株高产菌株野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris遗传性能稳定，本实验采用重离子诱变的物理诱变手段进行人工育种，可以得到性能稳定、不易发生恢复的突变菌株，可以考虑作为工业生产菌株进行高透明型黄原胶的放大化生产。

表6 透光率遗传稳定性

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。